学文网摘 要：以华贵栉孔扇贝为研究对象，对其闭壳肌蛋白组分进行分离，并对其氨基酸组成、分子质量分布和热稳定性进行检测分析。结果表明：新鲜华贵栉孔扇贝闭壳肌中水分、粗蛋白含量分别为78.12%、18.19%；蛋白组分分离得到3 种组成蛋白，其中肌原纤维蛋白占总蛋白46.80%，基质蛋白占32.70%，肌浆蛋白占20.50%；氨基酸组成检测表明3 种蛋白组分氨基酸种类齐全，肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白中必需氨基酸占氨基酸总量的百分比分别达到41.52%、38.96%、35.49%；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示：肌浆蛋白亚基分子质量在16～105 kD之间分布广泛；肌原纤维蛋白组分分子质量大多介于35～50 kD和105 kD附近；基质蛋白组分在35～50 kD之间有2 条明显的条带，在71 kD附近也有一条带；热稳定性分析显示肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的变性温度分别为65.8、50.5、59.6 ℃。
关键词：华贵栉孔扇贝；闭壳肌；蛋白分离；氨基酸；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；差示扫描量热法
Protein Isolation and Characterization of the Adductor Muscle of Chlamys nobilis
ZHU Yahui1， CAO Wenhong1， 2，*， HAN Linsen1， ZHANG Chaohua1，2
（1. College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China；
2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety， Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution， National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing （Zhanjiang）， Zhanjiang 524088， China）
Abstract： Adductor muscle is an important edible part of Chlamys nobilis which has been processed and exploited as a rich source of protein due to its delicious taste. In this paper， amino acid analysis， molecular weight distribution and thermal stability were investigated on adductor muscle protein from Chlamys nobilis. The results demonstrated that the contents of moisture and protein in adductor muscle from Chlamys nobilis were 78.12% and 18.19%， respectively. Three protein components were isolated from adductor muscle including myofibrillar protein， myostromin and myosinogen representing 46.80%， 32.70% and 20.5% of the total proteins， respectively. The analysis of amino acid composition indicated that a wide variety of amino acids were found in the three proteins with essential to total amino acid ratios of 41.52%， 38.96% and 35.49% for myosinogen， myofibrillar protein and myostromin， respectively. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed that the subunit molecular weights of myosinogen were in the range of
16 ～ 105 kD， those of myofibrillar protein mostly ranged from 35 to 50 kD and near 105 kD， and myostromin had two obvious bands between 35 and 50 kD and one band near 71 kD. Thermal stability analysis indicated that the denaturation temperature of myosinogen， myofibrillar protein， mystromin was 65.8， 50.5 and 59.6 ℃， respectively.
Key words： Chlamys nobilis； adductor muscle； protein separation； amino acid； sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）； differential scanning calorimetry （DSC）
中***分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）10-0010-06
doi： 10.15922/ki.rlyj.2015.10.003
华贵栉孔扇贝属软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），珍珠贝亚目（Suborder），扇贝科（Pectinidea），栉孔扇贝亚科，学名Chlamys（Mimachlamys）nobilis，暖水性种，营附着生活，多栖息在百米左右的浅海底，通常在20 m深的水域生长密度较大[1]，主要产于我国南海及东海南部[2]。据统计[3]，2013年，全国扇贝海水养殖面积达639 139 hm2，海水养殖产量达1 608 201 t，其中广东省扇贝海水养殖产量为95 588 t，约占全国海水养殖产量的5.94%，而华贵栉孔扇贝是贝类养殖中的一个重要品种，产量亦颇丰。华贵栉孔扇贝个体较大，生长速度较快，肉质部极肥大，特别是后闭壳肌大而圆，味道鲜美，营养丰富，不仅可以鲜食还可以制成“干贝”。由扇贝闭壳肌制成的“干贝”，是名贵的海珍品，其味道、色泽、形态与海参、鲍鱼不相上下，古人也赞誉到：“食后三日，犹觉鸡虾乏味”。
据报道，栉孔扇贝闭壳肌干粉中蛋白质含量为68.4%[4]，同样，华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白质含量也非常丰富，是良好的水产贝类蛋白质资源。关于贝类蛋白质的分离与纯化及性质研究等问题，目前国内相关报道还较少[5-7]，而对华贵栉孔扇贝的研究则主要集中于养殖[8-9]、育种[10]等领域，扇贝闭壳肌则主要应用于即食食品的加工制备[11]，对其蛋白质组分及性质研究的报道不多。本研究采用日本Saito等[12]分离提取蛋白的方法将华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白分为肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白，并对各蛋白组分氨基酸组成、分子质量分布及其热稳定性进行了测定和分析，从而为华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白的深加工和综合利用提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活华贵栉孔扇贝购于湛江市霞山区步行街东风市场，冰块冷藏并迅速带回实验室。开壳取扇贝闭壳肌，蒸馏水冲洗干净，称质量分装，置于超低温冰箱中备用。
电泳实验试剂 碧云天生物技术研究所；电泳蛋白分子质量标准品 大连宝生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
***100型精密电子天平 美国双杰兄弟有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 湛江鑫实业有限公司；VULCAN.3-550PD马弗炉 美国Vulcan公司；EMS-4B
型磁力搅拌器 上海比郎仪器有限公司；UV-8000
紫外-可见分光光度计 苏州江东精密仪器有限公司；电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；
XW-80A漩涡混合器 上海医大仪器有限公司；DSC214差示扫描量热仪 德国Netzsch公司；DYCZ-24EN电泳槽、DYY-2C电泳仪 北京六一仪器厂；Tanon
GIS-2008凝胶成像仪 上海天能科技有限公司；
1.3 方法
1.3.1 基本营养成分的测定
水分的测定：参照GB/T 5009.3―2010《食品中水分的测定》常压干燥法；粗蛋白的测定：参照GB/T 5009.5―2010《食品中蛋白质的测定》微量凯氏定氮法；灰分的测定：参照GB/T 5009.4―2010《食品中灰分的测定》高温灼烧法；粗脂肪的测定：参照GB/T 5009.6―2003《食品中脂肪的测定》索氏提取法；总糖含量的测定：蒽酮比色法。
1.3.2 蛋白质分离提取
提取温度除特别说明均为0～4℃。参考Saito等[12]的方法，将华贵栉孔扇贝柱分散于4倍体积的0.05 mol/L pH 7.0的预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，打浆、均质5 min，浸提90 min，浸提过程不时搅拌，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液。剩余沉淀重复上述操作，得到上清液和沉淀（S1）。收集2 次离心后的上清液，按1∶1（V/V）加入10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），4 ℃、10 000 r/min离心15 min，得沉淀（S2），丙酮漂洗3 次，除去TCA后，挥发掉丙酮，用冰水溶解即得肌浆蛋白组分。
将沉淀S1分散于5倍体积的0.1 mol/L pH 7.0预冷PBS溶液（含1.0 mol/L NaCl）中，均质5 min，4℃浸提18 h（期间不时搅拌），4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液，沉淀重复上述操作，收集2 次离心后的上清液，即为肌原纤维蛋白组分，所得沉淀部分即为基质蛋白组分。肌原纤维蛋白透析脱盐，可得脱盐的肌原纤维蛋白。
1.3.3 氨基酸组成测定及评分
样品经6 mol/L HCl水解后，采用氨基酸自动分析仪进行3 种蛋白质氨基酸组成的分析。采用氨基酸评分（amino acid score，AAS）对华贵栉孔扇贝闭壳肌各蛋白组分营养价值进行评价。以1973年联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出的人体氨基酸模式为评分标准[13]，按照下式计算AAS。
AAS=被测样品中每克蛋白质中氨基酸含量/理想模式中每克蛋白质中氨基酸含量
1.3.4 蛋白质分子质量分布测定
采用5%浓缩胶、12%分离胶对分离后的华贵栉孔扇贝柱蛋白质组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析。考马斯亮蓝R-250染色40 min，然后用脱色液（乙酸∶乙醇∶蒸馏水=1∶1∶8，V/V）脱色2 h，更换脱色液直至脱色干净为止。最后用凝胶成像系统拍照。
1.3.5 扇贝柱分离蛋白组分热稳定性检测
参照JY/T 014―1996热分析法通则检测扇贝柱分离蛋白组分热稳定性。检测条件：气源：N2（纯度99.99%），40 mL/min；扫描程序：从室温以10 ℃/min的速率降温至-20 ℃，恒温5 min，再以10 ℃/min的速率升温至90 ℃，记录升温曲线。
肌浆蛋白热稳定性参数：热焓3.21 J/g，峰值65.8 ℃，起始温度46.0 ℃，终止温度77.2 ℃；肌原纤维蛋白热稳定性参数：热焓33.74 J/g，峰值50.5 ℃，起始温度44.4 ℃，终止温度53.1℃；基质蛋白热稳定性参数：热焓43.32 J/g，峰值59.6 ℃，起始温度54.6 ℃，终止温度63.0 ℃。
2 结果与分析
2.1 华贵栉孔扇贝闭壳肌基本营养组成
由表1可知，新鲜华贵栉孔扇贝闭壳肌含水量为78.12%，除水分之外含量最高的是粗蛋白，为18.19%，粗脂肪0.62%、灰分1.28%、总糖0.31%。以干基计时，华贵栉孔扇贝闭壳肌粗蛋白含量为83.15%，明显高于偏顶蛤闭壳肌[14]蛋白含量（59.17%），稍微低于栉江珧闭壳肌[15]蛋白含量（90.10%），与不同贝类不同组织蛋白含量相比，均高于偏顶蛤性腺[14]（61.89%）、偏顶蛤外套膜[14]（38.29%）、雄性栉孔扇贝性腺[5]（78.16%）、栉江珧脏器[15]（68.40%），可能是由于不同贝类生活习性、生存环境、年龄、季节变化等影响造成不同组织部位蛋白质含量之间存在着一些差异。粗脂肪含量（2.86%）除了与栉江珧闭壳肌（2.87%）相近外，均低于以上3 种贝类其他各组织。就灰分和总糖而言，华贵栉孔扇贝闭壳肌中的含量均低于其他贝类各组织。由此可知，华贵栉孔扇贝闭壳肌是高蛋白低脂肪低糖的海中珍品，是一种值得重视的蛋白质资源，具有很高的经济价值，同时也有利于提高人们的膳食水平和营养质量。
2.2 华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白质组成
按照1.3.2节所述的方法对华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白质进行分离，得到3 个蛋白质组分：肌浆蛋白组分、肌原纤维蛋白组分和基质蛋白组分，各蛋白质组分占华贵栉孔扇贝闭壳肌总蛋白比例见***1。
*** 1 华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白质组成
Fig.1 Protein composition of adductor muscle from Chlamys nobilis
由***1可知，华贵栉孔扇贝闭壳肌肌原纤维蛋白组分占原料总蛋白比例最高，达到46.80%，其次是基质蛋白（32.70%），肌浆蛋白（20.50%）含量最低。目前为止，还未见有关其他贝类闭壳肌蛋白组分分离的相关研究报道，但郑惠娜等[16]分离了马氏珠母贝肌肉（闭壳肌和足肌）中的蛋白组分，上述3 种蛋白组分含量依次为肌浆蛋白（26.56%）>基质蛋白（23.79%）>肌原纤维蛋白（18.48%）。与本实验提取的华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白各组分含量比较，华贵栉孔扇贝闭壳肌中肌原纤维蛋白和基质蛋白均高于马氏珠母贝肌肉中相对应的蛋白组分，其中华贵栉孔扇贝闭壳肌中肌原纤维蛋白含量约是马氏珠母贝肌肉中含量的2.5倍，但肌浆蛋白含量却稍低于马氏珠母贝肌肉中肌浆蛋白组分。由比较结果可知，华贵栉孔扇贝闭壳肌与马氏珠母贝肌肉中各蛋白组分含量差异较大，可能是由于华贵栉孔扇贝和马氏珠母贝属于不同的科，生活习性不同，并且马氏珠母贝肌肉包括闭壳肌和足肌，比本实验中华贵栉孔扇贝的研究多了一部分足肌蛋白组分，从而造成了两者间蛋白质组成的差异。
与其他非软体类水产动物相比，华贵栉孔扇贝闭壳肌没有骨骼组织，其主要是由蛋白质、多糖、无机成分等物质组成，特别是肌原纤维蛋白和基质蛋白。
肌原纤维蛋白是支撑肌肉运动的结构蛋白质，属于存在于细胞内的盐溶性蛋白，主要由肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白组成，不仅与肌肉收缩有关，还与肉制品的流变学特性如弹性、保水性、质地等密切相关，在肉的加工和贮存过程中也起着非常重要的作用。华贵栉孔扇贝闭壳肌含有大量的肌原纤维蛋白，可能与其特殊运动有关。基质蛋白既不溶于水也不溶于盐溶液，包括胶原蛋白和弹性蛋白，是构成结缔组织的主要成分。华贵栉孔扇贝闭壳肌含有约1/5的肌浆蛋白，虽然其含量较少，但肌浆蛋白中却含有较多的水溶性蛋白和呈味物质，对于扇贝柱及其干制品的独特风味至关重要。
2.3 华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白组分的氨基酸组成
由表2可知，3 种蛋白组分均检测出17 种氨基酸，其中包括全部的8 种必需氨基酸，6 种呈味氨基酸和3 种支链氨基酸。其中，氨基酸含量最高的是谷氨酸，其次是天冬氨酸、赖氨酸，色氨酸含量最低。3 种蛋白组分氨基酸含量肌浆蛋白（60.59%）最高，其次是肌原纤维蛋白（57.09%），基质蛋白（16.34%）氨基酸含量最低。从氨基酸组成的角度分析，3 种蛋白组分必需氨基酸含量稍有不同，肌浆蛋白的必需氨基酸含量最高，为41.52%，肌原纤维蛋白和基质蛋白必需氨基酸含量稍低，分别为38.96%、35.49%。闭壳肌制成的干贝以其独特的风味备受人们喜爱，这与其含有较高含量的呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸）密切相关，其中谷氨酸、天冬氨酸呈鲜味，而甘氨酸、丙氨酸呈甘味[17]，本研究中，华贵栉孔扇贝柱3 种蛋白组分所含的呈味氨基酸含量较高，占总氨基酸的比例均超过了45%。此外，支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）具有独特的生理功能，例如抗疲劳[18]、调节泌***[19]和蛋白质代谢[20]、增强机体的免***防护[21]等作用，对肝性脑病也有一定的***作用[22]，而扇贝闭壳肌各蛋白组分中支链氨基酸含量均较高且相差不大，可以将其作为功能蛋白加以开发利用。
由表3可知，蛋白质营养价值的高低主要取决于其必需氨基酸的含量及组成比例。根据1975年FAO/WHO建议的每克蛋白质氨基酸评分标准模式计算的AAS可以看出，华贵栉孔扇贝闭壳肌中肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的第一限制性氨基酸均为蛋氨酸，第二限制性氨基酸分别为亮氨酸、色氨酸、色氨酸。在食用过程中，可以和蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸等限制性氨基酸含量充足的食物搭配食用，从而利用蛋白质的营养互补作用提高蛋白质的生理价值。
AAS值越高，说明蛋白质氨基酸模式与理想模式愈接近，其营养价值也就越高，能满足人体的营养需求。肌浆蛋白的AAS值大多数均超过了1，而肌原纤维蛋白中只有赖氨酸的AAS值大于1，其余均处于0.56～0.85之间，基质蛋白的AAS值较低，说明就3种蛋白组分而言，肌浆蛋白的营养价值最高，其次是肌原纤维蛋白，基质蛋白的营养价值较低。赖氨酸是合成大脑神经再生性细胞和白以及血红蛋白等重要蛋白质的必需氨基酸，也可叫做“生长性氨基酸”，特别是对幼儿、孕妇的补充有很重要的意义，而这3 种蛋白组分中赖氨酸的含量均较充足，可作为赖氨酸的一个重要蛋白质来源。
2.4 华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白组分的SDS-PAGE电泳分析
由***2可知，3 种蛋白质组分亚基分子质量主要集中于25～105 kD，其中肌浆蛋白条带较多，亚基分子质量分布比较广泛；肌原纤维蛋白组分分子质量大多介于35～50 kD和105 kD附近，在大于105 kD的区域也有一条明显的条带，据相关文献[23]研究报道，位于35～50 kD之间的2 条谱带分别是肌动蛋白和原肌球蛋白，分布在105 kD附近的蛋白质条带则为副肌球蛋白，副肌球蛋白是无脊椎动物特有的肌原纤维蛋白质，与双壳贝类闭壳肌的特殊运动有关，在双壳贝的闭壳肌中占有较多的比例；基质蛋白组分在35～50 kD之间有2 条明显的条带，在71 kD附近也有一条带，本实验中，分离得到的基质蛋白没有作进一步纯化处理，所得基质蛋白组分中含有少量的碱溶性蛋白组分，因此在小于35 kD的低分子质量范围内也出现了蛋白条带。
1.肌浆蛋白；2.肌原纤维蛋白；3.基质蛋白；4. Marker。
*** 2 蛋白质组分SDS-PAGE电泳***谱
Fig.2 SDS-PAGE of protein components in adductor muscle from Chlamys nobilis
2.5 华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白组分的热稳定性分析
*** 3 肌浆蛋白（A）、肌原纤维蛋白（B）、基质蛋白（C）
热稳定性曲线***
Fig.3 Thermal stability graphs of myosinogen （A）， myofibril protein （B） and myostromin （C）
由***3可知，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）曲线***均有一个峰，且肌浆蛋白的热变性曲线较平缓，而基质蛋白的DSC曲线***中除了一个急剧变化的峰外，还有一个小峰，可能是由于基质蛋白样品中含有少许的杂蛋白所致。此外，由上述DSC曲线***的峰值和峰面积可分别确定3种蛋白的热变性温度和热焓等相关信息，结果见表4。热力学转变温度表示蛋白质的热稳定性，而焓变则表示蛋白质吸收的热量，即曲线下面的每个相应峰的面积，反映了蛋白质分子的疏水性或亲水性，同时也反映了蛋白质分子的聚集程度[24]。对蛋白质体系而言，蛋白质本身随着温度的升高受热就会发生转变，导致蛋白质热解旋。蛋白质变性过程中分子结构会发生从有序态到无序态，从折叠态到展开态，从天然态到变性态的变化，且变化过程均伴随着能量的变化。蛋白质的热分析通过加热破坏蛋白质的二级、三级和四级结构，测量变性过程中的能量变化情况。
由表4可知，肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的变性温度分别为65.8、50.5、59.6 ℃，热焓分别为3.21、33.74、43.32 J/g。由变性温度分析得，在这3 种蛋白组分中肌原纤维蛋白热稳定性最低，而肌浆蛋白热稳定性较高，据文献[25]报道，肌肉中肌浆蛋白的变性温度发生在65～67 ℃之间，本研究所测结果与之相符。肌原纤维蛋白中的肌球蛋白和肌动蛋白的热变性温度[26]分别为55～62 ℃和78～83 ℃，而实验所测肌原纤维蛋白的变性温度（50.5℃）稍低，可能是样品在进行热分析检测之前就已经发生了一些变性，进一步证明了肌原纤维蛋白在上述3种蛋白质组分中对热最不稳定。
3 结 论
新鲜华贵栉孔扇贝闭壳肌含水量为78.12%、粗蛋白18.19%、粗脂肪0.62%、灰分1.28%、总糖0.31%。对其蛋白组分分析结果表明，华贵栉孔扇贝闭壳肌中肌原纤维蛋白组分占原料粗蛋白的46.80%，基质蛋白组分占32.70%，肌浆蛋白组分占20.50%。
华贵栉孔扇贝闭壳肌3 种蛋白组分均检测出17 种氨基酸，其中包括8 种必需氨基酸，6 种呈味氨基酸和3 种支链氨基酸；肌浆蛋白组分氨基酸含量（60.59%）最高，其次是肌原纤维蛋白（57.09%），基质蛋白氨基酸含量（16.34%）最低；氨基酸评分可得肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的第一限制性氨基酸均为蛋氨酸，第二限制性氨基酸分别为亮氨酸、色氨酸、色氨酸，且肌浆蛋白的总体AAS评分均较高，属于理想的优质蛋白。
华贵栉孔扇贝闭壳肌蛋白组分分子质量分布范围较宽，各组分之间存在较大的差异。肌浆蛋白组分亚基分子质量在16～105 kD之间广泛分布；肌原纤维蛋白组分分子质量大多介于35～50 kD和105 kD附近，在大于105 kD的区域也有一条明显的条带；基质蛋白组分在35～50 kD之间有两条明显的条带，在71 kD附近也有一条带。
肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的变性温度分别为65.8、50.5、59.6 ℃，说明在这3 种蛋白组分中肌原纤维蛋白对热最不稳定，而肌浆蛋白对热稳定些，对其性质进一步的研究提供了理论依据。
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