学文网1蛋白质芯片的分类
蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(proteinmicroarray),根据构建方法和用途的不同,可将蛋白质微阵列分为分析型阵列、功能型阵列和反相阵列3类[2]。分析型阵列主要用于测定蛋白质的表达水平、结合特异性及特定蛋白质之间的结合亲和力等;而功能型阵列包含全序列功能蛋白质或蛋白质结合域,主要用于研究复杂的分子间作用,如蛋白质与蛋白质/DNA/磷脂/小分子间的相互作用等;反相阵列与分析型阵列类似,用点样仪将组织细胞的裂解液以阵列排布于硝酸纤维素膜载体,与特定抗体反应后,利用化学发光法等分析得到裂解液中的抗原信息。也有根据分子间相互作用原理,将蛋白质微阵列分为抗原-抗体阵列、受体-配体阵列和酶-底物阵列等。
2蛋白质芯片制备技术
2.1载体选择蛋白质芯片的载体主要包括载玻片,膜类载体(硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、聚苯乙烯等)和复合材料载体。载玻片耐高温处理,可高离子强度洗涤,背景信号低且价格低廉,在基因芯片和蛋白质芯片中被广泛使用。膜类载体是传统蛋白质分析方法westernblotting(免***印迹)常用的软基质,但其作为芯片载体具有难以克服的缺点:首先,膜类物质表面非特异性吸附作用强,较高的背景信号会大幅降低信噪比;其次,点样物质在膜表面容易扩散不利于形成高浓度蛋白质样点;第三,膜类载体通常不能进行高密度蛋白质点样[3]。本实验室研究发现,选择合适的封闭液可有效地减少非特异性吸附,降低背景信号;维持适当的膜表面湿度,可改善点样物质的扩散问题;膜类载体点样密度虽不及载玻片,但可用于构建应用型检测芯片。本实验室构建的同时检测多病原蛋白质芯片,结果可直接用肉眼判定,应用前景广阔。另外,近年来出现的复合载体芯片,结合了多种载体的优点。如Lee等[4]利用金包被的硅片载体成功构建了单分子蛋白质纳米芯片,用于分析单分子间的作用。最近有报道将硝酸纤维素膜等覆于载玻片表面构建三维芯片,如Chatterjee等[5]利用硝酸纤维素膜涂层的载玻片构建蛋白质芯片,取得良好效果。三维芯片载体相对二维载玻片具有更强的蛋白质吸附能力,表面的凝胶或纤维素可更有效地维持蛋白质分子三维结构,降低蛋白质分子变性。
2.2芯片点印芯片载体点印前一般需经过洗涤、特定溶液浸泡等预处理,从而保证点样后的蛋白质活性。蛋白质芯片点制多采用最初设计用来制作基因芯片的接触式和喷墨式点样设备。由于蛋白质芯片的靶分子一般是具有多级结构的蛋白质分子,有别于基因芯片中线性的核酸分子,所以点制时一般不用基因芯片采用的原位合成法构建。最近蛋白质芯片在构建方法方面也有新突破。如Tao等[6]借助体外翻译,探索出2种简便的蛋白质芯片构建方法:一种是借助固相载玻片表面固定的寡核苷酸链接嘌呤霉素,快速插入合成中的核糖体氨基端,使新合成的蛋白质肽链被固定于载玻片表面,从而构建蛋白质芯片;另一种是将几种蛋白质的DNA合成模板经体外转录得到mRNA-DNA杂交链点印于载玻片,经体外翻译、RNase处理等步骤,构建蛋白质芯片。相应的测试结果显示这两种方法均具有较好的可操作性,并能克服现有芯片制作方法的部分缺陷。Chatterjee等[5]则借鉴比较成熟的DNA芯片技术,将质粒DNA点印于载玻片表面,利用质粒可高亲和力结合新合成蛋白质的特点构建蛋白质芯片。
3蛋白质芯片信号检测技术
根据被检测样品液是否需要前处理,可将蛋白质芯片的信号检测分为直接检测和间接检测两大类。
3.1直接检测直接检测法常用的有表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance,SPR),滚环扩增技术(rollingcir-clesamplification,RCA),表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱法(surfaceenhancedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)[7]等。SPR传感器芯片的金膜表面固定有探针分子,当样品液流过金膜时,特定蛋白质与探针分子结合引起传感器芯片表面共振角的改变,通过分析传感***谱的变化,便可获取探针分子与样品定蛋白质分子相互作用信息。Koga等[8]利用SPR技术,实时连续测定了细胞裂解液中400种抗体分子的表达情况。通过对SPR信号的连续绘***发现,当蛋白质芯片表面抗体量在50~1000pg时,SPR传感器芯片检测限可低至5μg/ml。RCA系统是一种可放大反应信号的新分析方法,可用于检测核酸分子或抗原抗体间的特异性反应。SELDI-TOF-MS同时结合了色谱和质谱技术,主要用于微量蛋白质的检测。特定蛋白质与芯片表面探针分子结合,经激光激发为气化肽离子后,因其飞行时间与多肽离子的质量/电荷比成反比,故可根据肽离子从飞行时间质量分析仪一端飞抵另一端探测器所需时间,分析比对得到检测结果。Semmes等[9]将蛋白质芯片与SELDI-TOF-MS技术结合,用于评估依据血清蛋白质修饰早期诊断前列腺癌的筛查体系。SELDI-TOF-MS法可快速、大量的分析微量蛋白质,其缺点是只能分析蛋白质的分子量,不能确定空间构象。
3.2间接检测间接检测法将被检测物用荧光染料、亲合素、化学发光剂、放射性同位素等标记,通过检测标记信号的强弱、分布等间接推断样品信息。荧光染料标记可兼容基因芯片信号扫描仪器,安全有效,应用广泛。Haab等[10]利用荧光物质双标记被测溶液,结果显示其构建的抗原/抗体微阵列的检测限分别可达1.0ng/ml和0.1ng/ml。Colca等[11]利用光亲和标记研究恶唑烷酮类(oxazolidinones)的作用机制,显著简化了噻唑啉二酮类敏化胰岛素作用靶点的筛选过程。Mitsopoulos等[12]介绍了多种化学标记方法在基因组学和蛋白质组学研究中的应用。同位素标记法与荧光染料标记类似,在蛋白质芯片标记中也有较多应用。最近有研究报道将纳米级磁性微粒、金颗粒等作为标记物,结合芯片技术检测抗原。为探索几种病毒的目视检测法,LeBlanc等[13]将生物素化的病毒寡核苷酸序列固定于阵列表面,利用能与生物素特异结合的链亲合素包被磁性微珠放大检测信号,检测结果可用肉眼、普通光学显微镜判断。Chu等[14]利用胶体金标记第二抗体,结合银染显色,实现对抗原抗体复合物的目视检测。基于双抗体夹心法,本实验室选用连接有马来酰亚胺的纳米级金颗粒标记第二抗体,配合银染显色,结果可用肉眼直接判定,进一步以扫描仪获取信号,并进行灰度分析,便可实现对特定病原体的半定量检测。可视化芯片对昂贵仪器的低依赖度,检测结果用肉眼判断,很可能成为芯片技术的研究热点。直接检测法可同时测定的蛋白质含量通常较低,对特殊仪器有较高依赖性,应用较局限。间接检测法操作简单,结果易分析,使用前景远大于直接检测法。但其在数据可信度方面仍待提高,标记分子、被标记蛋白质间连接效率不稳定使信号与检测物换算困难,需尽量除去标记后游离的标记物及蛋白质分子,保证被标记的蛋白质分子占足够比例,以排除游离蛋白质对检测的干扰。
4蛋白质芯片在医学诊断领域的应用
蛋白质芯片是一种大规模、高通量的分析技术,它可在单次实验中快速、简便、平行分析数以千计的蛋白质分子,早期主要用于蛋白质组学研究,随后逐渐推广到医学相关领域。近年来,蛋白质芯片结合基础医学和临床医学,在疾病发生机制、诊断学、新药发现等方面有新的突破。Lin等[15]将幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)与十二指肠溃疡(DU)的发病机制关联,将新发现的幽门螺杆菌3个潜在性与DU相关的抗原固定于蛋白质阵列,建立了快速、便捷鉴定DU患者血清抗体类型的方法。Felgner等[16]将含有1205种假鼻疽伯克霍尔德杆菌(Burkholderiapseudomallei)的蛋白质微阵列与类鼻疽病人血清反应,分析得到170种潜在抗原蛋白质。进一步以这些潜在抗原构建微阵列,并与不同地区的类鼻疽病人、其他感染类型病人及健康人群的血清反应,最终获得49种类鼻疽特异性抗原及59种可与所有人群血清反应的交叉反应抗原。利用蛋白质微阵列诊断类鼻疽的敏感性和特异性分别高达95%和83%。Song等[17]利用可解离抗体微阵列染色(DAMA)技术,分析正常***细胞和***癌细胞中312种蛋白质的表达修饰,发现5种在***癌细胞中显著高表达的蛋白质,为***癌诊断提供了新的标志物。为监测SARS(severeacuterespiratorysyndrome)的感染,Zhu等[18]构建了***病毒蛋白质微阵列,用健康人血清验证该方法检测***病毒感染的准确性、特异性和敏感性均大于90%。用于测定自身抗体的蛋白质与抗原分子微阵列技术也已获得初步应用[19-20]。可见,芯片技术可高通量平行分析的特点使传统分析方法不能实现的高通量数据分析成为可能。蛋白质芯片对高亲和性、高特异性抗体的要求,某种程度上也推动相关领域的共同发展。
5展望
蛋白质芯片技术具有高通量、快速、微量样品消耗等优点,是最高效的样品分析方法之一,但现阶段该技术的发展和应用仍面临很多问题。第一,具有多级结构的蛋白质分子,活性易受温度、pH、有机溶剂等因素的影响,当条件控制不当时,易使芯片表面的蛋白质分子活性减弱甚至完全丧失。第二,蛋白质芯片靶分子捕获目标分子的反应条件较之基因芯片更为苛刻,优化反应条件以保证检测质量的过程,是一项耗时费力的工作。第三,读取信号常用的激光扫描仪价格昂贵,使用面窄,限制了芯片技术的普及。第四,蛋白质芯片技术没有类似于PCR的扩增技术,也不存在蛋白质测序技术,无法短期内大量获取高纯度的目的蛋白质,推广受限。本实验室开发的目视化测定蛋白质芯片,点样密度虽不及传统芯片,但其具有信号可目测和对昂贵仪器低依赖性的优势,很可能为蛋白质芯片技术开辟一条新的发展道路。
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