学文网胰蛋白酶篇1
关键词： 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性
中药苏木的主要成分苏木素(Haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与DNA作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。
1 器材
1.1 仪器荧光分光光度计，美国Cary Eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计TU－1901，北京普析产品；pH－3C型酸度计，上海精密科学仪器有限公司产品。
1.2 药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂BS），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。
2 方法
2.1 苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照文献［8］方法操作。
2.2 苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制pH＝7.5的硼酸缓冲溶液（内含0.1 mol/L CaCl2维持离子强度）；用硼酸缓冲溶液配制1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸馏水分别配制2.0×10-3mol/L和1.0×10-3mol/L的苏木素溶液。
室温条件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，扫描190～350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入1.0×10-3mol/L的苏木素溶液10 μl，混匀，静置2 min后扫描190～350 nm的吸收光谱。扫描1.0×10-3 mol/L苏木素溶液190～350 nm的吸收光谱。
2.3 苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入 1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分别加入2.0×10-3mol/L的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混匀，放置5 min，分别在20，25，30，35℃下，测定其荧光光谱，激发波长为280 nm，绘制288～450 nm的荧光光谱。
2.4 苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“2.3”项下所配的温度为298 K的溶液，固定激发和发射波长间隔λ分别为20 nm和60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。
3 结果
3.1 苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为4.5×10-4 mol/L时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到70.2%，抑制率为29.8%。在不同的底物浓度（40，30，20，10 g/L酪蛋白溶液）下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v对抑制剂量用Dixon作***法求出Ki=6.13×10-5mol/L，抑制类型为非竞争性抑制。
3.2 苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响***1为T＝298K，pH＝7.4时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在280 nm附近。从***1可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的π－π*电子跃迁。
3.3 荧光光谱以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在354 nm附近则没有荧光峰，证明苏木素不会产生与胰蛋白酶干扰的荧光。固定胰蛋白酶的量，随着体系中苏木素浓度的增加，胰蛋白酶的内源荧光产生有规律的猝灭，其最大发射波长未发生明显的变化（见***2）。
3.4 荧光猝灭常数及猝灭机理
3.4.1 苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。本文以相同的实验条件，分别测定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以［F0/F－1］对［C］作Stern－Volmer***见***3。从***3可以看出苏木素在温度低于25℃时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。
当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从Lineweaver-Burk方程。20，25℃时以（F0－F）－1对［C］－1拟合Lineweaver-Burk方程，由***4可见该双倒数呈现良好的线性关系，再次确定在20，25℃时为静态猝灭。
3.4.2 结合位点数n及结合常数KA的计算设苏木素与胰蛋白酶形成n个结合点位的复合物则有：
Lg［（F0－F）/F］＝lgKA+nlg［C］
胰蛋白酶篇2
患者女性，48岁，因发现肝硬化、脾肿大伴双胁胀痛不适半个月入院。双胁胀痛不适无明显诱因，针刺样，无放射痛，与呼吸、变动无关。无乏力、食欲减退、腹胀等伴随症状。发病以来，患者精神、食欲、睡眠尚可，无发热，二便正常，体重无明显变化。5年前诊断有“痒疹”，长期服用多种中西药物。入院查体：慢性病容，面色晦暗，轻度贫血貌，四肢及腹部可见多处红色皮疹及小瘢痕，肝掌可疑阳性，心肺查体无异常，浅表淋巴结无肿大。腹部平软，无压痛、反跳痛，肝脏未触及，脾脏平脐，表面光滑，质地中等，无明显触压痛。移动性浊音阴性。实验室检查：白细胞 2.99×109/L、中性粒细胞 0.28、红细胞 3.66×1012/L、血红蛋白 83g/L、血小板 107×109/L，肝功能、ALP、GGT、AFP、PT均正常，肝炎病毒学、自身抗体系列检查均阴性。血清α1抗胰蛋白酶：2.3g/L。腹部CT：早期肝硬化（请结合临床）、巨脾；肺部CT：纵隔内多发肿大淋巴结；骨穿检查：增生性贫血骨髓像；肝脏穿刺活检：肝细胞浆内易见圆形粉染的透明小球，PAS染色阳性，并不被淀粉酶消化，肝细胞轻度弥漫性水样变性，部分肝细胞浆内见色素颗粒沉积，易见大核、双核肝细胞，散在灶性炎及窦周炎，肝窦局灶性轻度扩张，汇管区稍扩大，少-中量炎细胞浸润，纤维组织轻度增生，小叶界板轻度损伤。病理结论：α1抗胰蛋白酶缺乏症，并考虑重叠慢性药物性肝损伤。最终临床诊断：1. α1抗胰蛋白酶缺乏症；2.药物性肝损害。
讨论：α1抗胰蛋白酶（α1-AT）缺乏症是一种常染色体隐性遗传性疾病，根据蛋白酶抑制系统（PI系统）等位基因不同分为多种类型。其中PIMM型最为多见，PIZZ型最为少见，PIMZ、PIFZ、PIMS等杂合子类型病变发生较晚，发病率亦较低。α1-AT可抑制胰蛋白酶、蛋白溶解酶、弹性硬蛋白酶、纤维蛋白溶酶等。α1-AT缺乏时，肝细胞内堆积较多类α1-AT，不能通过肝细胞膜释放入血，故蛋白质分解破坏作用加强导致肝细胞变性坏死，蛋白溶解酶释放增多进一步损害肝细胞。同理可引起肺部损伤，造成弥漫性肺气肿。临床上多表现为新生儿肝炎，少数变现为幼年性肝硬化、成年性肝硬化及肺气肿。病理上以PAS包涵体为特征，化验血清α1-AT常降低。α1-AT缺乏症多为幼时发病，少有成年患者。与多数病例报导相比，本例患者具有以下几个特点：①发病年龄较大，考虑与等位基因差异有关，成年患者多为PIMZ或PIMS型；②化验血清α1-AT略高于正常水平，考虑与调节肝细胞合成α1-AT反馈机制有关；③脾脏肿大明显，易误诊为血液系统疾病、结缔组织病等；④有明确应用损肝药物史，临床表现符合药物性肝损害，易漏诊其他方面肝病。本例病人提示肝脏穿刺活检对本病诊断有重大意义，临床医务工作者对不明原因肝病患者应考虑到本病可能。目前该病尚无特效疗法，主要以保肝及对症支持***为主，肝病进展至晚期可考虑肝移植。
胰蛋白酶篇3
[关键词]鱼腥草 胰蛋白酶抑制剂
中***分类号：P618.21 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）10-0374-01
蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor， PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动植物和微生物中。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的药用价值，对急性胰腺炎、肺气肿、抗休克、防治脑水肿和脑缺血等都有很好的临床 *** 效果，还有研究表明对 HIV 和肿瘤的***也有重要意义。因此，从传统中药中筛选具有TI活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本实验根据前期筛选的结果，利用鱼腥草为材料对从鱼腥草中提取TI的工艺进行优化，找出最佳的提取条件，为今后的 工业 化生产TI提供基础性数据。
1 仪器与试剂
1.1 试剂胰蛋白酶（ 北京麒麟宏伟公司） 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯；鱼腥草。
1.2？ 仪器可见光分光光度计（7202B） 、离心机（LD-4） 、精密pH 计、水浴锅、精密 电子 天平（FA2004N）。
2 方法
2.1？ 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交实验设计根据 文献 及预实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取干燥的鱼腥草全草5 g，粉碎，在平行操作条件下，选用L9（34）正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次，然后过滤并收集滤液，减压浓缩到100 ml。
2.2？ 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分对胰蛋白酶的抑制率测定方法采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm条件下测定吸光度。按下列公式 计算 样品提取液的抑制百分率：i=（Ar-Abr ）-（As-Abs）（Ar-Abr）×100%
式中：i ―抑制百分率；Ar ―标准溶液的吸光度；Abr―含标准溶液的空白对照液的吸光度；As―样品溶液的吸光度；Abs―含样品溶液的空白对照液的吸光度。
3 结果与方差分析
由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>A>C>D，其中因素B为高度显著，因素A，C影响显著，因素D没有统计学意义，对试验结果的影响很小。由R值可知， 各因素对试验结果的重要次序为B>C>A>D。考虑到规模化生产中 经济 、效率等因素，本文优选工艺A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值为9，3 h/次为最佳提取工艺。按照此工艺条件进行3次平行实验，测定提取液对胰蛋白酶的抑制率，结果平均抑制率为58.27%，表明本实验确定的工艺路线稳定可靠。
4 讨论
因素A对实验结果有显著的影响，60℃时提取活性最高，随着温度的上升抑制率有下降的趋势，说明随着温度的上升对TI有失活的作用。因素B对实验有高度显著的影响，在所有因素中影响最显著，说明随着溶剂量的增加会提高TI的提取效率，但从变化趋势看当30倍量时继续增加溶剂量，TI的提取率增幅不是很明显，因此考虑生产成本和效益用30倍量是最好的。因素C对实验结果也有显著影响，随着pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，这说明在碱性条件下提取效率升高。
本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化， 并按最佳工艺进行了验证试验， 结果证明用该工艺作为鱼腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。
参考文献
[1]杜旭东，正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺，，2011.0
[2]文方德，傅家瑞.植物种子的蛋白酶抑制剂及其生理功能[J].植物生 理学 通讯，1997，33（1）：1.
[3]刘喜纲，刘翠哲.鱼腥草的药理作用研究进展[J].中华中西医学杂志，2004，9（2）：13.
[4]屈红丽，可 钰，尹 鹏，等.冬凌草中总黄酮提取工艺研究与含量测定[J].时珍国医国药，2006，17（10）：1929.
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胰蛋白酶篇4
【关键词】 胃蛋白酶原； 肿瘤标志物； 胃癌； 胰蛋白酶原-2
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，死亡率位居恶性肿瘤的第二位［1］。目前胃癌诊断主要依靠胃镜及病理检查，早期血清学筛查尚缺乏便捷准确的方法。实验室检查虽然有大便隐血及肿瘤标志物的检测，但阳性率准确性较低。本文采用TRFIA法对正常对照组、胃溃疡组及胃癌患者的血清进行了PG、TAT-2、CEA、CA50、CA19-9及CA242的检测，探讨了单项检测、2项联合检测及6项联合检测在胃癌筛查中的价值，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取在笔者所在医院经胃镜及病理检查确诊的胃癌患者65例，胃溃疡患者86例，健康体检者98例。
1.2 实验方法 受试者采集空腹静脉血3 ml，分离血清后，-20 ℃保存。检测前1 h血清复融，并离心取上清液检测。PGⅠ、PGⅡ试剂盒由无锡市江原实业技贸总公司提供，TAT-2、CEA、CA50、CA19-9、CA242试剂盒由江苏原子医学研究所提供。所有操作严格按说明书进行。临界值设定：PGⅠ≤50 μg/L，PGⅠ/PGⅡ（PGR）≤3为阳性，TAT-2≥50 μg/L为阳性，CEA＞20 μg/L为阳性，CA50＞1.5×104 U/L为阳性，CA19-9＞3.5×104 U/L为阳性，CA242＞2.0×104 U/L为阳性。
1.3 统计学处理 应用SPSS 11.0统计分析软件处理，阳性率的比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
胃癌组各单项检测、2项联合检测及6项联合检测的阳性率与胃溃疡组和正常对照组比较，差异均具有统计学意义（P
3 讨论
PG是胃蛋白酶的前体，可分为PGⅠ、PGⅡ两个亚型,其血液中含量的变化可反映胃黏膜的分泌水平［2］。本研究结果显示，胃癌患者PGⅠ、PGR显著降低，而由于分泌PGⅡ的细胞分布相对较广，故PGⅡ无明显变化。本项检测胃癌组的阳性率为58.5%,与胃溃疡组和正常对照组比较，差异具有统计学意义（P
TAT-2是一种丝氨酸蛋白酶，又称肿瘤相关胰蛋白酶原-2，其在卵巢、消化道均有高表达［5］。本研究显示，胃癌患者TAT-2明显升高，阳性率为53.9%,与胃溃疡组和正常对照组比较，差异具有统计学意义（P
CEA是一种分子量较大的多糖蛋白复合物，极少进入血液循环，但肿瘤细胞可分泌致血清中升高。当血清中超过20 μg/L时提示有消化道肿瘤［4］。本研究显示，胃癌患者CEA阳性率为35.4%,与胃溃疡组和正常对照组比较，差异具有统计学意义（P
CA50、CA19-9、CA242是一组比较广谱的肿瘤相关抗原，常用于消化道肿瘤的诊断［4,6］。本研究显示，胃癌患者这三种肿瘤标志物的阳性率分别为36.9%、41.5%、49.2%,与胃溃疡组和正常对照组比较，差异均具有统计学意义（P
以上各单项检测，胃癌患者的阳性率与胃溃疡组和正常对照组比较，虽然具有显著性，但阳性率均较低；阳性率相对较高的PG、TAT-2两相检测，也仅为58.5%和53.9%，而联合检测却可以显著提高胃癌检出率。本研究显示，胃癌患者2项联合检测及6项联合检测的阳性率分别达到73.9%、89.2%,与单项检测比较，差异具有统计学意义（P
尽管以上检测方法不能用于胃癌的确诊，但却可以用于大面积人群的筛查，对发现的阳性病例，再进行胃镜及病理检查，即可达到早发现、早***、提高患者生存时间的目的。
参 考 文 献
［1］ 顾光大.血清胃蛋白酶原、胸苷激酶联合检测对胃癌的诊断意义［J］.实用医学杂志，2009，25（5）：715-717.
［2］ 马颖杰，王惠吉，鲍晓厉.血清胃蛋白酶原与胃溃疡及胃癌［J］.中国医刊，2008，43（12）：46-48.
［3］ 袁荣华，孙永强，翟晓峰，等.胃癌手术***前后血清胃蛋白酶原含量分析［J］.交通医学，2009，23（2）：139-140.
［4］ 蒋志***，刘冰梅.血清CEA，CA19-9，CA242及胃蛋白酶原亚群联合检测对胃癌的诊段价值［J］.云南医药，2009，30（6）：639-640.
［5］ 张艺，张珏，马智鸿，等.胃蛋白酶原与胰蛋白酶原-2联合检测筛查胃癌的意义［J］.中国临床医学，2009，16（4）：548-550.
胰蛋白酶篇5
【关键词】 哮喘；类胰蛋白酶；支气管高反应性
1 材料和 方法
1.1 材料 健康雄性豚鼠30只，体质量(250±50) g（第四***医大学实验动物中心）；卵白蛋白（ovum albumin，ova）（美国sigma公司）；401ai超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司）；unicap100全自动体外变应原检测仪，unicap tryptase试剂盒（瑞典pharmacia公司）；磷酸组胺(上海丽珠东风生物技术有限公司)；戊巴比妥钠 (国药集团化学试剂有限公司，批号：f20041117)；401ai超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)；动物呼吸机 (浙江医科大学医学仪器实验厂)；ptm9医用微机实控仪(二道生理仪)，rm6280多道智能生理信号记录系统(第四***医大学病理生 理学 教研室提供).
1.2 方法
1.2.1 实验分组及处理 将豚鼠随机分为哮喘模型组和生理盐水组，每组15只. 参照 文献 ［1］的方法，给予豚鼠腹腔注射含有100 g/l ova及100 g/l氢氧化铝凝胶的生理盐水1 ml致敏，第15日用10 g/l ova溶液超声雾化激发，每日1次，连续7 d. 每次激发直到豚鼠出现咳嗽、呼吸急促，腹肌紧张等哮喘症状为止. 生理盐水组用等量生理盐水注射和雾化吸入.
1.2.2 类胰蛋白酶测定 各组豚鼠末次激发后，从心脏直接抽血5 ml，立刻置入含edta的抗凝管中混匀，静置30 min后1500 r/min离心10 min，留取血浆-80℃冻存. 采用unicap100全自动体外变应原检测仪及unicap tryptase试剂盒测定血浆中类胰蛋白酶的含量.
1.2.3 气道反应性的测定 参照文献［4］的方法，以气道内压力(ip)上升至基线值的20％时所对应的磷酸组胺浓度(pc20)作为体现气道反应性高低的指标.
统计学处理: 所有数据均以x±s表示. 将原始数据输入spss 11．0统计软件包，组间比较运用采用t检验.
2 结果
哮喘模型组豚鼠在诱喘过程中出现哮喘发作症状，表现为不同程度咳嗽、呼吸急促、腹肌紧张、四肢软瘫、行动迟缓或抽搐跌倒，约30 min后症状逐渐缓解. 生理盐水组豚鼠在整个试验过程中未出现上述症状，其血浆类胰蛋白酶含量（88.78±4.74）较哮喘模型组（119.78±12.50）显著降低(p<0.01). 哮喘组豚鼠pc20值（0.013±0.014）g/l显著低于生理盐水组（0.168±0.186）g/l，差异具有统计学意义(p<0.01).
3 讨论
哮喘的发病机制 目前 被认为与ⅰ型变态反应密切相关，而肥大细胞是介导ⅰ型变态反应的重要成分之一［2-3］. 类胰蛋白酶是肥大细胞含量最多的炎性介质，具有多种生物活性，因此推测类胰蛋白酶在哮喘炎症的发生、 发展 和气道重建中起促进作用［4-5］. 本实验发现哮喘豚鼠血浆中类胰蛋白酶值显著高于对照组，表明哮喘气道中存在肥大细胞脱颗粒过程.
ahr是哮喘的重要特征，是临床诊断哮喘的主要依据. 气道炎症、气道平滑肌细胞反应性及气道重建是哮喘发病机制的三种主要因素. 其中气道炎症为首发因素. 本实验中发现，哮喘模型组豚鼠血浆类胰蛋白酶含量较生理盐水组明显升高；哮喘模型组气道反应性与生理盐水组比较显著升高，提示血浆类胰蛋白酶含量与气道反应性之间存在正相关，这可为哮喘防治策略的制定提供依据.
【 参考 文献 】
［1］ 王长征，郭先健，王顺朝. 豚鼠哮喘模型的气道炎症性测定［j］.第三***医大学学报,1994，16（4）：277-278.
［2］ bradding p. the role of the mast cell in asthma: a reassessment ［j］. curr opin allergy clin immunol, 2003, 3(1): 45-50.
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胰蛋白酶篇6
目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA的表达。方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针，完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应，再运用免***组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达。结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，其他的组织细胞均显示阴性。结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性，并且具有很高的灵敏度和特异性。实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。
【关键词】 胸腺嘧啶二聚体；原位杂交；非放射性；弹性蛋白酶；mRNA
Abstract：Objective To detect the rat pancreatic elastase II mRNA in rats.Methods ISH was preformed by using Oligo-DNA probe based on the sequence of rat pancreatic elastase II mRNA，which 3' and 5' terminal conjugated with -A-T-T structure.The anti-T-T IgG antibody was used to react with haptenized Oligo-DNA in immunohistochemical process.Results Acinar cells in rat pancreas were highly labeled specifically by the probe.Conclusion It was a simple and safety ISH method with high sensitivity and specificity.The acinar cells in rat pancreas expressed pancreatic elastase Ⅱ mRNA specifically.
Key words:Thymine-Thymine dimer；ISH；non-radio；elastase；mRNA
常常用的检测细胞基因表达的技术，已经发展出了很多方法，其中由小路武彦等学者利用胸腺嘧啶二聚体（thymine-thymine dimer，T-T dimer）特性近年来发展出一种无放射性原位杂交方法［1］，在此采用这种方法检测对大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA［2］的表达进行检测。
1 原理
在生物细胞中有许多含有相邻胸腺嘧啶（thymine）序列的基因片段，当受到紫外线（包括阳光）照射时，任何两个相邻的胸腺嘧啶之间会形成共价键结构（即胸腺嘧啶二聚体），从而造成DN***段的损伤。但由于T-T dimer具有半抗原的特性，所以可以利用这个特性而应用于ISH。当我们需要检测组织细胞中任何一段mRNA的表达时，可以设计并合成一段单链DNA引物（注意避免其中含有T-T构造），并在目标cDNA的两端链接上含有T-T构造的序列作为单链DNA探针。进行ISH时，用适当剂量的紫外光照射，使探针两端形成T-T dimer，将探针与mRNA杂交后，再使用抗T-T dimer的抗体与探针进行反应，那么运用简单的免***组织化学技术即可检出组织细胞中目标mRNA的表达。
2 方法
2.1 DNA探针的制备
合成的大鼠胰腺型弹性蛋白酶Ⅱ型的单链DN***段序列为：tta-gtgccataacactcgaaaccgaggtgagacccga-att，序列为721～754（不包含3和5末端的-A-T-T序列）［2］。在ISH前用254 nm紫外线照射，能量为10kJ/m2。
2.2 组织标本准备
在ISH中，组织标本的制作非常关键。用清洁磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）配制的4%多聚甲醛对Wistar大鼠进行灌流固定过夜后，用PBS和含有30% (w/v)蔗糖和0.02% (v/v) DEPC的PBS冲洗并保存于4℃，组织取材后包埋于OCT中以制作冰冻切片。也可采用清洁酒精系列脱水后包埋于石蜡中以制作石蜡切片。大鼠胰腺组织作为阴性对照。
2.3 原位杂交操作
2.3.1 切出5～6 μm厚冰冻切片至于有涂层的清洁玻片上，迅速风干后置于40～45℃烘箱中2 h（如果使用石蜡切片则采用脱蜡程序）。
2.3.2 用PBS洗3次，每次5 min；
2.3.3 0.2 mol/L HCl处理20 min后用去离子水和PBS清洗；
2.3.4 用蛋白酶K（proteinase K ，1 μg/ml)在37°C条件下处理10 min，再用PBS洗净；
2.3.5 用4%多聚甲醛再次固定5 min，再用含有2 mg/ml甘氨酸（glycine）的PBS 溶液洗两次，每次15 min，PBS洗净；
2.3.6 将标本放入40%去离子化的甲酰胺（formamide）/4xSSC 溶液中直到用于杂交；
2.3.7 在标本上滴下20～30 μl的杂交反应液并保持在湿盒中15～17h，温度为 37℃。杂交反应液组成为：10 mmol/L Tris/HCl buffer(pH 7.3)，0.6 mol/L NaCl，1mM EDTA，1xDenhardt's solution，250 μg/ml yeast tRNA，125 μg/ml salmon sperm DNA，10% dextran sulfate，40% deionized formamide，1～5 μg/ml T-T-dimerized DNA probe。杂交反应液中不加入DNA探针则作为阴性对照。
2.3.8 反应结束后用50% formamide/2xSSC洗5次，每次15 min。
2.4 免***组化操作
采用鼠抗T-T IgG单克隆抗体作为一抗，HRP标记的二抗进行反应，通过标准的免***组织化学方法，用DAB显色，用苏木素进行核染即完成（见***1）。过程中去掉使用鼠抗T-T IgG单克隆抗体的反应步骤同时也作为阴性对照。
***1 大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA 在胰腺组织中的表达（苏木素核染，X550）
Fig.1 Expression of rat pancreatic elastase Ⅱ mRNA in rat pancreas
3 结果与讨论
大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，呈棕色，而细胞核以及内分泌部的细胞均显示阴性，除此外，其他部分的组织细胞同样显示阴性。实验中两种阴性对照的结果均显示阴性。研究结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性的表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。
这种运用T-T dimer特点进行原位杂交的方法具有很多优点。根据需要检测的mRNA的序列，可以任意合成相应的单链DNA探针，操作简便，适用范围广泛，不具有放射性，安全可靠，但在合成探针时应避免选择其中含有相邻T-T碱基的序列。合成的探针序列长度可以比较短，可以避免对探针进行标记的繁杂操作，因而合成的探针分子量较小，非常容易渗透进细胞中，灵敏度极高，特异性强。杂交完成后完全采用常规的免***组织化学方法显色。在进行免***染色前，可以在硝化纤维素膜（nitrocellulose filter）上进行点反应以确定使用抗体的合适浓度。抗T-T的抗体可进行不同的标记，灵活的选用两步或三步法进行，操作方便，并且可以根据需要进行多重染色（包括荧光染色），以及使免***染色和原位杂交在同一张切片上同时进行，提供细胞蛋白质和mRNA表达情况的多重信息，进一步还可以运用这种方法进行Northern-blot等操作，或根据反应情况对目标基因片段进行定量检测。
参考文献
胰蛋白酶篇7
急性胰腺炎是常见外科急腹症之一，病情凶险，若不及时诊断***，会严重危及病人生命，但其临床表现可能是非特异性的。淀粉酶检测是诊断急性胰腺炎的常见实验室项目，但是其检测方法的敏感性和特异性不佳。CT检查可靠且敏感，但费用杨贵且应用受到限制。本文将胰蛋白酶原-2试纸条的测定结果与尿淀粉酶测定结果作比较，以探讨前者诊断急性胰腺炎的效能。
1 对象和方法
1.1对象
1.1.1病例组急性胰腺炎患者62例（男38例，女24例），平均年龄48岁。
1.1.2对照组非急性胰腺炎（急性腹痛）共68例（男50里女18例），平均年龄51岁。其中胆管炎32例，胆囊炎5例，胆结石21例急性阑尾炎6例，原因不明4例。
1.1.3诊断标准1996年中华医学会外科分会急性胰腺炎临床诊断标准。
1.2方法
1.2.1试剂尿胰蛋白酶原-2试纸条，芬兰MedixBiochemica公司提供。Amy-u测定试剂。
1.2.2尿标本在患者腹痛三天内采集，均为晨尿。离心后取上清液进行尿胰蛋白酶原-2和尿淀粉酶的测定。
1.2.3尿胰蛋白酶原-2的测定免***层析法。原理：试纸条中含有2种人胰蛋白酶原-2的单克隆抗体，一种结合在蓝色的***胶粒子上，另一种固定于膜上。尿液接触试纸条后，尿液中的胰蛋白酶原-2与抗体标记的***胶粒子结合并继续移动，另一种抗体捕获该抗原抗体复合物并与之结合。若标本中胰蛋白酶原-2超过50ug/L，则在5分钟内显示一条蓝线，即为阳性结果。操作正确应显示另一条蓝线（质控线），若无此质控线则提示操作有误或试剂失效。
1.2.4尿淀粉酶测定以EPS为底物的速率法。在OlympusAu640全自动生化分析仪上按照仪器和试剂生产商提供的参数进行测定。
2、结果
62例确诊为急性胰腺炎患者的鸟胰蛋白酶原-2检测结果为60例阳性（灵敏度96.8%）；而68例急性腹痛担不是急性胰腺炎的病人中有1例阳性，该患者确诊为胆囊炎；二组比较，差异有极显著意义（表1）。与尿淀粉酶试验相比，尿胰蛋白酶原-2检测诊断的敏感性和特异性均很高。尿胰蛋白酶原-2试纸条试验阴性预测值为97.0%，阳性预测值为96.8%（表2）。
3、讨论
胰蛋白酶原是一种分子量25kd的蛋白，主要有胰蛋白酶原-1和胰蛋白酶原-2二种形式，生理情况下胰腺中的含量较高，仅有比列极少的一部分出现在外周血中[1,2].急性胰腺炎时胰腺组织细胞受损，胰蛋白酶原大量释放入血。肾小管对胰蛋白酶原-2的重吸收率比胰蛋白酶原-1低，因此尿液中多为胰蛋白酶原-2.所以，测定尿中胰蛋白酶原-2可作为诊断急性胰腺炎的可靠性指标。
尿胰蛋白酶原-2检测出2例假阳性，确诊为胆囊炎，曾有报道，胰蛋白酶原-2由胆道和周围上皮挤压而出[3].
在急诊条件下，用快速检测尿胰蛋白酶原-2试纸条作为诊断急性胰腺炎的方法，具有快速、简便、准确的优点，便于作床旁试验，其灵敏度与特异性大大高于尿淀粉酶检测。尿淀粉酶原-2检测阴性者，在很大程度上可排除急性胰腺炎；对阳性者，则需作进一步检查。
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胰蛋白酶篇8
急性胰腺炎(AP) 是常见病，大多由于胰酶不正常被激活而导致胰腺本体出现自身消化，它不仅是胰腺的局部炎症，而且病急，临床表现及其病程、预后复杂多变，病死率及误诊率高，仅根据临床表现及化验检查，就有30％～40％的病人被漏诊［1］。为此，临床上迫切需要提高早期诊断水平，制订个体化的最佳***模式，这就要求检验、影像技术不断改进，合理使用各种***药物，加强重症监护和营养支持，采用内外科相结合的综合***。在此，就急性胰腺炎的诊断和***做一综述。
1 急性胰腺炎的诊断
1.1 临床表现
临床表现仍然是AP诊断的重要依据，典型的临床表现：（1）上腹痛：多为中上腹、左上腹持续性痛，餐后加重，胆石症病人可有右上腹、中上腹痛。轻型病人3～5d后腹痛即可缓解，重症者剧痛持续时间较长，发生腹膜炎时可引起全腹痛，少数年老体弱病人腹痛轻微，极少数病人可无腹痛而突然休克或昏迷;（2）发热：轻者可无发热或仅有低热，高热多为重型病例，发病初期，发热多与急性炎性反应有关，后期多与继发感染有关;（3）胃肠道反应：约有1／3～2／3病人有呕吐，病情轻者仅有胃食管反流表现。由胆管感染、胆石症引起的胆总管梗阻、肿大的胰头压迫胆总管、合并胰腺脓肿或胰腺假性囊肿压迫胆总管及合并肝脏损害等情况也可出现黄疸;(4)低血压及休克：是重症胰腺炎(SAP)的重要体征，呕吐频繁者可有代谢性碱中毒;(5)累及其它重要脏器的症状：如由胸腔积液或并发ARDS引起的呼吸困难，肠***、消化道出血、尿少、神志变化等。
1.2 实验室检查
（1）淀粉酶：淀粉酶是诊断急性胰腺炎经典的检测指标，测定方法主要有4类：一是测定底物淀粉的消耗量；二是生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三是色原底物分解法；四是酶偶联法。目前临床上普遍应用的是碘-淀粉复合物的光电比色法［2］，此法是碘-淀粉复合物经a-淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精等，在底物淀粉酶浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与未被催化水解的淀粉酶结合成蓝色复合物。血淀粉酶在AP发病后2～12h后开始升高，3～3d后回复正常。淀粉酶分子量较小，易由肾脏排出，尿淀粉酶中活力常高于血。因此急性胰腺炎病人尿淀粉酶增高且持续时间更长［3］。尿淀粉酶在血淀粉酶升高2h后尿中排泄增加，持续时间较长，而且标本易采集，为无创检测，为病人易接受，并且24h尿淀粉酶动态监测可作为监测病情的指标。但是尿淀粉酶的检测结果受尿液稀释或浓缩的影响而波动较大，因此临床上高度重视急性胰腺炎病人淀粉酶指标，同时测定血、尿淀粉酶将更有助于临床明确诊断。(2)脂肪酶：血清脂肪酶升高较淀粉酶为晚，一般在发病后24～48h开始上升，4d达高峰，此后则下降。脂肪酶的出现异常持续时间长，灵敏度高，正常人血清中LPS浓度178U／L以下，AP发生时，LPS对正常上限的升高倍数比淀粉酶升高倍数高，而且LPS特异性高，LPS的特异性为93％，而淀粉酶的特异性为80％，这是因为LPS的组织来源较淀粉酶少［4］。LPS是AP早期诊断有力的实验室指标，明显优于传统的淀粉酶。脂肪酶分子量较大，不易通过肾小球，故尿中测不出LPS的活力。急性胰腺炎病人血清LPS活力在病程1d已明显升高，且在病程7d时与非急性胰腺炎急腹症组比较仍有显著性差异［5］。(3)胰蛋白酶原：近年来临床对AP的诊断水平不断提高，新的诊断技术应用于临床，有学者提出胰蛋白酶原可作为检测AP的新指标。健康人的胰蛋白酶原-1浓度较高，而AP时，胰腺组织受损，胰蛋白酶原大量释放入血液，从肾小球滤过时胰蛋白酶原-2的重吸收率低于胰蛋白酶原-1(原因尚不明确)，所以尿中的胰蛋白酶原-2浓度升高［6］。Kemppainen等［7］测定500例AP病人尿中胰蛋白酶原-2的含量，并通过ROC曲线确定其诊断敏感性为94％，特异性为95％(cutoff值为50μg／L)，均高于血、尿淀粉酶。（4）胰蛋白酶原激活肽：胰蛋白酶原激活肽(TAP)是一种胰蛋白酶原被激活转变为胰蛋白酶时释放的多肽，随着胰腺炎的发生和加重，胰蛋白酶原激活增多，大量TAP释放入血，它不与胰蛋白酶抑制物结合，迅速随尿排出。2002年世界胃肠病大会制订的“急性胰腺炎诊治指南”中认为，AP的疾病严重程度与TAP水平之间存在相关性。Neoptolemos证实尿TAP可准确预测AP发病后24h的严重程度。（5）胰弹力蛋白酶：胰弹力蛋白酶(PE)属胰腺蛋白水解酶，在AP发病中起重要作用，既往研究发现AP发病3～4d仍在血中保持高浓度，Robert等对29例AP病人进行前瞻性研究，发现PE浓度＞3.5ng／ml时其诊断AP的敏感性为80%、特异性96%、准确性94%，发病48h后敏感性为100%、特异性96%、准确性96％，其诊断价值等同于血淀粉酶，但低于血脂肪酶。作者认为，由于其相对较低的敏感性以及测定总弹力蛋白酶存在困难，限制了PE在临床上的广泛应用。
1.3 影像学检查
(1)CT：CT扫描是诊断胰腺炎比较可靠的方法，可以了解胰腺炎症程度及有否坏死，还可以观察胰周受累情况及有否并发症；CT检查能够在手术前明确胰腺炎诊断与类型，如果动态复查可显示胰腺炎的演变过程，从而指导临床选择合理***方案。急性胰腺炎CT表现为弥漫性或局限性胰腺增大、肿胀，胰腺周围脂肪线模糊或消失，胰腺轮廓不规则，坏死表现为局部低密度影，胰腺周围脂肪层消失，左肾周筋膜增厚，CT增强扫描在急性水肿型胰腺炎由于血管扩张、血流再增加以及血管通透性增加，故在CT增强扫描时腺组织明显强化，当急性坏死性胰腺炎由于本身供血不足，强化效应降低，坏死区更无强化，表现为增强后扫描呈低密度区，边界欠清晰。(2)MRI：CT对急性胰腺炎的诊断效果较好，但常需要使用对比剂，而急性胰腺炎尤其是重症胰腺炎使用对比剂有时会增加胰腺组织坏死而加重病情，此时MRI远比CT优越，特别T2WI能够清楚显示胰腺正常坏死组织、胰管及周围组织变化，对急性胰腺炎的分型诊断准确［8］。MRI为无创性检查，如结合MRCP显示胰管，一般均能作出急性胰腺炎及其轻、重程度的诊断。（3）超声：急性水肿性胰腺炎在超声声像***中可以见到胰腺轻中度弥漫性肿大，胰腺的边缘光滑，境界尚清楚，胰腺的内部回声减低，后方回声增强，胰腺的周围无液性暗区。在一些肥胖和老年人，由于胰腺的回声较高，发生轻型胰腺炎时可能无明显的声像***改变，应注意动态观察并结合其他检查。急性出血坏死性胰腺炎，声像***表现为胰腺重度弥漫性肿大，边界模糊不清，胰腺内部回声不均匀，胰腺周围可见到液性暗区，常伴有腹水，临床表现可见腹膜炎体征，是重度胰腺炎的标志。
2 ***进展
在AP***方面(特别是SAP)，国内外在近半个世纪中，经历了“手术—保守一早期手术”探索的变化阶段。过去主张一旦确诊AP应立即手术，手术亦愈趋扩大，直至全胰切除。但近年来SAP***观念发生了明显变化，大趋势明显向非手术“综合***”的原则转化，只有当感染恶化时才手术。
2.1 急性胰腺炎的非手术***
（1）禁食和胃肠减压：
使胰腺处于“休息状态”，另外可减轻胃肠功能紊乱所引起的严重胃潴留和改善腹胀，对于那些严重呕吐或肠梗阻的病人更有缓解作。
（2）解痉镇痛药：
腹痛可使胰腺分泌增加，加重Oddis括约肌痉挛，使业已存在的胰管、胆管内高压进一步升高，剧烈的腹痛还可以引起或加重休克，或导致胰-心反射，发生猝死。迅速而有效的缓解腹痛有着十分重要的意义。临床上根据疼痛的轻重不同，采取不同的***措施。轻度疼痛可选用阿托品、654-2等，该类药物除解痉止痛外，还可抑制胰腺分泌。急性胰腺炎的疼痛多剧烈，不能忍受，常需使用大量麻醉类止痛药，如哌替啶(度冷丁)、吗啡、美施康定和美沙酮等，麻醉性解痉镇痛药使用时须慎重，尽量选用成瘾性小、不良反应少的静脉制剂。
（3）抑制胰腺分泌：
H2受体拮抗药和质子泵抑制剂通过抑制胃酸来减少胰腺外分泌，还可以预防应激性溃疡的发生。生长抑素可抑制胃酸、胃蛋白酶、促胃液素以及胰腺内分泌和外分泌，减少内脏血流，抑制胆囊和小肠的分泌等作用，还可以松弛Oddis括约肌、抑制血小板活化因子的释放、减轻毛细血管的外渗、刺激肝脏网状内皮系统吞噬作用以及减少内毒素血症，如奥曲肽、施他宁等［9］，并有增强肠黏膜屏障功能［10］。另外，国内有报道应用生长激素联合生长抑素***重症急性胰腺炎，取得了满意的疗效［11］。生长激素有促进蛋白合成、调节免***和可能的抗感染效果，动物试验已证实它在SAP***中的效果，目前对SAP病人的***也取得了初步结果。生长激素的用量一般为4～8U，皮下注射，2次／d。
（4）抑制胰酶活性药：
抑制胰酶活性这类药物应尽量早期应用，临床常用药物有加贝酯，为大豆提取物，活性部分为精氨酸基，可抑制胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、缓激肽、脂肪酶和磷脂酶，并可抑制氧自由基、松弛Oddis括约肌。Buchler等［12］的研究表明，加贝酯并不能降低急性胰腺炎的并发症和病死率；乌司他丁(尿抑制素，Ulinastatin)，是一种存在于人尿中的胰蛋白酶抑制剂(UTI)，研究表明其分子中存在多种酶的结合位点，能同时***抑制多种酶的活性，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和羧基肽酶等；5-氟尿嘧啶(5-Fu)是抑制胰酶合成的最常用药，它能够抑制胰腺外分泌细胞RNA与酶蛋白的合成和分泌，能够减轻AP时的症状，但5-Fu会抑制病人免***功能，不利于胰腺炎恢复，因此不宜长时间使用。
（5）营养支持：
研究发现，急性胰腺炎病人的蛋白质代谢增加了80％，能量消耗增加了20％［13］。在20世纪70、80年代，通过中心静脉或外周静脉给予全肠外营养(TPN)一直作为急性胰腺炎病人的主要营养支持手段。Feller等［14］对1966至1972年间的重症胰腺炎病人进行回顾性分析发现，接受肠外营养支持后，重症胰腺炎病人病死率从22％下降至14％，最近Heyland等［15］和Mclanve等［16］所做的Meta分析发现，对于轻、中度急性胰腺炎病人，早期肠外营养可导致并发症增加，长期接受TPN后，病人在恢复饮食时可能会出现肠道再灌注综合征，表现为发热、白细胞升高等。从90年代开始，一些学者通过生理性的研究发现，在空肠内行肠内营养(EN)并不会刺激胰腺的分泌。Targarona-Modena等［17］将87名病人随机分为全肠外营养组及全肠内营养组(TEN)，TPN组手术率及器官功能衰竭发生率分别为88％和79％，而TEN组分别为25％和31％，急性胰腺炎坏死感染发生率在TPN组为74％，TEN组为20％，他们认为TEN可以预防胰腺坏死感染的发生，降低病死率。Eatock等［18］将49名SAP病人随机分为鼻胃营养组和鼻肠营养组，研究发现两组病人在C-反应蛋白、APACHE Ⅱ评分、疼痛评分及镇痛药使用剂量方面均无明显差异，而且两组病人在住院时间及病死率方面也无显著差异，鼻胃管营养并没有加重疼痛及胰腺的炎症程度，他们认为，SA病人胰腺处于无反应状态，对鼻胃管营养是可以耐受的，鼻胃管营养可以作为SAP病人营养支持的一种选择。急性胰腺炎的病情复杂，常需要根据病人不同的情况选择相应的营养方式，最终目的是保证足够的能量供应，避免由于营养失衡而出现病情恶化，同时应尽可能减少并发症的发生，以达到最佳的***效果。
（6）抗生素：
水肿性胰腺炎很少发生感染(
2.2 手术***
手术***在急性胰腺炎中的应用还存有争议，目前一致认同的有以下几点［23］：（1）轻症急性胰腺炎不是外科手术***的适应证；（2）对于有感染综合征 ( sepsis syndrome ) 的病人应该采用细针抽吸细菌学检查 ( FNAB ) 来鉴别无菌性胰腺坏死和感染性胰腺坏死；（3）感染性胰腺坏死是手术或介入引流的适应证，手术和各种介入***方法选择上，以在清创或坏死灶切除的同时能够最大程度保留存活胰腺组织的方法为好，加强术后处理从而尽可能引流出腹膜后渗液和坏死碎片；（4）无菌性胰腺坏死病人应该采用保守***方法，仅在有选择的病人中进行介入***；（5）对坏死性胰腺炎病人，除非有特别指征，不主张在发病后14 d内进行早期手术；（6）为了避免胆囊结石相关急性胰腺炎的复发，应该进行胆囊切除术；（7）对胆囊结石相关的轻症急性胰腺炎病人，胆囊切除术应该在病人恢复后尽早进行，最好在同次住院期间完成；（8）对胆囊结石相关的重症急性胰腺炎病人，胆囊切除术应该延期至胰腺炎症反应充分消退和完全临床恢复后进行。
综上所述，关于AP诊断、***的各种研究仍在摸索中前进，其重点为如何进一步提高诊断效率和预后评价水平，及时确定最佳***方案，降低并发症和病死率，这就需要深入研究SAP早期炎症反应综合征和多器官功能衰竭的发病机制，使急性胰腺炎的诊治水平上升到新的高度。
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胰蛋白酶篇9
【摘要】目的:探讨急性胰腺炎发病因素，提高对急性胰腺炎诊治水平。方法：回顾性分析我科2008年来收治的急性胰腺炎住院患者100例，对其进行临床分析评价。结果：92例水肿型胰腺炎经过常规***后痊愈。住院1.5～4周，平均3周。8例出血坏死型者中6例出现肠***，2例肾功衰竭，2例并发假性囊肿，经内科保守***好转出院。住院3～8周，平均6周。结论：急性胰腺炎发病因素多而复杂，胆源性胰腺炎占多数，其次为饮酒。
【关键词】急性胰腺炎；临床分析
【中***分类号】R142.19【文献标识码】B【文章编号】1005-0515（2011）09-0177-01
急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一，是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应［1］。其发病因素多而复杂，近年来急性胰腺炎的发病率有不断上升的趋势。现将我院收治的100例急性胰腺炎的临床资料总结报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料：100例均为2007年以来我院收治的住院患者，其中男性64例，女性36例，年龄18～69岁，平均年龄为44岁。全组病例均有胰腺炎的临床症状和体症，辅助检查血尿淀粉酶有相应的改变，腹彩或胰腺CT平扫或增强后，胰腺有形态学改变，均符合内科学第7版教材关于急性胰腺炎的诊断标准。其中水肿型胰腺炎92例，出血坏死型8例。病因中胆源性60例，酒精性20例，暴饮暴食16例，高脂血症2例，原因不明2例。
1.2 临床症状：持续性上腹部疼痛100例（100%），恶心呕吐84例（84%），发热16例（16%），腹胀76例（76%），腹膜炎表现12例（12%），血尿淀粉酶升高96例（96%），腹彩或CT平扫或增强后，胰腺有形态学改变64例（64%）。腹彩或胰腺CT表现为胰腺弥漫性增大，胰腺周围有渗出液。
1.3 ***方法：轻型病人入院后给于禁食水，胃肠减压，抑酸，改善胰腺微循环，抑制胰液分泌等常规***。对于胆源性胰腺炎常规***同时给予加用抗生素，10例胆总管结石梗阻引起的行内镜下***。8例重症者上述***外，给予输血浆,白蛋白,或全血，同时加强抗生素力度。
2 结果
92例水肿型胰腺炎经过常规***后均治愈。住院1.5～4周，平均3周。8例出血坏死型者中6例出现肠***，2例肾功衰竭，2例并发假性囊肿，经内科保守***好转出院。住院3～8周，平均6周。
3 讨论
急性胰腺炎（Acute Pancreatitis,AP）的发病机理主要是由于胰酶对胰腺的自我消化，对其周围组织的消化，从而继发一系列的器官的功能障碍。胰腺含有非常丰富的消化酶：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。胰腺腺泡分泌的酶主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、弹力酶、磷脂酶A2、硬蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、白酶等。正常情况下除脂肪酶、淀粉酶、白酶是以活性型存在外，其他的均是以非活性状态存在。在病理情况下，这些酶在胰腺导管及细胞内被活化后即可引起胰腺炎的发生。
胰酶在胰腺管内活化：由于各种因素使胆汁、十二指肠液、肠酶、***化脂肪、溶血卵磷脂等返流于胰管，则使胰管内的各种酶原活化，活化的酶对胰腺组织自我消化而发生胰腺炎。
胰酶在细胞内活化：胰腺泡细胞内的酶原颗粒，因其中含有胰腺自身分泌的蛋白酶抑制因子（PSTI）防止细胞内酶活化。在细胞内形成的一种溶酶体酶，正常情况下此酶和酶颗粒是分离的。在致病因子作用下，则酶颗粒和溶酶体通过一种吞噬现象而融合，在pH低的情况下致使酶原在细胞内活化，而损害细胞自身。若胰酶流入组织间，将使胰腺病变进一步加重并引起邻近的脏器损害，病变继续发展则可发生多器官的损伤。
急性胰腺炎除上述的自身消化外，近年来对其又进一步进行了深入的研究，发现胰蛋白酶和抗胰蛋白酶系统、磷脂酶A和血栓素A2、胰腺血循障碍、氧自由基、细胞膜的稳定性以及内毒素等，在急性胰腺炎的发病机理中起了重要作用。
胰蛋白酶篇10
摘 要 运动疗法是***胰岛素抵抗热门疗法，通过低氧/运动刺激胰岛素信号转导过程中的相关激酶和转运蛋白。本文主要综述近年来低氧与运动对胰岛素抵抗导致的Ⅱ糖尿病的研究进展。
关键词 低氧 运动训练 胰岛素抵抗
一、胰岛素抵抗
糖尿病是现代疾病中一种常见的代谢性疾病，其发病机制较为复杂，目前还尚不清楚，现研究结果表明糖尿病的发生是多种因素相互作用导致的。Ⅰ型糖尿病是由于先天性胰岛β功能缺失造成的，Ⅱ型糖尿病主要原因是因为饮食等因素长期导致的胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是正常分泌的胰岛素发挥的生理效应要低于正常水平，而导致血糖偏高，葡萄糖不能被人体吸收利用。
胰岛素抵抗主要分为胰岛素与胰岛素受体结合前、结合中和结合后，大多数的胰岛素抵抗都发生在受体结合后。胰岛素与胰岛素受体结合前异常主要是因为胰岛素在体内分解和胰岛素活性降低。胰岛素刺激骨骼肌利用葡萄糖是通过胰岛素受体（InsR）结合胰岛素受体底物-1（Insr-1）然后通过磷酸肌醇-3激酶（PI-3K）以及下游蛋白激酶B或者***型蛋白激酶C，以及葡萄糖转运蛋白（GLUT）等一系列信号转导过程完成的。
二、胰岛素信号转导
（一）胰岛素受体
胰岛素受体是胰岛素发挥效应的起始。胰岛素受体由于一些内部或者外部因素的影响使其敏感性降低就会发生胰岛素抵抗现象。研究表明，胰岛素抵抗大鼠在有氧耐力运动后，使骨骼肌胰岛素活性增强，胰岛素受体数目有所增加。Dohm通过实验发现，耐力训练通过改变胰岛素受体功能和数量使得胰岛素敏感性增加。刘霞等人研究表明短期低氧/运动会使胰岛素高亲和力受体的亲和力下降，而长期低氧/运动则会使低亲和力受体的亲和力下降但是其密度会增加，结果导致胰岛素敏感性增强。从研究中可以看出长期运动会改善胰岛素抵抗症状。
（二）PI3K/PKB
磷酸肌醇3激酶（PI3K）是一种胞内磷酸酰基醇激酶，而且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，同时也具有磷脂酰基醇激酶的活性。蛋白激酶B（PKB）是原癌基因c-akt的表达产物，参与激活后的PI3K信号转导过程，PKB是PI3K直接的靶蛋白。
研究发现，低氧/运动能够改善PI3K/PKB磷酸化和蛋白表达，从而促进葡萄糖转运蛋白的释放、移位和肌细胞膜结合，促进葡萄糖吸收利用。当胰岛素和胰岛素受体结合之后，必须募集一个胰岛素受体底物蛋白来促进PI3K的结合。
（三）葡萄糖转运蛋白（GLUT4）
骨骼肌中主要是葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）。GLUT4受到上游激酶刺激之后，会在使GLUT4向细胞外膜移动，当GLUT4移到细胞外膜时，会与葡萄糖特异性结合。在这一过程中，当胰岛素分泌不足或者生理效应降低时，都会使GLUT4通过吞饮作用回到细胞内部，使得血糖不能降低。在骨骼肌中发生胰岛素抵抗现象，有可能是因为GLUT4的活性和转为改变引起。Dela等研究发现正常人经过10周训练之后，骨骼肌中胰岛素受体和各种激酶含量没有显著变化，只有GLUT4增加。国内外很火研究发现，耐力运动能够促进GLUT4基因表达和蛋白含量。Stallknecht等对大鼠脂肪细胞研究发现，耐力运动能够提高脂肪细胞中GLUT4的基因表达从而促进了GLUT4蛋白的合成。通过各种研究发现低运动强度和高运动强度对GLUT4的含量变化影响不大。但是研究发现低运动强度对胰岛素抵抗下的骨骼肌内GLUT4的含量变化显著与高运动强度变化，可以看出低运动强度对糖尿病患者的胰岛素抵抗是有积极的***效果。
关于低氧是否对GLUT4有影响。刘晓莉通过急性低氧对大鼠GLUT4的影响发现，大鼠空腹血糖和血清胰岛素水平降低，肝脏中葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）含量显著增加，但是骨骼肌中GLUT4表达没有显示出统计学意义。造成血糖降低而GLUT4没有变化有可能是因为机体为了适应低氧改变了葡萄糖代谢方式。赵鹏等人研究发现急性持续低氧是GLUT4转位从胞浆内转移到细胞膜外。高住高练比常氧对GLUT4的影响显著。他们还发现GLUT在很大程度上受到氧浓度和持续时间的影响。
三、低氧与运动对胰岛素抵抗影响
低氧/运动对机体影响主要是通过机体内缺氧，机体对缺氧环境做出适应性改变。曹师承等人研究发现运动能够降低stz诱发的Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖浓度，可能通过促进磷酸肌醇3激酶和蛋白激酶C磷酸化水平和蛋白表达，从而影响下游葡萄糖转运蛋白（GLUT4）含量和跨膜转运，从而促进骨骼肌对葡萄糖的吸收利用，降低血糖浓度。黄森等人研究发现低氧运动能够显著提高PI3KmRNA表达，提示可能是骨骼肌对机体低氧产生应答，激活PI3K信号途径。
研究表明运动是能够促进PI3K和PKB蛋白表达。而金春林[10]等人通过低氧对骨骼肌mTOR上游的信号影响研究发现，运动能够增加PI3K的蛋白表达和PKB的磷酸化水平，但是低氧会抑制PI3K蛋白表达和PKB的磷酸化水平。低氧对蛋白合成的抑制，有可能是由于低氧导致机体ATP合成受阻而导致能力供给不足。在研究中发现低氧运动时蛋白合成也受到了抑制，但是与低氧没有显著差异。
龚豪杰、张楠等将小鼠低氧暴露2周后，发现GLUT4基因和蛋白表达有显著变化[11] 。黄缄等也发现将大鼠低氧暴露后，GLUT4蛋白表达比常氧组有显著增加。提示长时间的低氧暴露能够增加GLUT4，降低胰岛素抵抗，从而使血糖稳定。
四、小结与展望
在国内外，低氧对胰岛素抵抗已然成为一个研究热点。低氧对改善胰岛素抵抗上还没有统一的认识。低氧运动是否对***胰岛素抵抗型糖尿病效果更好的研究还比较少。低氧运动通过对胰岛素信号转导中相关激酶的影响，是否能***Ⅱ型糖尿病还有待进步一步研究。
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