学文网【摘 要】提出了利用酒糟制备酵母培养物，既可以作为饲料蛋白，又可以作为动物益生因子。确定了最佳发酵工艺条件。
【关键词】酒糟；酵母培养物；固态发酵工艺
0 研究背景
酒糟含有大量的蛋白质、氨基酸、糖、纤维素、维生素及香味物质等。目前，其用途主要为直接作为饲料、制作调味品及培养食用菌等，其附加值低。如何使堆积如山的酒糟变废为宝，亟待解决。
酵母培养物，是一种新型绿色微生态制剂，指酵母菌在特定条件下发酵基质而制得的产品，主要由基质，酵母细胞及代谢产物组成。这些物质能促进动物肠胃微生物的生长，改善消化能力，提高免***力、脱毒，因此有利于动物的健康生长，在畜禽生产中应用前景广阔。饲料行业需要大量的蛋白原料，我国每年进口3000万吨以上的大豆才能满足需要。黄酒糟富含蛋白质，但其营养价值不均衡、含水量高、直接饲喂利用率低，且常常堆积变质。利用酵母发酵黄酒糟，可作为一种很好的蛋白饲料来源，在一定程度上缓解蛋白饲料的压力。
1 过程与方法
1.1 材料，试剂及器材
材料：黄酒糟、酿酒酵母和糖化酶等。
YPD培养基：葡萄糖2%，胰蛋白胨2%，酵母浸粉1%，琼脂粉1.8%，灭菌115℃、20min。使用前以入100μg/mL添加氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL。
仪器：恒温水浴锅、恒温培养箱、洁净工作台、恒温摇床、显微镜、干燥箱等。
1.2 种子液制备
称取适量干酵母于100mL的三角瓶，以1：9（g：mL）加入以温度为38～42℃的蒸馏水，1%添加葡萄糖，封口，于38～42℃水浴15min，28～32℃水浴活化1h至起泡，即为活化好的酵母种子液。
1.3 固态发酵工艺优化
新鲜黄酒糟于烘箱中45℃烘干，密封保存。用时取适量，根据实验设计添加一定比例的物质拌匀，每组设置3个平行，分别计数，求平均值。优化过程如下：
首先，对糖化酶添加量进行优化，起始发酵条件为：取20g干糟，加入罐头瓶中，水料比1：1，接种量1×108CFU/g，糖化酶添加量分别为0、50、100和250U/g，自然pH，封口。培养30℃、72h，计算活菌数。其次，对装料量进行优化，在前一批优化的基础上，选择最优的糖化酶添加量100U/g，装料量梯度分别为10，20，30，40和50g，其它条件不变。发酵结束后，计数活菌数。依次类推，分别对水料比（0.50，0.75， 1.00，1.25和1.50），接种量（0.50×108，1.00×108，1.25×108，1.50×108和2.00×108CFU/g），温度（25、28、30、32和35℃）和pH值（4.0，4.5，5.0，6.0和7.0）进行优化。
1.4 酵母活菌计数
发酵结束后，将产物取出，平摊于报纸上，将粘结的发酵物切成大小基本一致的颗粒状，置于45℃鼓风干燥箱，每隔1h进行翻动1次，烘干。取10g于250mL的三角瓶中，加入90mL蒸馏水，适量灭菌的玻璃珠，封口，30℃、200r/min振荡30min。将三角瓶取出，静置20s，即为10-1稀释液。取该稀释液1mL，加入到9mL无菌水的试管中，摇匀成10-2稀释液，依次稀释至10-5-10-7，各取100μL涂布于YPD平板，培养箱中30℃倒置培养2d后计数。
1.5 酵母自溶（酵母培养物的制备）
发酵结束之后，往罐头瓶中加入45mL水、180mg蛋白酶（50U/mg）和12mg的酵母破壁酶（400U/mg），调节pH值为6.5，于50℃作用24h，45℃烘干。此时90%以上酵母细胞壁破裂，释放营养物质。
1.6 成分分析
为了对比黄酒糟及酵母培养物的营养成分，分别测定粗蛋白、多肽、粗脂肪、还原糖、粗淀粉、粗纤维和灰分的含量。为评价可溶性蛋白的分子量分布，取1g干酒糟或酵母培养物溶解于10mL醋酸缓冲液中（0.05M，pH4.5），摇匀，沉淀10m，4℃、10， 000r/min离心10min，去掉沉淀，将上清通过0.2μm滤膜，用快速蛋白液相色谱仪（SuperdexTM 75色谱柱）检测多肽及氨基酸。
2 结果与讨论
2.1 固态发酵工艺优化
酒糟中含有大量酵母无法利用的淀粉，糖化酶可以将淀粉降解成小分子的糖类。结果表明（***1），添加糖化酶效果显著，添加量为100U/g时，活菌数达到稳定值为对照组的2.6倍，后略有降低，糖化酶价格较为昂贵，以100U/g为最适添加量。
酒糟粘性较大，装料量过多，不利于通气和散热。反之，通气良好，但是水分蒸发过快。装料量低于30g时，酵母菌数随装料量的增加而增加，高于30g时，随着装料量的增加，反而对酵母生长产生相对抑制作用（***2）。故选择30g为最适装料量。
固态发酵，水分是一个关键因素。水分过高，基质密度大、不疏松，影响供氧。反之，水分蒸发过快。水料比低于1.25时，随着比值的增大，活菌数快速增加，比值超过1.25后，菌数略有下降（***3）。故水料水比以1.25为最佳。
接种量过大，不仅造成菌种资源的浪费，而且使得培养基内的水分相应偏高，基质粘连，不利于酵母生长。反之过低，致起始生物量低，降低增殖速度，延长发酵周期。
由***4知，接种量达1.25×108后，活菌数增长缓慢，继续增加接种量，菌体增长受到抑制（***4）。故选取1.0×108CFU/g作为最适接种量。在一定范围内，温度的升高有利于酵母的生长繁殖及代谢产物的产生，但是温度过高，导致酶类失活，甚至直接导致菌体死亡。反之，菌体生长缓慢，周期延长。由***5知，最适温度为30℃。
pH值是发酵过程中的重要参数，它通过影响菌体细胞膜的通透性，来改变酵母对营养物质的吸收，以及影响酵母自身酶系的活力。酿酒酵母的最适生长pH值为4.2～5.0，实验表明pH4.5为最佳（***6）。
综上所述，以黄酒糟生产酵母培养物的最佳发酵工艺为：糖化酶100U/g，装料量30g，水料比1.25，接种量1.0×108CFU/g，温度30℃，pH4.5、此时发酵产物烘干后活菌数为20.88×108亿/g。
2.2 营养成分对比
经发酵后的酵母培养物，其蛋白及多肽含量增加，营养价值提高，具体为（表1）：粗蛋白含量为46.55%，增加了10.77%；多肽含量为6.97，增加了3.03%；粗脂肪为9.51%，略提高了2.32%；还原糖含量为10.56%，大幅度增加了7.6%；粗淀粉含量为11.78%，大幅度降低了25.84%；粗纤维为4.46%，略降低了0.28%；灰分含量为4.57%，增加了1.76%。
如***7所示，黄酒糟经发酵，自溶制备成酵母培养物之后，酸溶性蛋白平均分子量降低，检测到更多的多肽和游离氨基酸。多肽和氨基酸是食品中的功能成分，具有抗氧化、抗菌、提高免***力等多种功效。
目前，市场上的酵母培养物产品有：达威农公司的“益康XP”，粗蛋白12%，粗纤维6.50%，粗脂肪3%，灰分5%；安琪酵母有限公司生产的“酵母自溶粉FM801”，粗蛋白含量约为40%，灰分12%；湖北高生生物饲料有限公司生产的“方祥益思特酵母培养物”，粗蛋白22.60%，多肽5%，粗纤维7.80%，灰分6.70%。本产品以黄酒糟为基质，在材料来源上与他们没有可比性，但其粗蛋白和多肽含量较高，酵母活菌数达20.88×108亿/g。由此可见，黄酒糟生产酵母培养物具有一定的优势，深层次挖掘其发酵工艺，作为蛋白饲料和功能性饲料添加剂，其前景广阔。
3 创新点
本实验的主要创新点如下：
（1）提出了酒糟利用的一种潜在的途径，制备酵母培养物，既可以作为饲料蛋白，又可以作为动物益生因子。单纯利用黄酒糟作为饲料蛋白，产品附加值低，只利用于黄酒糟富含蛋白质的特性。而作为酵母培养物，不仅可以使其蛋白质得到利用，而且使其功能发挥到极致，如多肽及氨基酸含量提高，酵母细胞内的代谢产物等益生因子释放得以利用。
（2）确定了最佳发酵工艺条件，糖化酶100U/g，装料量30g，水料比1.25，接种量1.0×108CFU/g，温度30℃，pH4.5，此时发酵产物烘干后活菌数为20.88×108亿/g，蛋白质含量提高。与市场上酵母培养物产品相比，各有优势。
（3）固态发酵，酶解破壁工艺相结合，取长补短，相得益彰。通常，生产酵母培养物过程如下：液态发酵，厌氧酵母自溶，谷物吸附及烘干。此工艺周期长，需要长时间的厌氧条件细胞壁才裂解并释放营养物质，同时液态发酵能耗较高。而本工艺采用固态发酵富集菌体，简便易行；然后，采用廉价的常用酶类裂解酵母细胞壁，使代谢产物被释放出来，得到酵母培养物。
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