学文网摘要：以产β-甘露聚糖酶（MAN）的枯草芽孢杆菌HD145为目的菌株，PCR扩增MAN基因片段，克隆到pHBM905A载体并转化至毕赤酵母，重组子利用甲醇进行诱导。纯化的MAN酶解槐豆胶与瓜尔豆胶，质谱检测水解产物。SDS-PAGE结果表明，MAN基因实现了表达，摇瓶酶活性为3 200 U/mL，酶最适温度与pH分别为55 ℃与6.0，pH 4～7时稳定性较好，在40、50、60 ℃的半衰期分别为165、105、42 min，Zn2+、Ag+、Co2+对酶活性存在一定的抑制。槐豆胶与瓜尔胶经MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。
关键词：甘露聚糖酶；克隆；表达；甘露寡糖
中***分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0176-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.046
甘露聚糖酶是一种内切水解酶，特异性降解β-1，4糖苷键，底物包括甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半***甘露聚糖及葡萄半***甘露聚糖等，而这些底物是组成植物半纤维素的第二大组分，所以甘露聚糖酶在饲料、畜牧生产、食品保健、造纸及纺织等领域具有很好的应用前景[1，2]。目前，国内外对甘露聚糖酶的研究主要集中在从环境中筛选产酶菌株[3，4]，对菌种进行诱导育种[5]，优化发酵产酶工艺[6，7]，将酶基因克隆在芽孢杆菌[8]、大肠杆菌[9，10]及毕赤酵母[11]中异源表达等方面。甘露寡糖是甘露聚糖酶水解以上底物产生的产物，在医药、功能性食品、保健领域表现出独特的活性，已成为研究热点[12]。能被甘露聚糖酶降解的底物来源主要有魔芋（葡甘聚糖）、田菁胶（半***甘露聚糖）、槐豆胶（半***甘露聚糖）及瓜尔胶（半***甘露聚糖）。目前，国内研究的对象主要是魔芋[13，14]，而对于槐豆胶与瓜尔胶的酶解研究相对较少。
本试验对枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶基因进行克隆并在毕赤酵母中实现可溶性表达，提高酶活性，再以槐豆胶与瓜尔胶为对象进行酶解，分析产物组分，为工业化生产甘露寡糖及寡糖的功能开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 枯草芽孢杆菌HD145与大肠杆菌XL10-Gold由湖北大学工业生物技术实验室保存。毕赤酵母GS115菌株购于美国Invitrogen公司，在pPIC9K上进行改造得到质粒pHBM905A。槐豆胶与瓜尔胶购于美国Sigma公司。
1.1.2 试剂和仪器 限制性内切酶购于宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，蛋白质标准购于上海碧云天生物公司，其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪，购于美国布鲁克道尔顿公司。
1.2 方法
1.2.1 表达载体pHBM905A-man的构建 设计引物pBS-F（GTCACATACTGTGTCGCCTGTGAATCC，下划线部分含CpoⅠ黏性末端）与pBS-R（GGCCATCACTCAACGATTGGCGTTAAAG，下划线部分含NotⅠ黏性末端），以枯草芽孢杆菌HD145总DNA为模板，进行PCR扩增（94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s ，72 ℃延伸35 s；25个循环）。扩增产物在含dTTP的体系中经T4 DNA聚合酶消化15～20 min，形成CpoⅠ与NotⅠ黏性末端，再与P.pastoris表达载体pHBM905A连接（pHBM905A预先经CpoⅠ与NotⅠ消化），重组载体记为pHBM905A-man，详细构建过程参考文献[15]。pHBM905A-man转化E. coli XL10-Gold，经菌落PCR筛选阳性转化子，并进行测序。
1.2.2 酵母转化 重组载体pHBM905A-man经SalⅠ线性化处理，电转P. pastoris GS115（7 500 V/cm， 25 lF， 400 X，Bio-Rad Gene Pulser， USA）。阳性重组子在MD培养基上经菌落PCR验证。
1.2.3 甘露聚糖酶重组表达 挑取活性高的酵母重组子，在100 mL BMGY中 28 ℃ 培养 2 d，4 ℃ 5 000 r/min离心10 min收集菌体，转入BMMY中25 ℃甲醇诱导，过程参考Pichia Expression Kit操作手册。
1.2.4 酶活性测定 甘露聚糖酶测定参考文献[16]。
1.2.5 重组酶纯化 诱导液在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，于75%硫酸铵4 ℃过夜，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀，溶解于50 mmol/L pH 6.0醋酸钠缓冲液中，转入45 cm Sephadex G-100柱（Pharmacia），收集液体，用于性质分析。
1.2.6 酶性质分析 在pH 2.0～10.0范围内，分别用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 2.0～6.0）、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0～8.0）及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 8.0～10.0）测定酶的最适反应pH；在30～90 ℃范围内，测定酶的最适反应温度。
酶pH稳定性测定：先将酶在不同的pH缓冲液中保留一定时间，再调回到最适pH，测定酶残留活性。分别在40、50、60 ℃条件下保留不同的时间，测定酶热稳定性。
金属离子对酶活性的影响：将酶在10 mmol/L不同金属离子体系（100 mmol/L醋酸钠，pH 5.5，室温） 中保留1 h，测定酶活性。
1.2.7 甘露寡糖酶解制备 分别于pH 5.0、6.0、7.0、8.0条件下，配制2%的槐豆胶及瓜尔胶底物，按底物∶酶=1∶20（质量比）添加酶液，于50 ℃反应过夜，检测酶解产物。
1.2.8 酶解产物分析 甘露寡糖酶解产物的检测应用质谱仪（Ultraflex Ⅱ MALDI-TOF/TOF，反射模式）进行分析。酶解液于12 000 r/min 4 ℃离心15 min，吸取15 μL上清液与等体积的55%乙醇混匀，从混合液中吸取5 μL再与等体积的2，5-二羟基苯甲酸基质混匀，利用质谱仪对混匀液进行分析。
2 结果与分析
2.1 目的基因扩增
以芽孢杆菌总DNA为模板，利用引物进行扩增，得到与预计大小相符，约1 011 bp的目的MAN基因片段（***1）。
2.2 重组蛋白在毕赤酵母中的表达
挑选阳性酵母重组子（pHBM905A-man）进行摇瓶表达，以不含目的基因的转化子（pHBM905A）为负对照，甲醇诱导120 h后，离心收集上清液，进行SDS-PAGE电泳检测，经考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果。如***2所示，在阳性重组子泳道约41 ku大小处有一明显条带，分子质量与预期相符，且纯度较高，而在阴性对照泳道，不含任何条带，说明目的基因实现了表达，摇瓶甘露寡糖酶活性为3 200 U/mL。
2.3 酶学特性
纯化后的重组酶最适pH与温度分别为6.0与55 ℃，在pH 4～7稳定性较好；在40、50、60 ℃的半衰期分别为165、105、42 min，如***3所示。在10 mmol/L的金属离子下，Zn2+、Co2+和Ag+对重组酶活性存在一定的抑制作用，如表1所示。
2.4 酶解产物分析
试验结果表明，槐豆胶与瓜尔胶在pH 6条件下能较好地水解，其酶解产物经离心后，上清液于质谱条件下分析，根据质核比（m/z）推测产物组分，结果如***4所示。两者都能被重组酶水解生成寡糖，槐豆胶的酶解产物组分主要是5～11糖及少量的2～4糖，瓜尔胶的酶解产物是2～11糖。
3 讨论
目前甘露聚糖酶的应用主要是通过底物诱导微生物产生，但酶活性、产量及纯度不高，不适于工业化应用，所以酶基因的克隆表达成为研究热点，而由于毕赤酵母表达系统的优点，成为表达宿主的首选，已有芽孢杆菌[11，17，18]、曲霉[14，16，19，20]、青霉[21]等不同微生物的MAN基因在毕赤酵母中实现了表达。本试验将筛选获得的枯草芽孢杆菌MAN基因克隆在毕赤酵母中，实现了高活性表达，与上述重组酶在酶活性、催化温度、pH、稳定性及金属离子影响性等方面表现出独特的性质，为工业化酶的应用提供了新的资源与选择。
关于MAN酶解槐豆胶与瓜儿胶制备甘露寡糖的研究相对较少，目前只有少量在瓜儿胶水解方面的报道[22，23]。本试验对两种底物进行酶解，为甘露聚糖酶的功能开发提供新的思路，后期对酶解工艺及控制进行优化，制备不同分子质量范围的寡糖，可提高寡糖的应用价值。
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