学文网黑素细胞(Melanocyte 简称MC)来源于外胚层的神经嵴,在胚胎8～10周时逐渐迁移至皮肤,广泛存在于机体各组织,可见于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周围、外周神经及交感神经干、软脑膜、内耳、胆囊、卵巢等结构。通过黑素细胞(MC)的体外纯培养可以研究黄褐斑、白癜风、白发等色素障碍性疾病的发病机制,也可以利用黑素细胞模型来筛选***这些疾病的药物和方法。同时对于研究皮肤色素代谢、皮肤老化、良恶性黑素肿瘤也具有重要意义[1]。近十年来,黑素细胞的体外培养方法逐渐成熟,从需要人工配制和添加各种培养成分到商品化培养基的出现,从需要添加致癌和毒性培养成分到新的无毒性、无致畸变培养基的出现,从培养表皮来源的黑素细胞到培养毛囊、葡萄膜等各种来源的黑素细胞甚至黑素细胞的干细胞,从单一黑素细胞的培养到含黑素细胞等多种细胞混合的组织工程皮肤培养,培养条件的成熟为我们利用这些模型进行相关研究创造了便利。现将黑素细胞的体外培养研究进展及研究意义综述如下:
1黑素细胞的培养来源
黑素细胞(Melanocyte,MC)来源于外胚层的神经嵴,在胚胎8～10周时逐渐迁移至皮肤。黑素细胞广泛存在于机体组织,最常见于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周围、外周神经及交感神经干、软脑膜、内耳、胆囊、卵巢等,分为树突型和非树突型黑素细胞,主要分布在表皮基底层,约占基底层细胞的10%,可将黑素颗粒转移至角质形成细胞。表皮MC基底以半桥粒与基底膜相连,但不与周围角质形成细胞形成桥粒。MC在顶部发出数个突起,每个突起与10～36个角质形成细胞接触,形成表皮黑素单元。黑素细胞的主要功能是在黑素小体合成黑素颗粒,黑素颗粒进入角质形成细胞后像伞样或者帽样覆盖于细胞核顶上方,保护细胞核免受紫外线辐射损伤[2]。而非树突型黑素细胞主要分布于色素膜、视网膜、脑膜,不能转移黑素颗粒。黑素细胞形状各异,大小不一,可呈圆形、椭圆形、梭形等,胞质透明,胞核较小。人的表皮约有20亿个黑素细胞,重约1g,平均每平方毫米1 560个对称分布于全身。虽然人种之间黑素细胞数量较恒定,无明显差异。但每个体各部位间黑素细胞的数量却不尽相同。在躯干部密度最小,约为900个/平方毫米,包皮最多,约有2 400个/平方毫米,头皮约有2 000个/平方毫米,其他部位约为1 000个/平方毫米[2]。此外,在暴露部位、身体褶皱处及***、腋窝、生殖器及会,黑素细胞的分布密度亦较高。因此,目前黑素细胞培养常用的供区为包皮,也有学者成功进行了毛囊黑素和脉络膜黑素细胞的培养[3-4]。
2黑素细胞的培养条件
MC在普通培养基中很难生长,这是因为正常皮肤中MC数量很少,约占表皮细胞的2%～4%,占基底层细胞的8%～10%,同时,其增殖能力较角质形成细胞和成纤维细胞弱,体外培养的早期常因角质形成细胞或成纤维细胞的过度生长而失败。黑素细胞培养条件进展如下:
2.1 建立含有十四烷酞佛波醇乙酯(TPA)+霍乱毒素(CT)的黑素细胞培养方法:1982年,Eisinger[5]首次体外培养皮肤MC成功。他们利用胰蛋白酶消化全厚皮标本分离出表皮,用胰蛋白酶消化成单细胞悬液。但是需要在培养基中添加l0ng/ml的TPA和l0nM的CT,并认为体外培养成功的关键是TPA对KC的毒性作用和CT对Fb的抑制作用。他们还发现TPA的作用具有浓度依赖性,TPA在浓度为1～10ng/ml时可抑制KC的贴壁与生长,但却刺激MC的贴壁和增殖,而0.1ng/ml和100ng/ml的TPA不具有这种作用。10ng/ml的TPA和10nM的CT, pH7.2和5%的小牛血清是MC的最佳培养条件。至今这一方法仍被很多学者采用。
2.2 不含TPA但需要CT的培养方法:由于TPA是公认的强致癌剂,在体内不易被代谢,可长期对细胞产生多种生物学效应,因此,有人担心利用TPA培养出的黑素细胞用于临床移植时可能存在一定的致癌风险。1988年,Halaban等[6]首先发现bFGF可刺激MC的生长。他们将处于对数生长期的KC和Fb的提取液与MC共同培养,用[3H]胸苷掺入法检测MC的DNA合成状况,发现提取液可显著增加MC的DNA合成,提示bFGF是MC的天然***原。国内学者丁国斌[7]利用碱性成纤维细胞生长因子/霍乱毒素建立了人正常黑素细胞体外纯培养系统。也有学者利用5-Fu[8]、下丘脑提取液(bovine hypothalamus extract BHE)或者内皮素(ET)代替TPA来进行黑素细胞的培养[9],其共同特点是这些物质具有细胞的有丝***原活性。以上这些培养方法大都采用DMEM、RPMI 1640培养基或者MCDB153作为基础培养基。
2.3 不含CT但需要TPA的培养方法:由于担心CT的毒性作用,人们也尝试摒弃CT来培养黑素细胞。各试剂公司也生产了成品培养基,省去了繁琐的配制过程。目前有M254培养基(Cascade公司产品)成功进行了黑素细胞的培养[10]。它包含一些必需和非必需氨基酸、维生素、其他有机物质、微量元素和无机盐。不包含抗生素、抗真菌药物、激素、生长因子或其他蛋白质,这种培养基含HEPES和碳酸氢盐缓冲液。为了进行黑素细胞的长期传代培养,必须在这种培养基中加入一种黑素细胞生长添加液(HMGS)。此添加剂含牛垂体提取物(BPE)、胎牛血清、牛胰岛素、牛转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、氢化可的松、肝素和佛波醇乙酸酯(PMA或者TPA)。另外还有一种不含有PMA或者TPA的添加剂2,但它含有内皮素成分,适合用于新生儿黑素细胞或者干细胞的培养。
2.4 不含有TPA和CT的培养方法:科研工作者以DMEM/F12作为基础培养基,加入了一定浓度的碱性成纤维细胞生长因子bFGF及其他成分,成功培养了黑素细胞[11-12]。市售的以此成分为主的黑素细胞专用培养基有ScienCell和Promocell公司的Melanocyte Medium-2 (MelM-2), 它不含有TPA,但含有一些必需和非必需氨基酸、维生素、其他有机物质、微量元素和无机盐、激素和生长因子等,使用时需添加黑素细胞生长添加剂MelGS-2(不含TPA)和少量的胎牛血清。
2.5 各种生长因子的添加:黑素细胞培养需要加入一些特殊的生长因子。CT是神经毒素,可激活腺苷酸环化酶,增加细胞内cAMP的浓度。IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)是磷酸二酯酶强有力的抑制剂,可提高dbcAMP 的水平,在原代培养中诱导黑素细胞分化。霍乱毒素和IBMX在TPA的协同作用下,可大大增加细胞内cAMP的水平。TPA可选择性促进黑素细胞增殖,它单独应用不能最有效地促进黑素细胞增殖, 若分别加入霍乱毒素和 IBMX,或同时加入霍乱毒素和IBMX,均可大大提高TPA的促***作用;TPA不能单独提高细胞内cAMP的水平[13]。
有学者将所有因子大致分为四类:包括作用较强的丝裂原活性物质,如FGFs、HGF/SF、 M/SCF、内皮素-1、TPA、CT、IBMX等,作用较弱的丝裂原活性物质如促黑素激素(MSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、黑素瘤生长刺激因子(MGSA)、胃泌素释放肽(GRP),部分因子已被证实对其生长无作用,包括表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGF-α)、IL-1 和IL2、垂体激素,其他如hPRL、hCG、 hFSH、内啡肽、促甲状腺腺释放激素、胸腺肽、凝血酶、血管活性肠肽(VIP)、血管内皮生长因子(VEGF)、组胺、鱼精蛋白、多巴胺、 腺苷、大分子内皮素、 P物质、降钙素、维甲酸、脑啡肽、肾上腺素、乙酰胆碱、刀豆素前列腺素A、 E、F等,起抑制作用的有TGF-β、interferon-β[14]。其他常用于MC培养的添加剂如胰岛素、转铁蛋白、皮质醇、三碘甲状腺原胺酸、氢化考的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺等,但对于它们的精确作用还所知不多,钙浓度对培养早期的MC基本上无影响。
2.6其他培养条件:Horikoslu等[15]研究了氧气对MC生长的影响,发现氧分压为6～34mmHg时MC生长良好,随着氧分压的升高,MC的生长受到抑制,而TYR活性逐渐降低。Eisinger等[16]发现pH6.0时Fb生长良好,而pH7.2最适宜MC的生长。己知血清对多种细胞的生长均有促进作用,Eisinger等[16]认为5% FCS对MC的生长最为适宜,无FCS或0.5%FCS组MC生长缓慢,只有低浓度FCS组MC可长期纯化生长。
3黑素细胞培养的意义
3.1 在皮肤美容疾病和色素肿瘤研究中的意义:目前黑素细胞体外培养技术已被广泛应用于各种色素性疾病的基础及临床研究,如外伤后色素沉着或者色素脱失、各种获得性色素障碍性疾病如黄褐斑、老年斑、白癜风及良恶性黑素瘤的病因学、病理学研究,对于祛除色素药物的机理、疗效及毒性的研究等。目前已有学者将培养的色素细胞进行移植***白癜风,黑素干细胞的研究也取得了重要进展[17-18]。
3.2 黑素细胞在神经内分泌领域的意义:十多年前,人们已预测黑素细胞具有感受和调节能力,发出的指令转化为外部或内部信号参与机体调控网络保持皮肤稳态。有证据表明紫外线辐射、生物因子或机械因素刺激黑素细胞产生神经递质和激素,表达相应受体,例如儿茶酚胺,5羟色胺,褪黑激素,促肾上腺皮质激素,β-内啡肽或黑素细胞刺激素,促肾上腺皮质激素释放因子,以及相关的皮质醇、皮质酮和类固醇激素的前体。它们的产生遵循受下丘脑-垂体-肾上腺轴和神经内分泌系统的调控。合成或分泌的黑素中间体包括L-多巴或它的衍生物可以进入全身循环而影响整个机体[19]。神经肽和α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)在黑素瘤[20]、肥胖、高血压[21]、创伤[22]等疾病中的作用和β-MSH在色素沉着中的作用研究也越来越多[23],进一步证实黑素细胞和神经内分泌的关系。
总之,黑素细胞培养是研究皮肤相关疾病的重要手段。进行细胞培养时要按照色素细胞的分布特点选择合适年龄供体标本,不同培养方法及培养基中的添加剂可以影响MC的生物学行为,进行实验设计和结果分析时必须考虑这些因素。
[参考文献]
[1]刘 熔,李红健.黑色素细胞体外培养技术的研究及应用[J].***医学,2008,38(9):169-171.
[2]张学***.现代皮肤病学基础[M].2版.北京:人民卫生出版社,2010:100-120.
[3]张汝芝,朱文元,王大光,等.毛囊无黑素性黑素细胞的分离和培养[J].临床皮肤科杂志,2003,32(9):509-511.
[4]王 玲,卢清君,王宁利,等.人眼脉络膜黑色素细胞的培养与鉴定[J].眼科研究,2006,24(3):248-251.
[5]Eisinger M,Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:2018-2022.
[6]Halaban R,Langdon R,Birchall N,et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural imtogen of melanocytes[J].J Cell Biol,1988,107:1611-1619.
[7]丁国斌,陈 璧,汤朝武.利用碱性成纤维细胞生长因子/霍乱毒素建立人正常黑素细胞体外选择性纯培养[J].中华创伤杂志,2001,17(7):438-439.
[8]Tsuji T,Karasek M.A procedure for the isolation of primary cultures of melanocytes from newborn andhuman skin[J].J Invest Dermatol,1983,81:179-180.
[9]Imokawa G,Yada Y,Kimura M.Signalling mechanisms of endothelin-inducedmitogenesis and melanogenesis in human melanocytes[J].Biochem J,1996,314:305-312.
[10]张汝芝,朱文元,马 佳.人表皮黑素细胞培养条件的探讨[J].蚌埠医学院学报,2006,31(2):126-128.
[11]罗 卫,赵 广,向培德,等.正常人黑素细胞的体外培养与观察[J].华南国防医学杂志,2007,21(5):4-5.
[12]Rafal Czajkowski,Waldemar Placek,Tomasz Drewa,et al.Autologous Cultured Melanocytes in Vitiligo Treatment[J].Dermatol Surg,2007,33:1027-1036.
[13]项蕾红,郑志忠,祝绿川.黑素细胞体外纯培养及生物学特性鉴定[J].临床皮肤科杂志,2001,30(3):166-167.
[14]Halaban Ruch.The Regulation of Normal Melanocyte Proliferation[J].Pigment Cell Res,2000,13:4-14.
[15]Horikoshi T,Balin AK,Carter DM.Effects of oxygen tension on the growth and pigmentation of normal human melanocytes[J].J Invest Dermatol,1991,96:841-844.
[16]Eisinger M,Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:2018-2022.
[17]Lang D,Lu MM,Huang L,et al. Pax3 functions at a nodal point in melanocyte stem cell differentiation[J]. Nature,2005,433(7028):884-887.
[18]Nishimura EK,Granter SR,Fisher DE,et al.Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche[J].Science,2005,307(5710):720-724.
[19]Slominski A.Neuroendocrine activity of the melanocyte[J].Exp Dermatol,2009,18(9):760-763.
[20]Cardones AR,Grichnik JM.Alpha-Melanocyte stimulating hormone induced eruptive nevi[J].Arch Dermatol,2009,145(4):441-444.
[21]Baltatzi M,Hatzitolios A,Tziomalos K,et al.Neuropeptide Y and alpha-melanocyte-stimulating hormone: interaction in obesity and possible role in the development of hypertension[J].Int J Clin Pract,2008,62(9): 1432-1440.
[22]Todd SR,Kao LS,Catania A,et al.Alpha-melanocyte stimulating hormone in critically injured trauma patients[J].J Trauma,2009,66(2):465-469.
[23]Spencer JD,Schallreuter KU.Regulation of pigmentation in human epidermal melanocytes by functional high-affinity beta-melanocyte stimulating hormone/melanocortin-4 receptor signaling[J].Endocrinology, 2009,150(3):1250-1258.
[收稿日期]2010-05-07 [修回日期]2010-07-12
转载请注明出处学文网 » 黑素细胞的体外培养研究进展及意义