学文网蛋白篇1
优不优，看氨基酸
人体所需要的蛋白质来源于多种食物，凡是蛋白质氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式接近的食物，其必需氨基酸在体内的利用率就高，反之则低。例如：动物蛋白质中的蛋、奶、肉、鱼等以及大豆蛋白质的氨基酸模式与人体氨基酸模式比较接近，所含的必需氨基酸在体内的利用率就高，因此被称为优质蛋白质。
一句话，蛋白质优不优，关键在于它的氨基酸模式与人体氨基酸模式是否接近。
高蛋白不等于优质蛋白
有商家宣传的时候常说：某某商品富含蛋白质。富含蛋白质就一定好吗？答案是未必。首先，高蛋白不一定好，蛋白质摄入过高还会引起疾病；其次，高蛋白也不等于是优质蛋白。比如：牛奶的蛋白质含量并不高，只有3%左右，但是牛奶的蛋白质却是优质蛋白；相反，有的谷类中含蛋白质为10%左右，但是谷类的蛋白质为植物蛋白，其氨基酸模式与人体的氨基酸模式差异较大，因此不是优质蛋白。
利用率不是简单的消化吸收
牛奶、蛋类、大豆蛋白都属于优质蛋白，但部分人吃了牛奶、鸡蛋或者豆类制品就不消化，可这并不能否定它们作为优质蛋白质的身份。能否消化，与个体很多因素有关，比如疾病、先天因素。
再说肉，过多摄入肉类可能引起心血管疾病，因此需要控制量，但肉类含的蛋白质因为氨基酸模式与人体氨基酸相近，是优质蛋白质的主要来源。
合理利用，优上加优
蛋类、奶、肉、鱼等动物性食物中的蛋白质以及植物性食物中的大豆蛋白质属于优质蛋白。这些食物的蛋白质必需氨基酸含量齐全，比例适当，能够维持人体健康和儿童生长发育。需要注意选择优质蛋白的人群包括：生长发育期的小孩、老年人、疾病恢复期的患者、蛋白质营养不良患者等。
对于张师傅来说，首先要了解哪些食物蛋白质是优质蛋白，然后，要学会利用蛋白质互补作用的原理进行配餐。
所谓蛋白质互补作用，是指两种或两种以上的食物蛋白质混合食用，其中所含有的必需氨基酸取长补短，相互补充，达到较大的比例，从而提高蛋白质利用率。比如：玉米、小米、大豆单独食用时，其生物价分别为60、57、64，如果混合食用则生物价可以提高到73；进一步，如果在植物性食物基础上再添加少量含有优质蛋白的动物性食物，则蛋白质的生物价还会提高，如面粉、小米、大豆、牛肉单独食用时，其蛋白质生物价分别为67、57、64、76，混合食用则蛋白质生物价提高到89。
注：生物价是反映食物蛋白质消化吸收后，被机体利用程度的一项指标。生物价越高，说明蛋白质被机体利用率越高，即蛋白质的营养价值越高，最高值为100。
小知识
蛋白质和氨基酸
所有的蛋白质都是由氨基酸构成。
氨基酸 组成蛋白质的基本单位。
蛋白篇2
微量白蛋白尿的定义，是24小时尿中检出30～300毫克白蛋白，它被用于临床检测已有25年之久，公认是早期诊断糖尿病肾病最有价值的指标。随着医学科学的发展，人们对微量白蛋白尿的指标性意义有了更多的认识。如今，国内外高血压防治指南均将微量白蛋白尿列为常规检测项目，它也应该用于代谢综合征，甚至血压仅为正常高值者的检测。
受损标志微量白蛋白尿不仅反映肾的损伤，而且它也是全身血管内皮功能受损的重要标志。各种心血管病危险因素，如年龄、糖尿病、高血压、吸烟、血脂异常、中心性肥胖、左心室肥厚、高尿酸血症、C反应蛋白升高、交感神经功能障碍等，均可导致内皮细胞功能受损，进一步引发全身血管亚临床动脉粥样硬化及肾脏病变，促发并加重微量白蛋白尿。
预测因子
已有证据证明，微量白蛋白与高血压明显相关。有研究表明，血压正常高值和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级高血压患者，其微量白蛋白尿的检出率分别为27.3％、28.7％、31.5％、40.3％。国外对23 964例病人的调查发现，微量白蛋白尿是心血管疾病***的高危因子。一项对840例成人糖尿病患者12年的随访研究发现，有微量白蛋白尿的患者和无微量白蛋白尿的患者相比，心血管病死亡的危险增加2倍。更多的证据表明，微量白蛋白尿可使高血压或临界高血压患者发生缺血性心脏病的危险增加4倍。不论对于糖尿病或非糖尿病患者，微量白蛋白尿的出现都能增加疾病的死亡危险：主要的心血管事件增加1.83倍，所有死因增加2.09倍，因充血性心力衰竭而住院者增加3 23倍。尿白蛋白水平愈高，心血管疾病和死亡的危险也越大。
蛋白篇3
1、首先，是维持血浆渗透压的稳定，白蛋白可以非特异性的与血浆中，多种小分子有机物或者无机的离子可逆性相结合，作为上述物质在血浆循环当中的主要运输形式之一。
2、其次，白蛋白还能够保证细胞内液、外液和组织液之间的稳定交换。
3、最后，白蛋白是人体的重要营养物质，其具有黏性、胶质性，在血浆中重金属离子浓度升高时，可以自动与重金属离子结合起到解毒的作用。
（来源：文章屋网 ）
蛋白篇4
蛋白质的氨基酸序列决定其结构和功能，因此氨基酸序列比对可以用来鉴定微生物和植物蛋白的生化和功能等同性。一般确定蛋白质的序列的方法为N端测序和串联质谱测序。微生物和植物目的蛋白的N端测序一般用Edman测序法［9］。目的蛋白通过和异硫氰酸苯酯作用转变为苯胺基硫甲酰蛋白，这种修饰了的N端氨基酸通过和三氟乙酸作用发生裂解后转变成可以在色谱分析或者电泳中分离识别的乙内酰苯硫脲。由于这种转化不可能反应完全，所以获得的序列数量有限。但是微生物蛋白中的前10个氨基酸残留序列可以检测出来，并能与获得的植物蛋白序列直接进行序列比对。Edman法得到的数据是半定量的，并且可以检测出混合样品中的N端形式。Edman化学降解测序法虽可靠、有效，但仍有其无法避免的局限性，如N端封闭的、环状的蛋白不能测定；被修饰的蛋白不能给出确切的信号；要求蛋白或多肽的纯度在95%以上；测序速度较慢，灵敏度较低，耗费大等。采用钠升喷雾（Nano）技术和碰撞诱导解离（CIDcollisioninducddissociation）方法，在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ES1-Q-TOFelectrspectrometryionizationquadrupole-timeofflight）上，可以对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序（denovosequence）。例如，刘清萍等［10］利用钠升电喷雾串联质谱法对从Sigma公司购买的标准肽（GLU1）-FIBRINOPEPTIDEB（Glu-fib）进行了测序，采用钠喷针进样，TOFMS扫描，得到Glu-fib的（M+2H）2+的离子峰（***2），用Micromass的专用解谱软件MasSeq直接解析其序列为EGVNDNEEGFFAR，与Glu-fib的序列完全吻合。这种方法可以方便有效的解决传统的Edman降解法测序中常见的实际问题，如末位残基的丢失，赖氨酸和亮氨酸难鉴定等，此方法的建立是对Edman降解测序法很好地补充。
2糖基化修饰
植物中超过一半的蛋白质是糖基化形式。糖基化修饰能改变蛋白质的生理化学特性，如耐热性、功能活性、蛋白折叠、转运和半衰期等。在植物蛋白中N-糖基化是一种常见的糖基化形式［11，12］，一般为Asn-Xxx-Ser/Thr序列形式或较少见的Asn-Xxx-Cys序列形式（其中Xxx是除了Pro以外任意的氨基酸）。一般情况下，糖基化情况不同会导致蛋白生理化学性质的改变。在转基因植物中蛋白一般不会特异地进行糖基化，且大肠杆菌中表达的重组体蛋白也没有糖基化［13］。因此，如果能证明两种蛋白都不存在糖基化，也能证明两种蛋白在功能上具有等同性。典型的植物N-糖基化形式较复杂，并且每个糖基化基团增加1-2kD的质量［14］。通常检测植物蛋白糖基化基团的方法有：Westernblot免***杂交分析、氨基酸序列分析、蛋白高效液相色谱分析、红外光谱（FT-IR）分析、电镜扫描***谱（SEM分析）等。***3就是一张从重组大肠杆菌和转基因玉米GA21叶片提取液中得到的mEPSPS蛋白的糖基化免***杂交***［4］，结果证明两种mEPSPS蛋白都没有糖基化，因此通过Westernblot检测可以获得比较植物蛋白和微生物蛋白糖基化状态的证据。
3生物活性
3.1酶蛋白活性
许多转基因蛋白都是酶类，证明转基因蛋白和微生物蛋白的活性具有等同性非常重要。酶的活力用酶单位表示，一般经常用酶联免***吸附试验（ELISA）来检测酶活力。但是，ELISA试验不能区别活性蛋白和非活性蛋白，从而使酶活力结果不准确。因此，为了提高检测的准确性，在分离纯化转基因植物表达蛋白时用原始的植物提取液来进行试验。另外，需要考虑的是植物样品中的蛋白酶和次级代谢产物，以及提取过程中pH的迅速改变等，这些因素都会影响酶的活力。在比较微生物和植物蛋白酶活力时，最好用原始的转基因植物提取液与混合了非转基因植物提取液的微生物蛋白进行研究。例如，草甘膦抑制5-烯醇式丙酮蟒草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，这种酶可以催化莽草酸合成芳香族氨基酸过程。在转基因玉米GA21中表达一个经过改造的mEPSPS，其中由于两个氨基酸的替换，降低了草甘膦和mEPSPS的结合能力，从而产生草甘膦抗性［15］。微生物表达的mEPSPS蛋白酶活力是植物酶的9倍（表2）。然而，当微生物表达的酶和非转基因玉米提取液混合时，酶活力只是植物酶的2倍，表明玉米提取液抑制了mEPSPS的活性。这为利用微生物表达的mEPSPS是否适合代替植物表达的EPSPS来进行风险性研究提供了重要的信息。
3.2杀虫蛋白活性
杀虫蛋白的活性由一定时间内杀死给定试验幼虫的毒蛋白浓度或者剂量来衡量，一般由LC50来表示，即在一定时间内杀死暴露在毒蛋白中50%敏感幼虫的毒蛋白浓度。由于不同幼虫个体间会有些许不同，因此生物活性检测的结果也会不同。为了降低外来因素的干扰，植物和微生物杀虫蛋白的杀虫活力检测应当在统一的条件下进行，并且幼虫的来源也要统一，且随机分配到不同处理中。徐海滨等［5］证实大肠杆菌表达的Cry1Ie蛋白杀虫活性较强，与宋福平等［18］的试验结果大体一致（表3）；纯化Cry1Ie蛋白对玉米螟的生长抑制明显，与转cry1Ie玉米叶片所进行玉米螟虫试结果有良好的一致性，表明纯化Cry1Ie蛋白与转cry1Ie玉米表达的抗虫蛋白在生物活性上具有相似性。目前，大部分商业化的转基因作物以表达酶类或者毒素蛋白为主，检测这些蛋白活性的方法相对较简单，但转基因作物新的特性需要检测方法不断改进更新。例如，一种增加玉米水利用效率的方法是在玉米中表达一种来自于枯草芽胞杆菌的冷休克蛋白（CSPB），CSPB结合到单链DNA或RNA上，由于这种蛋白可打开DNA双链，其结合活性可通过一个标记的双链探针发射出的荧光检测［19］。这种方法已用来测定微生物和植物表达的CSPB蛋白的等同性。微生物蛋白与转基因植物蛋白等同性的确定是为了利用微生物蛋白进行转基因作物的风险性评估。例如，杨辉等［20］在进行转基因表达蛋白的急性毒性试验时，一般以啮齿类动物（通常是小鼠）一次性高浓度经口暴露，观察时间为14d，对于EPA和OECD，建议在急性经口毒性试验中采用的剂量分别为2000和5000mg/kg。显然，从转基因植物中获得如此高的纯化蛋白是不可能的，而当确定微生物蛋白和植物蛋白具有等同性之后，通过微生物表达蛋白就可以达到目的。本研究室与其他相关实验室合作，开展了微生物蛋白的纯化工作，通过构建Cry1Ie蛋白表达载体，在大肠杆菌表达菌株BL21中大量表达纯化Cry1Ie蛋白，以证明Cry1Ie蛋白在转基因玉米中的安全性，同时做好安全性评价工作。
4结语
蛋白篇5
1、每百克鸡蛋含蛋白质12.58克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，其中含有人体必需的8种氨基酸，并与人体蛋白的组成极为近似，人体对鸡蛋蛋白质的吸收率可高达98%。
2、每百克鸡蛋含脂肪11～15克，主要集中在蛋黄里，也极易被人体消化吸收，蛋黄中含有丰富的卵磷脂、固醇类、蛋黄素以及钙、磷、铁、维生素A、维生素D及B族维生素。这些成分对增进神经系统的功能大有裨益，因此，鸡蛋又是较好的健脑食品。
3、一个鸡蛋所含的热量，相当于半个苹果或半杯牛奶的热量，但是它还拥有人体每天所需8%的磷、4%的锌、4%的铁、12.6%的蛋白质、6%的维生素D、3%的维生素E、6%的维生素A、2%的维生素B、5%的维生素B2、4%的维生素B6。
4、这些营养都是人体必不可少的，它们起着极其重要的作用，如修复人体组织、形成新的组织、消耗能量和参与复杂的新陈代谢过程等。
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蛋白篇6
fxyd基因家族蛋白是一类小分子的单跨膜蛋白， 有离子通道或离子通道调节的作用，和na+?k+?atp酶的结构功能密切相关。为适应不同组织的生理功能，na+?k+?atp酶动力学和fdxy基因蛋白的表达因组织部位的不同而异。fxyd基因及其蛋白的生物学特性、生理功能和调节的研究，有助于进一步了解fxyd及其亚群的作用和功能。本文就fxyd基因家族蛋白特别是fxyd6的新近研究进行综述。
1 fxyd基因蛋白家族
1.1 fxyd基因蛋白家族的结构与命名 fxyd基因蛋白家族系指包含fxyd 结构的离子转运调节蛋白因子，属于不溶于水的小分子 (66～178氨基酸) i型膜蛋白, 其结构包含有细胞外固定的fxyd序列的单跨膜片段，为离子通道或离子通道调节器［1，2］。fxyd基因家族编码的信号序列含有35个氨基酸，初始序列为脯氨酸?苯丙氨酸?x?酪氨酸?天冬氨酸，根据氨基酸编写代码简写为p?f?x?y?d， 包括7个不变氨基酸，6个高度保守的氨基酸序列。其中脯氨酸在一些脊椎动物中不确定， x为可变氨基酸，通常是酪氨酸，也可以是谷氨酸、苏氨酸或组氨酸。至今已发现的fxyd家族蛋白有12个亚群成员［1～4］，按发现时间顺序先后命名，分别表示为fxyd1、fxyd2、fxyd3、… …fxyd12。
1.2 fxyd基因蛋白家族的组织表达 所有fxyd基因在胚胎早期均有表达， 广泛的分布于哺***动物的组织内，成年后则主要在转运流动性液体和溶质的组织器官中表达，如肾、***、胰腺、前列腺、结肠、肝、肺和胎盘；在电兴奋组织，如神经系统和肌肉中亦有表达［5］。但fxyd蛋白亚群的表达有其组织依赖性和特异性（表1），辅fxyd蛋白是调节na+?k+?atp酶的重要成分。根据分析标记的氨基酸顺序，对于保守的小分子的膜蛋白的分析，种系发生学研究鉴定发现有8个表达的fxyd 蛋白亚群, 包括fxyd2、 fxyd5、fxyd6、 fxyd7、 fxyd8、fxyd9、fxyd11 和 fxyd12。用定量pcr技术就不同fxyd蛋白亚群在鱼鳃、肾脏、小肠、心脏、肌肉、大脑和肝脏表达进行分析，提示fxyd5和fxyd9在各种组织均有表达，而另外6种蛋白亚群的表达则是呈散在性的分布。在神经兴奋性的组织中，fxyd5 和 fxyd9在大脑中高度表达，fxyd8在骨骼肌中表达。在渗透调节组织中，fxyd11主要在鱼鳃组织内表达，fxyd2 在肾脏中表达，而fxyd12在肾脏和小肠组织表达。几种fxyd的亚群基因在淡水三文鱼肾脏和鳃组织中表达有别于海水三文鱼，提示渗透调节的适应性。新近研究发现fxyd亚群基因在任何硬骨鱼中的表达及其盐浓度的调节有特异的组织依赖性［5］。
1.3 fxyd蛋白和na+?k+?atp酶的协调作用 fxyd蛋白的功能为离子运输通道或离子通道调节器，na+?k+?atp酶的组织特异性调节亚群。fxyd蛋白常和na+?k+?atp酶的 α和β同工酶相互作用，通过调节na+?k+?atp酶对k+ 亲和力， 协助na+?k+?atp酶发挥作用［6］。 na+?k+?atp酶属于p型atp酶蛋白家族，在催化反应中形成磷酸化反应，该酶位于浆膜内，利用水解atp释放的能量，将细胞内的3个钠离子转运出细胞外，同时将2个钾离子转运到细胞内。na+?k+?atp酶是低聚物蛋白，催化反应的亚单位转运阳离子，水解蛋白，是强心苷药物反应的受体。ii型糖化蛋白亚基在合成蛋白时和调节方面，参与协同蛋白分子插入正确的细胞膜的位置。已经鉴定na+?k+?atp酶参与维持钠钾离子的跨膜梯度，维护细胞的容积和膜势能,钠离子梯度提供依赖于钠离子的转运系统的能量,调节细胞内的ph值和细胞内钙离子浓度。 该酶存在于所有的细胞内保证细胞内动态平衡,保证特殊部位的细胞的功能。 fxyd10 位于细胞胞浆内，是和na+?k+?atp酶的反应部位，蛋白激酶的磷酸化部位，磷酸化反应参与胞浆内fxyd10 和na+?k+?atp酶作用的中度的结构改变［7］。 表1 fxyd基因蛋白家族的生物学特性
2 fxyd6蛋白
2.1 fxyd6蛋白的结构和表达部位 fxyd6基因定位于11号染色体长臂（11q23.3），作为fxyd蛋白家族组成之一，fxyd6蛋白是含fxyd 域离子运输调控因子6，其跨膜蛋白含有35个恒定不变的氨基酸保守序列，推断的fxyd6蛋白含95个氨基酸，其氨基酸的分布顺序是：信号肽1～18氨基酸，胞外区19～38氨基酸，跨膜区39～56氨基酸，胞内区57～95氨基酸。细胞分布部位而言，fxyd6分布于细胞的胞外区、细胞膜和细胞融入膜；其组织器官分布，fxyd6广泛的分布于除血液以外的几乎所有组织，但在大脑组织中有高表达，特别是额叶前部皮质、 杏仁核、 下丘脑、海马和小脑枕叶［8］，参与出生后神经的兴奋性。日本学者报告fxyd6 和大鼠跨膜蛋白fxyd1 有48.1%的同源性。用纯化大鼠fxyd6蛋白碳端序列的多克隆抗体进行发生学研究，结果提示在大鼠出生后3周fxyd6的表达在大脑最高，并一直延续到成年大鼠，提示fxyd6对于生后大脑和成熟大鼠大脑的神经元的兴奋性有很大的作用。
2.2 fxyd6和精神病的易感性 根据对于伦敦大学496例病人和488例正常人的研究，发现在dxyd6基因内或旁有7个微小卫星或单核苷酸多形性标志和精神病易感性有关，一些单倍体等位基因和精神病发生有关，报告染色体11q22～q24 区域存在有患精神病的易感基因区域，认为fxyd6基因的碱基对改变或基因的促进子控制子区域变化引起fxyd6蛋白的功能异常，提高对于精神病的易感性［9］。然而，日本学者研究2 026名日本人（906例精神病患者，1 120例正常对照），发现精神病患者和正常人在等位基因、遗传型基因方面无相关性，认为fxyd6 对于日本人发生精神病无相关性［10］。
2.3 fxyd6与内耳听神经的平衡功能 na+?k+?atp酶是内耳耳蜗势能产生和维持的重要酶，fxyd6调节内耳内的na+?k+?atp酶， rt?pcr研究提示fxyd6以2个剪接变体（splice variant）的方式存在，当在蟾蜍卵母细胞表达fxyd6后，该2个剪接变体蛋白和na+?k+?atp酶反应。fxyd6在和内淋巴自身平衡有关的各种表皮细胞，听神经元旁边的表皮细胞上表达。fxyd6和na+?k+?atp酶的反应有助于产生和维持内淋巴的内耳蜗势能和离子成分［11］。
2.4 fxyd6和肿瘤 研究提示fxyd3在许多肿瘤组织中高度表达，而新近的研究亦显示fxyd6在一些肿瘤组织内表达，但是否有可能作为肿瘤诊断的标志物尚需进一步研究。 有人通过差异显示pcr方法［12，13］，发现人fxyd6 mrna表达与胆管癌分化程度呈负相关；人fxyd6蛋白与胆管癌分化相关，从正常胆管、高分化胆管癌到低分化胆管癌，hfxyd6 表达量依次递增。原位rt?pcr检测表明人fxyd6基因定位于胆管癌上皮细胞胞浆内，在肿瘤细胞中的表达明显高于在正常胆管细胞中的表达。人fxyd6基因在胆管癌的转化、演进过程中可能起重要作用［14］。研究［14］提示人fxyd6反义核酸抑制人胆管癌qbc939细胞体外增殖活性，但对其侵袭能力无明显影响。fxyd6在病理诊断明确的人胰腺癌组织内有明显的表达［15］。
【参考文献】
［1］ wang pj, lin ch, hwang hh,et al. branchial fxyd protein expression in response to salinity change and its interaction with na+/k+?atpase of the euryhaline teleost tetraodon nigroviridis［j］.j exp biol, 2008, 211(pt 23):3750?3758.
［2］ cornelius f, mahmmoud ya. modulation of fxyd interaction with na, k?atpase by anionic phospholipids and protein kinase phosphorylation［j］.biochemistry, 2007 ，46(9):2371?2379.
［3］ kadowaki k, sugimoto k,yamaguchi f,et al. phosphohippolin expression in the rat central nervous system［j］.mol brain res, 2004, 125: 105?112.
［4］ lubarski i, karlish sj, garty h.structural and functional interactions between fxyd5 and the na+?k+?atpase［j］.am j physiol renal physiol, 2007,293(6):f1818?1826.
［5］ christian k?lb?k tipsmark. identification of fxyd protein genes in a teleost: tissue-specific expression and response to salinity change［j］.am j physiol regul integr comp physiol,2008， 294（6）: r1367?r1378.
［6］ li c，grosdidier a, gramber g,et al.structual and functional interaction sites between na, k?atpase and fxyd proteins［j］.j biol chem, 2004, 279(37):38895?38902.
［7］ cornelius f, mahmmoud ya. modulation of fxyd interaction with na, k?atpase by anionic phospholipids and protein kinase phosphorylation［j］.biochemistry,2007 ，46(9):2371?2379.
［8］ sweadner kj, rael e. the fxyd gene family of small ion transport regulators or channels: cdna sequence, protein signature sequence, and expression［j］.genomics, 2000, 68: 41?56.
［9］ choudhury k, mcquillin a, puri v,et al.a genetic association study of chromosome 11q22?24 in two different samples implicates the fxyd6 gene, encoding phosphohippolin, in susceptibility to schizophrenia［j］.am j hum genet, 2007,80：664?672.
［10］ delprat b, schaer d, roy s,et al. fxyd6 is a novel regulator of na,k?atpase expressed in the inner ear［j］.j biol chem, 2007，282(10):7450?7456.
［11］ ito y, nakamura y, takahashi n,et al. a genetic association study of the fxyd domain containing ion transport regulator 6 (fxyd6) gene, encoding phosphohippolin, in susceptibility to schizophrenia in a japanese population［j］.neurosci lett, 2008, 438(1):70?75.
［12］ 张效东, 周宁新, 卢柏松, 等. 不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究［j］.中华外科杂志, 2002，40（5）:399.
［13］万涛, 倪彬, 刘建伟，等.人胆管癌相关基因ccr?l2/fxyd6大片段克隆与鉴定［j］.中华实验外科杂志,2003,20(5):393?395.
蛋白篇7
都叫白蛋白但是有区别
甄健存主任说，人体内的白蛋白是由肝脏合成，释放到血液中，是血浆中含量最多的蛋白质。血浆中白蛋白15～19天之后会被分解成为更小的氨基酸，各个组织器官会利用这些氨基酸来合成营养物质。血中的白蛋白被分解后，肝脏就会释放新合成的白蛋白，这样就可以维持血液中的白蛋白在一个稳定的范围内。而我们所购买的人血白蛋白一般是指人血白蛋白注射液，这种白蛋白是由经乙型肝炎***苗免***的健康人血浆或血清，经工业方法提取后制成的注射液。
甄健存把肝脏比做是白蛋白的生产工厂，她说，各个组织器官是白蛋白的使用者，生产消耗达到平衡，保证血液中有一定数量的白蛋白。如果生产厂出了问题，其使用者仍旧按照速率使用血液中的白蛋白，血液中的白蛋白就会因为没有补充而降低。如果使用者变多了或是用量变大了，很自然的生产厂若是供应不上血液中的白蛋白同样也会减少。
作为生产厂的肝脏利用从为胃肠道吸收的各种养分合成白蛋白，若是吃的过少或是营养不均衡都会导致原料减少。俗话说巧妇难为无米之炊，少了原料，肝脏这个生产厂也不能生产出足够的白蛋白以供使用。当生产厂中的生产机器发生故障时，也会引起白蛋白产出减少。
人血白蛋白注射液有适应人群
人血白蛋白主要用于重症病人消除水肿和有毒物质排出。在临床上用于以下几种疾病：1、失血创伤、烧伤引起的休克；2、脑水肿及损伤引起的颅压升高；3、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；4、低蛋白血症的防治；5、新生儿高胆红素血症；6、用于心肺分流术、烧伤的辅助***、血液透析的辅助***和成人呼吸窘迫综合征。
甄健存说，通过这些适应症，可以看出人血白蛋白是用于十分危重患者的，不是一般患者，更不是健康人。符合适应症的危重患者输入人血白蛋白可以改善病情甚至“救命”，但是健康人或是不符合适应症的患者输入人血白蛋白不但不会“救命”，可能造成更大的损失，轻者损失金钱，重者甚至“丧命”。
人血白蛋白注射液有不良反应
人血白蛋白虽然是人体内本来就有的物质，但是由于人血白蛋白这种药品是由别人的血液中得来，也就是异体蛋白。我们都知道，很多人对牛奶或是别的动物的蛋白质都会有过敏的现象，所以，人血白蛋白也不例外，有的患者可能会对他产生过敏反应。甄健存说，人血白蛋白的过敏反应可以是轻度的皮疹，也可以是严重的过敏性休克，甚至还可以导致死亡。应用人血白蛋白还可能对心、肺、肾等脏器造成损伤，加重疾病，延长住院时间、增加住院费用。
甄健存强调，任何输液在制作和配置中，都会引入肉眼看不见的很多微粒，而这些微粒进入体内是永远不会被排出的。每次输液都会在体内留下很多肉眼看不见的微粒，久而久之他们会聚集变大，停在肺或是别的器官的小血管中，成为人体内的“定时炸弹”。对于病患，输液是一种***手段，目的是让患者摆脱病魔，恢复到健康状态。健康人就没有必要往自己体内放置这些“定时炸弹”了。
不是随便哪个医生就能开的
医疗保险对于使用白蛋白是有要求的：重症患者血清白蛋白低于25g/L；肝硬化腹水或胸水患者、癌症胸水/腹水者血清白蛋白低于30g/L；需维持较高胶体渗透压的大手术，限60g。限制在二级以上医院使用。
通过医疗保险的规定我们可以知道，人血白蛋白不是随便哪个医生就能开出的，必须是二级以上的正规医疗机构才能使用。而在重症患者应用时，还要对血清白蛋白进行测定，结合患者病情开具。甄健存说，从国家的管理上来说，如此严格的规定也是有道理，一方面白蛋白是由健康人的血液制得的，现阶段健康人血液的来源比较紧张，全国都处于血液紧缺的阶段，应该把有限的资源留给最需要的人；另一方面，血液制品使用有一定风险性，使用不当可能出现危及生命的反应。所以作为医务人员我们要严格把握适应症，而作为患者不要迷信白蛋白，过度医疗。
人血白蛋白对免***系统影响十分微弱
据资料，免***系统是人体一个复杂的系统，由很多种细胞和器官组成。血液中的球蛋白是免***系统的一部分，是免***反应的一个环节，而体内的白蛋白对于球蛋白确实有一定的保护作用。但是，健康人本身白蛋白正常，额外的输入白蛋白不会对球蛋白起到促进作用，对免***系统影响十分微弱。
不要盲目迷信白蛋白
蛋白篇8
尽管目前研究肿瘤的报导很多，肿瘤发病的分子机制仍不清楚。硫氧还蛋白结合蛋白-2 (TRX-binding protein-2，TBP-2)又被称为维生素D3上调蛋白1(Vitamin D3 up-regulated protein 1，VDUP1)或硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein，Txnip)，它与硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)的活性部位结合，抑制其活性，除了参与多种氧化应激反应，还具有多种生物学功能。最近的研究显示：TBP-2与肿瘤密切相关，有些肿瘤组织中，TBP-2表达降低或缺失。TBP-2表达增高时，细胞周期停滞，肿瘤细胞繁殖受到抑制。因此，它已成为近年肿瘤研究的重要靶点。
1硫氧还蛋白结合蛋白-2与硫氧还蛋白
1.1TRXTRX分子量12 kD，高度保守，在各种细胞和组织存在。TRX、TRX还原酶(TRX reductase，TrxR)和还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)组成TRX系统。TRX依赖NADPH和TrxR还原二硫键、清除活性氧自由基，维持细胞内氧化还原状态〔1〕。TSX还可以调节转录因子与DNA的结合活性，如核转录因子-κB(nuclear factor κappaB，NF-κB)，糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor)，活化蛋白-1(activate protein-1，AP-1)，p53等〔2，3〕。它可以抑制p38和凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK-1的)的活性，从而具有抑制细胞凋亡的作用〔4〕。TRX在肺癌、子宫颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、***癌等癌症组织中表达增高，并且表达水平与肿瘤生长呈正相关。淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞及多种癌细胞分泌TRX，诱导其自身生长。此外，TRX 还与抗癌药物的耐药性有关。例如，TRX高表达的成人T细胞白血病细胞、人肝癌细胞分别表现出对抗癌药物的耐药性; TRX反义表达质粒转染细胞使细胞内TRX降低，膀胱癌和前列腺癌细胞对丝裂霉素C 的耐药性也减少〔5〕。这些均说明TRX与肿瘤生长及肿瘤细胞的凋亡密切相关。
1.2TBP-2TBP-2又称为VDUP1或Txnip，分子量为46 kD。TBP-2与TRX活性区的两个半胱氨酸残基结合，抑制TRX的活性，例如，TBP-2高表达时TRX活性降低近50%，因此，某种程度上它是TRX负调控因子。有趣的是，TBP-2高表达时TrxR活性也降低，进一步导致TRX还原作用降低〔6~8〕。就分布而言，TBP-2广泛存在于多种组织中，如脑组织、肾上腺、心脏、肺组织、胸腺、脾脏、睾丸、骨骼肌、肾脏、肝脏、***、卵巢等，它在肺组织中表达量相对较高〔9〕，而在脑组织和肝脏中表达量相对较低〔10〕。TBP-2主要存在于细胞质和细胞核中，但细胞培养条件不同时，TBP-2在细胞内分布不同。细胞密度低时，TBP-2存在于细胞 质和细胞核中，而当细胞的密度高时，TBP-2则主要存在于细胞核中〔6〕。TBP-2的表达在多种条件下改变，例如，H2O2、射线、UV、生长抑制剂、热刺激、抗癌药、低血清均诱导细胞中TBP-2表达〔11〕。
1.3TBP-2与TRX的相互作用最初发现TBP-2是由于TBP-2与TRX的活性位点结合，这意味着TBP-2活性与氧化还原有关
。增殖相关基因(proliferation-associated gene，PAG) 又称过氧化物酶1(peroxiredoxin I)。它是硫醇基特异性抗氧化剂，可以抑制由神经酰胺及无血清培养诱导的细胞凋亡，并具有促进细胞繁殖的作用。当细胞中存在TRX时，PAG作为中间电子供体还原H2O2。但当细胞中TBP-2高表达时，PAG与TRX之间的作用减少近60%，此时细胞易受氧化应激损伤而发生凋亡〔9〕。ASK-1是c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-***素活动蛋白质激酶(MAPK)激活因子，在氧化应激诱导的细胞凋亡中起关键作用。TBP-2表达增加会竞争性抑制TRX与ASK-1的结合，从而使ASK-1从TRX分离，ASK-1得到活化，最终导致细胞凋亡〔9〕。因此，TBP-2不仅参与细胞氧化还原的调节，而且在细胞凋亡过程中起重要的作用。
2TBP-2与肿瘤的相关性
临床研究提示TBP-2在肿瘤组织中表达减少或者缺失〔8〕。并且，TBP-2高表达的癌细胞表现出细胞周期滞留，生长缓慢。提示了TBP-2表达与肿瘤发生密切相关。
2.1TBP-2与肿瘤发生在人类T细胞白血病I型病毒(Human T-cell leukemia virus type I，HTLV-I)转染的白细胞介素-2( IL-2)非依赖型T细胞中，TBP-2表达降低，这说明TBP-2与T细胞生长及白血病形成密切相关〔12〕。 Sheth等人研究表明，TBP-2基因突变的肝细胞癌变率明显增高，在TBP-2缺失的雄性小鼠中40%最终发展为肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC
)，这些研究结果表明TBP-2基因突变或缺失能引起肝细胞肿瘤，进一步揭示了HCC发生的分子机制〔13〕。在N-甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)静脉注射雌鼠形成雌激素依赖的***瘤中，TBP-2表达减少，在这种情况下肿瘤发生与雌激素无关〔10〕。Han SH等人对***癌、肺癌、胃癌三种典型性恶性肿瘤进行了研究，在这三种正常组织中TBP-2均高表达，而在这些癌变组织中TBP-2表达减少或者缺失。本课题组最近的研究结果：在***癌病人中，癌症组织中TBP-2的表达比周边正常组织明显降低(文章待发表)。转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)具有促进癌细胞转化抑 制肿瘤细胞生长的作用，TGF-β1刺激胃癌细胞株(SNU-16和SNU-620)后，细胞中TBP-2表达增高，细胞增殖随药物作用时间延长而减少〔6〕。这些研究表明，TBP-2不仅与肿瘤的发生有关，而且，在抗癌药物中发挥着重要的作用。
2.2TBP-2与细胞凋亡神经酰胺通过诱导ASK-1调节p38-MAPK及JNK磷酸化，并激活细胞内质网应激，诱导JurkatT细胞凋亡，然而，当细胞中TBP-2表达缺失后，ASK-1活性降低，细胞凋亡减少〔9〕。 Chen等人研究发现TBP-2表达缺失小鼠表现为低血糖和β细胞团块增加，并且由糖尿病导致的β细胞凋亡随之减少。有趣的是，在β细胞中TBP-2缺失活化了Akt/Bcl-2xL信号通路，由线粒体诱导的β细胞凋亡途径降低，因此，抑制糖尿病的发生〔14，15〕。Billirt等人用过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂GW929，刺激人巨噬细胞(HMDM)发现细胞中TRX表达降低，TBP-2表达升高，在使用干扰RNA减少TBP-2表达后，细胞中BAX与BCL-2比值降低，caspase-3活性随之减少〔16〕。这些实验结果均表明，TBP-2与p38-MAPK和JNK Akt/Bcl-2xL等途径诱导的细胞凋亡密切相关。
2.3TBP-2与细胞周期在高密度或无血清条件下培养细胞时，TBP-2启动子活性增强，细胞中TBP-2表达增高，细胞周期滞留在G0-G1期。然而，转染TBP-2的细胞中 sub-G1部分并不增多，单独TBP-2高表达不能诱导细胞凋亡。 而TBP-2高表达却抑制了细胞周期素A2(Cyclin A2)的活性。 说明TBP-2通过抑制细胞周期调节细胞生长〔6〕。Cyclin A2是细胞进入S期的必须蛋白质，当细胞进入G1-S期时Cyclin A2的表达量开始逐渐升高直到G2-M期为止〔17〕。辅抑制蛋白，如：早幼粒细胞白血病锌指蛋白 (Promyelocytic leukemia zinc-finger，PLZF)、胱氨酸贫血锌指蛋白( Fanconi anemiazinc-finger，FAZF)、组蛋白乙酰基转移酶1蛋白( histone deacetylase1，HDAC1)等可以抑制Cyclin A2启动子活性，进一步抑制Cyclin A2表达〔18〕。Han等证实，TBP-2与辅抑制蛋白结合，是辅抑制蛋白的一部分。当它与辅抑制蛋白相互作用时，辅抑制蛋
白活性增强，细胞周期滞留在G0~G1期〔6〕。TBP-2表达与Cyclin A2启动子活性密切相关，它从某种程度上间接抑制了Cyclin A2活性从而影响细胞周期。p27kip1为细胞周期依赖激酶抑制剂，它能有效拮抗CyclinA周期素依赖蛋白激酶(CD
K)系统，阻断细胞G1-S期转换。细胞中p27kip1与P53协同作用抑制肿瘤细胞生长〔19〕。在恶性肿瘤细胞中，p27kip1表达明显减少〔20〕。Tomoda等人实验证明，Jun活化结构域结合蛋白1(JAB1)诱导p27kip1从细胞核转移至细胞质〔21〕，肿瘤发生与细胞质中p27kip1高表达密切相关〔22〕。TBP-2通过羧基(COOH)与JAB1结合，抑制JAB1诱导的p27kip1转移，增加p27kip1在细胞核的稳定性〔23〕，从而最终导致p27kip1抑制细胞周期由G1期向S期的转化。TBP-2诱导细胞周期滞留还同细胞周期依赖激酶p16有关，在转染TBP-2的细胞，TBP-2表达增加，细胞中p16表达亦随之增加，p16结合并抑制CDK4和CDK6对Rb蛋白的磷酸化作用，Rb蛋白磷酸化作用减少，细胞周期滞留在G1~S期〔12〕。
2.4TBP-2与细胞分化
用TGF-β1或1，25-羟基维生素D3〔1，25(OH)2D3〕刺激人急性早幼粒细胞白血病细胞株(HL)-60白血病细胞，细胞分化标志物CD14表达量升高，细胞分化。同时，TBP-2表达明显升高，细胞生长停滞。为了证实TBP-2表达升高在细胞分化中的作用，单独转染TBP-2到HL-60白血病细胞中，高表达的TBP-2不影响细胞分化标志物CD14的表达及HL-60白血病细胞的分化。 因此，该研究结果表明TBP-2是通过抑制细胞生长而发挥抗肿瘤的活性〔6〕。然而，Lee KN研究报道：在TBP-2缺失小鼠中T细胞和B细胞的分化没有受到影响，而自然杀伤细胞(natural killer，NK)细胞分化标志物CD122的表达降低，NK细胞的数目及活性也随之减少，并且NK细胞抑制肿瘤的作用受到抑制〔24〕，这说明TBP-2 在NK细胞分化和和抗肿瘤的功能中起重要的作用。因此，TBP-2还可能通过调节免***细胞分化而起到抗肿瘤的作用。
3结论
近年来随着对TBP-2研究的逐步深入，发现TBP-2不仅参与氧化还原反应，而且与细胞生长、分化、凋亡密切相关。它可以通过抑制TRX的活性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞周期等，调节免***细胞分化等在肿瘤的发生和生长过程中起重要作用，因此，它将会成为抗肿瘤***过程中一个重要靶点。TBP-2诱导物将会成为有效***的方法。
参考文献
1Holmgren A.Thioredoxin structure mechanism:Conformational changes on oxidationof the active-site sulfhydryls to a disulfide〔J〕.Structure，1995;3(3)：239-43.
2Hirota K，Murata M，Sachi Y，et al.Distinct roles of thioredoxin in the cytoplasm and in the nucleus.A two-step mechanism of redox regulation of transcription factor NF-kappaB〔J〕.J Biol Chem，1999;274(39):27891-7.
3Ueno M，Masutani H，Arai RJ，et al.Thioredoxin-dependent redox regulation of p53-mediated p21 activation〔J〕.J Biol Chem，1999;274(50):35809-15.
4LiuY，Min W.Thioredoxin promotes ASK1 ubiquitination and degradation to inhibitASK1-mediated apoptosis in a redox activity-independent manner〔J〕.Circ Res，2002;90(12):1259-66.
5 Kawahara N，Tanaka T，Yokomizo A，et al.Enhanced coexpression of thioredoxinand high mobility group protein1 genes in human hepatocellular carcinoma and thepossible association with decreased sensitivity to cisplatin〔J〕.Cancer Res，1996;56(23):5330-3.
6Han SH，Jeon JH，Ju HR，et al.VDUP1 upregulated by TGF-beta1 and 1，25-dihydorxyvitamin D3 inhibits tumor cell growth by blocking cell-cycle progression〔J〕.Oncogene，2003;22(26):4035-46.
7Nishiyama A，Matsui M，Iwata S，et al.Identification of thioredoxin-bindingprotein-2/vitamin D(3) up-regulated protein 1 as a negative regulator of thioredoxin function and expression〔J〕.J Biol Chem，1999;274(31):21645-50.
8Schulze PC，Yoshioka J，Takaiashi T，et al.Hyperglycemia promotes oxidativestress through inhibition of thioredoxin function by thioredoxin-interacting protein〔J〕.J Biol Chem，2004;279(29):30369-74.
9Chen CL，Lin CF，Chang WT，et al.Ceramide induces p38 MAPK and JNK activationthrough a mechanism involving a thioredoxin-interacting protein-mediated pathway〔J〕.Blood，2008;111(8):4365-74.
10Yang X，Young LH，Voigt JM.Expression of a vitamin D-regulated gene (VDUP-1) in untreated- and MNU-treated rat mammary tissue〔J〕. Breast Cancer Res Treat，1998;48(1):33-44.
11Takahashi Y，Nagata T，Ishii Y，et al.Up-regulation of vitamin D3 up-regulated protein 1 gene in response to 5-fluorouracil in colon carcinoma SW620〔J〕.Oncol Rep，2002;9(1):75-9.
12Nishinaka Y，Nishiyama A，Masutani H，et al.Loss of thioredoxin-binding protein-2/vitamin D3 up-regulated protein 1 in human T-cell leukemia virus type I-dependent T-cell transformation:implications for adult T-cell leukemia leukemogenesis〔J〕.Cancer Res，2004;64(4):1287-92.
13Sheth SS，Bodnar JS，Ghazalpour A，et al.Hepatocellular carcinoma in Txnip-
deficient mice〔J〕.Oncogene，2006;25(25):3528-36.
14Chen J，Hui ST，Couto FM，et al.Thioredoxin-interacting protein deficiencyinduces Akt/Bcl-xL signaling and pancreatic beta-cell mass and protects againstdiabetes〔J〕.FASEB J，2008;22(10)：3581-94.
15Chen J，Saxena G，Mungrue IN，et al.Thioredoxin-interacting protein:a critical link between glucose toxicity and beta-cell apoptosis〔J〕. Diabetes，2008;57(4):938-44.
16Billirt L，Furman C，Larigauderie G，et al.Enhanced VDUP-1 gene expressionby PPARgamma agonist induces apoptosis in human macrophage〔J〕.J Cell Physiol，2008;214(1):183-91.
17Pagano M，Pepperkok R，Verde F，et al.Cyclin A is required at two points inthe human cell cycle〔J〕.EMBO J，1992;11(3):961-71.
18Yeyati PL，Shaknovich R，Boterashvili S，et al.Leukemia translocation protein PLZF inhibits cell growth and expression of cyclin A〔J〕. Oncogene，1999;18(4)：925-34.
19 Philipp-Staheli J，Kim KH，Liggitt D，et al.Distinct roles for p53，p27Kip1，and p21Kipl during tumor development〔J〕.Oncogene，2004;23 (4):905-13.20Gstaiger M，Jordan R，Lim M，et al.Skp2 is oncogenic and overexpressed in human cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2001;98(9):5043-8.
21Tomoda K，Kubota Y，Kato J.Degradation of the cyclin-dependent-kinase inhibitor p27Kip1 is instigated by Jab1〔J〕.Nature，1999;398(6723):160-5.
22Chiarle R，Budel LM，Skolnik J，et al.Increased proteasome degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 is associated with a decreased overall survival in mantle cell lymphoma〔J〕.Blood，2000;95(2):619-26.
蛋白篇9
关键词：碱性蛋白酶 木瓜蛋白酶 协同水解 大豆蛋白
中***分类号：R84 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0085-03
1 引言
1.1 研究意义与目的
本实验以大豆蛋白为酶解底物，选择工业用酶―碱性蛋白酶和常用的木瓜蛋白酶进行深度水解，引入正交试验设计方法，借助数学模型统计分析获得较高水解度的综合方案，探讨制备小分子大豆肽的最佳工艺，为开发功能性大豆蛋白，拓宽其应用领域奠定基础。
1.2 技术路线
实验技术路线如下：
豆粕（粉碎）加水调浆水浴（90℃ 10min）水浴搅拌调pH
蛋白酶水解灭酶（90℃ 10min）调酸（pH4.5）离心（4000转 10min）
2 材料与方法
2.1 实验材料
碱性蛋白酶2.4L：食品级，酶活力2.4AU/g，丹麦NOVO公司出品；木瓜蛋白酶：食品级，酶活力2000U/g，西安Wolsen公司出品；低温脱脂豆粕：含水量7.9%，蛋白质含量51.49%，脂肪含量0.86%，山东万德福。
2.2 主要仪器和设备
水浴锅：DK―98―1型，天津市泰斯特仪器有限公司；pH计：pHSJ―4A，上海精密科学仪器有限公司；精密增力电动搅拌器：***―1，常周国华电器有限公司；自动电位滴定仪：ZDJ-4A，上海精密科学仪器有限公司。
2.3 试验方法
2.3.1 水解条件的研究
（1）大豆蛋白的酶解反应。1）大豆蛋白预处理。豆粕粉碎后加水调浆制成各浓度大豆蛋白溶液，在90℃温度下恒温水浴10min。2）大豆蛋白的酶解操作。称取豆粕粉加入适量水配制成为一定浓度的大豆蛋白溶液，经恒温水浴预处理后，调节温度至反应温度搅拌20min，调节pH值至反应值，加入一定比例蛋白酶，在反应温度下进行恒温酶解，酶解过程中需要不断进行搅拌，同时通过滴加1N的NaOH溶液以保持反应体系pH值恒定，反应偏差一般控制在±0.1。记录NaOH溶液的滴加量，利用pH-stat法计算水解度。
（2）酶组合顺序的考察。在酶催化水解反应中，以pH值、温度、底物浓度、酶用量对反应速度影响较大，而酶用量是针对溶液中蛋白质的含量，与底物浓度成正比关系，因此只需确定适当的pH值、温度、底物浓度[1]。碱性蛋白酶最佳水解条件：pH8.5，60℃，[S]6%，酶用量6.0，木瓜蛋白酶最佳水解条件：pH6.7，55℃，[S]5%，酶用量0.51[2]。
因此结合碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳水解条件，建立表2实验来对酶组合进行考察。
2.3.2 最优水解条件下产物的制备与测定
（1）水解产物的制备。
将大豆蛋白酶解液加热升温至90℃，保温10min 使酶活力丧失。冷却至室温后取酶解液调节pH至大豆蛋白等电点（pH4.5）后取一部分酶解液在4°C静置6-24h，以备观察其沉淀情况。另一部分通过离心机在4000r/min，离心10min，制得上清液和沉淀。
（2）水解产物的测定。
1）沉淀的测定。把离心后的部分沉淀（m1）称量后放入烘干箱（65℃）内干燥3h后冷却至室温，取出称重后，再按以上方法进行复烘，每隔30min取出冷却称重一次，烘至前后两次重量差不超过0.005g为止，平行试验三个。把干燥物取出，称量离心管（m2）至恒重，记录数据。
2）上清液的测定。测定离心后酶解液的上清液体积（v），倒出上清液测量体积并置于4℃冷藏保存，用凯式定氮法测定蛋白质含量。
2.3.3 统计研究方法―正交试验设计法
在碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解大豆蛋白时，其水解度会随着pH值、水解温度（T）、底物浓度（[S]）等因素的变化会有所不同[2]。确定三因素的取值水平范围，以水解度（DH）为指标，选用三因素三水平实行正交试验设计方案进行研究。
3 结果与讨论
3.1 碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解条件的考察
3.1.1 水解顺序的分析
根据表2做的实验结果如表3。
结合表2和试验结果表3可知，实验组三、四、五的DH要大于实验组一、二的DH，说明了双酶水解的水解程度要大于单酶水解的水解程度。DH7>DH5>DH6、DH10>DH8>DH9、DH13>DH11>DH12，说明在同温同pH同底物浓度下，双酶同时水解的水解程度要大于双酶前后水解的水解程度。DH13>DH10>DH7>DH3>DH4，说明在同温同底物浓度下，不同pH的双酶同时水解的最小水解程度仍然大于双酶单独水解最佳pH情况下进行的前后水解的程度。可以得出结论，双酶同时作用水解要比双酶前后作用水解程度大。
3.1.2 正交试验确定最佳水解条件
结合酶组合的考虑和各因素间的相互依赖、相互制约，进行正交试验以确定各参数的最佳组合即酶解大豆蛋白的最佳水解条件。这里用正交表，以水解度（DH%）为测定指标，双酶同时水解，拟定出试验方案表来考察三个因素对水解的影响，水解时间为5h。因素分析表如表4。
正交试验表如表5。
由正交试验结果表5看出，空列R的值小于其它各因素的的R，可以判定个实验因素的效应R是可靠的。极值R越大，则表示因素的水平变化对实验的影响越大，在实验中越重要。在影响碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的水解度的三个因素中，其影响程度大小为A>C>B，最优组合为A3B2C1。在此组合条件下水解5h，测得水解度为36.30%。故确定碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的最佳水解条件：pH值为8.5，底物质量浓度为5.0%，水解温度为55℃。
3.1.3 最佳水解条件下的水解曲线
由***1可知，在双酶协同水解的最佳水解条件，水解1h，为保持恒定的pH（8.5）而消耗的碱量最大，此后消耗的碱量逐渐减少。在水解6h的延长时间里，蛋白质酶解液水解程度随着时间的延长明显增加，而在水解的6h后水解速度几乎不变。在水解时间达到6.5h时，水解度达到了36.44%。随着时间的延长水解度虽呈上升趋势，但蛋白酶可水解的肽键逐渐减少，从经济方面和水解液苦味的考虑，确定最佳水解时间为5h。
3.2 最佳水解条件下水解产物的分析
沉淀结果分析：100ml大豆蛋白溶液可制得约10g豆渣。上清液结果分析：100ml原料蛋白溶液可制的可溶性蛋白质约为214.2mg。另在4℃静置6-24h的酶解液，其沉淀情况很好，可以明显的看出上清液和沉淀。
4 结语
（1）将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的结合水解大豆蛋白，水解程度明显高于单酶水解，双酶加入顺序为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶同时水解较优。（2）双酶水解大豆蛋白的最佳工艺条件为：pH8.5、温度55℃、底物浓度为5%、碱性蛋白酶加酶量为0.051%（W/V）、木瓜蛋白酶加酶量为6%（W/V），在反应时间为5h的条件下，酶解液中可溶性大豆蛋白含量为3.06mg/ml，水解度为36.30%。（3）各因素对水解度的影响由大到小依次为：pH对水解度的影响最大，其它因素的影响从大到小依次为底物浓度>温度>时间。
参考文献
蛋白篇10
关键词：持水性；汁液流失；骨架蛋白；降解
Effect of Postmortem Degradation of Cytoskeleta Proteins： Titin， Nebulin and Vinculin on Water-Holding
Capacity of Chilled Pork
QI Si-ka-na，ZHENG Wei，CHEN Tao，ZHANG Dong-yi
（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）
Abstract：Drip loss is an important measure of the water-holding capacity of raw meat， which is affected by many factors. However， there is only limited knowledge about the formation mechanism of its drip loss. This article reviews recent Chinese and foreign studies on the water-holding capacity of raw meat. This review highlights the postmortem degradation of cytoskeleta proteins： titin， nebulin and vinculin and the water-holding capacity of raw meat as a function of calpain activities， aiming at providing references for improving the postmortem water-holding capacity and quality of chilled pork.
Key words：water-holding capacity；drip loss；cytoskeletal protein；degradation
中***分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）03-0042-04
肉的质量指标主要包括颜色、滋味、质地、性和气味等，它能直观反映出肉的品质。动物屠宰后肌肉保持自身水分的能力被称之为持水性（WHC）。持水性与冷却肉的感官品质和肉类企业的经济效益密切相关，是冷却肉最重要的品质之一。有许多指标可用来衡量持水性，但汁液流失率（drip loss）和贮藏损失（purge loss）用的最多，其范围一般在0.1%～10%之间。
我国因人口众多，肉类产量已连续15年稳居世界第一位，2011年全国肉类总产量已达7957万t，其中猪肉占5053万t。冷却肉是指对严格执行检验检***制度屠宰后技术获得的可食用***进行迅速冷却处理，使***温度在24h内降至0～4℃，并在后续加工、流通和销售过程中温度保持在0～4℃范围内的鲜肉。冷却有安全系数高、营养价值高、感官舒适性高等优点，是我国肉类行业技术发展的重点之一[1]。20世纪80年代，我国开始了对冷却肉的研究与生产，但由于经济、技术等方面的原因，发展相对滞后。近年来，虽然我国的肉品工业得到了长足的发展，但始终使肉品销售者头疼的是，冷却肉普遍存在货架期短（仅3～5d）、表面易褐变，汁液流失严重、肉品持水性低，性差等问题[2]。由于冷却肉的持水性差，在加工、运输和销售过程中将产生大量的汁液流失，不但使产品重量减少，影响肉的外观、嫩度，给生产企业带来重大经济损失，同时大量的蛋白质流失还降低了肉的营养价值。肉在分割、储藏过程汁液流失率范围可达2%～10%之间[3]，据初步调查，目前我国冷却肉的汁液流失率为3.0～5.0%，平均比发达国家高出1.5%以上，每年因汁液流失造成的肉类重量损失折合人民币达数亿元。因此，如何将汁液流失率控制在最低限度以内是全球肉类研究者共同的目标。
1 肌肉中蛋白概述
1.1 肌肉中的水分和蛋白质
肌肉中的水分含量大约是75%，他们主要存在于肌原纤维中、肌原纤维间、肌原纤维与细胞膜间，细胞间和肌束间的空隙中[4]。水是两性分子，与蛋白质分子中的电荷相互吸引而结合在蛋白质分子上的称为结合水，占肌肉水分的很小比例；受空间效应的影响存在于肌肉中，但不与蛋白质结合的部分叫不易流动水；能在肌肉中自由流动，存在于肌细胞外间隙的水称为自由水。宰后，结合水基本不变；僵直成熟过程中，不易流动水受显著影响；肌肉转变成肉的过程中，受影响最大的是不易流动水。
肌纤维是骨骼肌的基本构成单位，主要由肌纤维膜、细胞核、肌浆以及大量的肌原纤维组成，其中肌浆约占肌细胞的30%，肌原纤维约占肌纤维的70%。肌原纤维由20%的蛋白质和80%的水组成，并且占有瘦肉中约80%的细胞空间[5]。肌肉中大量的水分与蛋白质的极性基团结合形成水合离子而储留在蛋白质的空间结构中，这是肌肉持水性的原因[6]。有报道指出，肌原纤维蛋白质的变性程度和持水性降低密切相关[7]。Greaser等[8]提出，猪刚屠宰时的肉的pH值接近7，约1h后开始下降，经僵直过程后，最低pH值于5.4～5.6之间，而后随着僵直解除及成熟时间的延长，pH值缓慢上升，肌纤维收缩减轻，持水力上升。同时另有报道指出，蛋白质的降解和肉的持水性也有关系[9]。
1.2 骨架蛋白概念及分类
骨架蛋白指的是把肌原纤维和细胞膜连接在一起，对肌肉收缩起到调节和稳定作用，以维持细胞结构的蛋白质。骨骼肌细胞骨架按位置不同可分为肌小节内骨架、肌小节外骨架和肌细胞膜骨架[10]。细胞骨架蛋白以细丝状存在，与粗丝和细丝平行排列，也叫间隙纤丝（gap filaments）。他们存在于肌原纤维的间隙，可以起到连接肌节的作用，当肌肉高度收缩时用电子显微镜能够观察到这种纤丝的桥梁作用[11]。肌小节外骨架主要由中等纤维（intermediate filaments）组成，它位于肌原纤维周围，连接于Z盘、核膜和肌细胞膜之间，包括肌间线蛋白（desmin）、巢蛋白（nestin）、核纤层蛋白（lamins）、波形纤维蛋白（vimentins）以及细胞角蛋白（cytokeratins）。其中，主要的肌肉特异性的中等纤维是肌间线蛋白。连接蛋白和伴肌动蛋白是肌小节内的主要骨架蛋白，肌细胞膜骨架蛋白包括跨膜的和与膜相连的蛋白，如纽蛋白（vinculin）、连接蛋白（intergrins）、膜收缩蛋白（spectrin）、抗肌萎缩蛋白（dystrophin），这些蛋白将肌细胞内的肌原纤维和胞外的基质间接联结起来，而其中的纽蛋白和连接蛋白与细胞肌膜中的核纤层蛋白有联结，在细胞内与微丝相联结，对细胞彼此间的附着具有重要作用。
2 骨架蛋白变化与持水性关系
2.1 汁液流失形成机理
国外在20世纪60年代开始研究冷却肉汁液流失形成的机理，人们认为，猪宰后僵直期间，由于pH值和钙离子的诱导使得肌原纤维收缩，使肌纤维内水分外流形成汁液流失[12-13]，新鲜猪肉的汁液流失率与僵直收缩程度、细胞膜渗透压等因素相关，研究发现，肌肉骨架蛋白质的变化和肉的持水性也有关系。
1995年，Huff-Lonergan等[9，14]研究表明宰后肌肉的蛋白质降解通常伴随着嫩度变化，也可能伴随着汁液流失。实验表明连接肌原纤维与细胞膜的蛋白（如肌间线蛋白）降解时，这些蛋白的收缩会导致肌原纤维网格结构收缩，最终导致整个肌细胞收缩，形成汁液流失通道，从而增加汁液流失[15]。因此蛋白质降解强度增大可能会阻碍肌原纤维收缩，从而减少汁液流失；Kristensen等[15]认为持水性的增加是由于骨架蛋白质的降解使肌细胞横向膨胀的结果；2004年Lawson[16]研究表明汁液流失通道形成于肌细胞膜和肌纤维分开的位置，此通道的形成是由于钙蛋白酶降解了肌动骨架蛋白和细胞膜之间的连接蛋白（intergrin）。但Sch?fer等[17]在研究宰后3～24h骨架蛋白变化与持水性关系时发现，肌肉骨架蛋白的降解与汁液流失无关。
可见，宰后肌肉蛋白质的降解和汁液流失的关系至今尚未搞清楚，对冷却肉汁液流失形成机理认识还十分有限。开展宰后肌肉蛋白质变化与冷却肉持水性的关系研究，有助于揭示冷却肉的汁液流失形成机理。
由于各骨架蛋白在肌肉中所处位置不同，起到的连接作用不同，对宰后肌肉持水性的影响也不尽相同，如肌联蛋白（titin）、伴肌动蛋白（nebulin）和纽蛋白（vinculin）。
2.2 肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解对持水性的影响
肌联蛋白是横纹肌中的弹性蛋白，约占肌原纤维蛋白质量的10%[18]，可能是细胞骨架蛋白的主要蛋白，也是目前所发现的最大的单链蛋白，其分子质量约为3000kD[19]，一个肌连蛋白分子可从Z盘到M线，长达1μm。肌连蛋白有两个主要作用：（1）通过连接各种蛋白质，控制肌节的各成分组成；（2）将粗肌丝与Z-线连接，以维持肌原纤维的完整性和稳定性，保持舒张肌肉的静息张力，使粗肌丝处于肌小节的中央位置，是受牵拉的肌肉可恢复初始状态和保证肌肉收缩的张力输出。在肉的成熟过程中，由于内源性酶的作用，肌连蛋白很易发生水解，这些内原酶包括钙激活酶（calpain）和羧基蛋白酶（carboxyprotease）[20]。
伴肌动蛋白（nebulin）的分子质量约为800kD[21]，其在肌原纤维蛋白中的含量约为5%[22]。当肌肉处于松弛状态时，伴肌动蛋白起源于Z盘，延伸至I带，连接于Z盘与Z盘之间，平行于A带中的肌动蛋白（actin），其主要作用是保持肌动蛋白的正常结构。此外伴肌动蛋白可以附着在间隙纤丝的连接蛋白上，在肌原纤维中起到结构和调节作用。
研究表明，每半个肌节中都有6个肌联蛋白和伴肌动蛋白，它们源于M线，螺旋缠绕于A纤丝，延伸至邻近Z线[22]。这两种蛋白在在宰后发生降解，他们的降解作用累加在一起可能会促使肌原纤维小片化，而肌原纤维小片化指数升高可能会导致肉嫩度的提高。Wang等[23]报道，宰后早期，肌联蛋白蛋白是成对存在的，即T1（未降解的肌联蛋白）与T2（肌联蛋白的大分子降解产物）。Huff-Lonergan等[24]经SDS-PAGE电泳对肌联蛋白和伴肌动蛋白蛋白研究知，宰后0～3d，T1与T2成对清晰可见，宰后3天T1降解，T2比T1更为清洗可见，并有分子质量1200kD的多肽降解物产生，且无完整的伴肌动蛋白条带。Rees等[25]发现宰后电刺激引起汁液流失增加的同时，SDS-PAGE电泳显示肌连蛋白的降解程度增加。2011年，Farouk等[26]报道，牛宰后21d内汁液流失增加，而随着储藏时间的延长汁液流失下降，同时，SDS-PAGE电泳显示，宰后21d起，有大量肌连及伴肌动蛋白降解产物生成。
2.3 纽蛋白的降解对持水性的影响
纽蛋白也是细胞骨架蛋白，其作用是连接肌动蛋白和细胞膜，呈弓肋状排列，位于Z线处，分子质量约为126kD[21]。2001年Kristensen等[15]经对猪骨架蛋白的Western Blot分析发现，宰后1d纽蛋白、踝蛋白（talin，225kD）开始降解，肌间线蛋白（55kD）未见降解，第4天踝蛋白降解了68%，而肌间线蛋白、纽蛋白只有轻微降解，到宰后10d，肌间线蛋白和纽蛋白降解了71%和63%；同时观察到宰后1d水分损失为3.9%，宰后3d升至11.9%（即持水性下降），7d后持水性增加，10d后持水性回升至4.5%。同时，他发现纽蛋白和肌间线蛋白、踝蛋白在宰后成熟过程中被水解，细胞骨架的破坏使得骨骼肌膜结构遭到破坏，将水向细胞外推斥的作用力不复存在，从而提高了肌肉的持水能力。
3 影响骨架蛋白降解的钙蛋白酶系统
钙蛋白酶是细胞内依钙中性半胱氨基酸巯基内肽酶，是由钙调蛋白和木瓜蛋白酶以非共价键结合成的嵌合体，主要分布在肌原纤维的Z盘附近。根据该蛋白酶表现最高活性所需的Ca2+浓度不同可将其分为μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶两种，二者均具有水解肌原纤维蛋白的活性。Koomaraie[27]发现在有Ca2+存在的情况下，钙蛋白酶会开始自溶，降低了满足其最大活性的Ca2+需要量，使其被激活。钙蛋白酶自溶时所需的Ca2+浓度与其表现蛋白质水解酶活性所需的Ca2+浓度很相近，且自溶的钙蛋白酶疏水性更强，与肌原纤维结合更牢固，因此钙蛋白酶自溶体的出现被认为是钙蛋白酶被激活的表现。Suzuki等[28]发现钙蛋白表达量的减少会导致肌肉蛋白的水解。宰后活体的Ca2+浓度只能激活μ-钙蛋白酶而不能激活m-钙蛋白酶，因此，μ-钙蛋白酶被认为是降解肌原纤维的主要作用酶。许多与嫩度和汁液流失相关的蛋白质都是μ-钙蛋白酶的底物，如肌联蛋白、伴肌动蛋白、纽蛋白、结蛋白（desmin）、肌源蛋白T（troponin-T）等，但不降解α-肌动蛋白（α-actin）、肌球蛋白（myosin）等。因此推测，钙蛋白酶可能是通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解从而实现对肌原纤维蛋白结构和功能的调控的。据推测钙蛋白酶所诱导的肌肉降解分为两步：首先，攻击肌原纤维的肌节部位（两相邻Z盘之间的一段肌原纤维），释放肌丝使其降解为小片段，然后被溶酶体捕获而进一步降解[29]，破坏了肌原纤维的有序性和完整性，从而改善肌肉的持水性。
2005年，Lawson[30]提出了一个新的有关汁液流失形成的机理，他认为宰后早期，动物屠体进入尸僵状态，肌原纤维收缩使得肌原纤维间的水分流出。如果尸僵前钙蛋白酶被激活且降解连接蛋白（intergrin），在肌纤维收缩时，细胞膜就会与肌原纤维分离而形成汁液流失通道。如果在尸僵前抑制钙蛋白酶活性，阻止了连接蛋白的降解，从肌原纤维间流出的水分就会进入肌纤维周围的结缔组织间，由于结缔组织具有很好的持水力，水分不会外流，从而降低汁液流失，即钙蛋白酶活性越高，汁液流失率越高。
4 结 语
影响猪肉持水性的因素很多，但归结到肌肉的生理和生化水平上，蛋白质的变化对持水性的影响尤为重要，特别近年来的一些研究发现宰后肌肉骨架蛋白的降解使得肌原纤维网格结构收缩时会导致在细胞间和肌束间形成汁液流失通道。但是，由于各个骨架蛋白在细胞内所处的位置及功能的不同，其与持水性呈现出的相关性也不同。甚至还有研究报道骨架蛋白的降解与持水性关系不紧密，因此，骨架蛋白降解与持水性的关系还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 李兴民. 肉中“贵族”： 冷鲜肉[J]. 饮食科学， 2005（7）： 21.
[2] 甄艳丽. 维生素E对冷却猪肉货架品质的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医， 2005（7）： 87-89.
[3] KOOHMARAIE M， WHIPPLE G， KRETCHMAR D H. Postmortem proteolysis in longi-ssimus muscle from beef， lamb and pork carcasses[J]. Anim Sci， 1991， 69（2）： 617-624.
[4] OFFER G， COUSINS T. The mechanism of drip production： formation of 2 compartments of extracellular-space in muscle postmortem[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1992， 58（1）： 107-243.
[5] LAWRIE R A. Meat Science[M]. 5th ed. New York： Pergamon Press， 1991.
[6] 陈韬， 周光宏， 徐幸莲. 宰后肌肉蛋白质变化对冷却猪肉持水性的影响[J]. 食品工业科技， 2006， 27（10）： 87-91.
[7] PENNY I F. Protein denaturation and water holding capacity in pork muscle[J]. Journal of Food Technology， 1969， 4（3）： 269-273.
[8] GREASER M I， CASSENSR G， BRISKEY E J， et al. Post-mortem changes in subcellular fractions from normal and pale， soft， exudative porcine muscle. l. Calcium accumulation and adenosine triphosphatase activities[J]. Food Sci， 1969， 34（2）： 120-124.
[9] HUFF-LONERGAN E， PARRISH F C， ROBSON R M. Effects of postmortem aging time， animal age， and sex on degradation of titin and nebulin in bovine longissimus muscle[J]. Anim Sci， 1995， 73（4）： 1064-1073.
[10] 高前进， 李壮志. 骨骼肌细胞骨架蛋白研究综述[J]. 北京体育大学学报， 2005， 28（10）： 1382-1385.
[11] 孔保华， 熊幼翎. 肌肉中的调节蛋白和细胞骨架蛋白的性质和作用[J]. 食品工业科技， 2011， 32（6）： 439-442.
[12] HONIKEL K O， KIM C J， HAMM R， et al. Sarcomere shortening of prerigor muscle and its influence on drip loss[J]. Meat Science， 1986， 16（14）： 267-282.
[13] OFFER G， KNIGHT P， JEACOCKE R， et al. The structural basis of the water-holding， appearance and toughness of meat and meat products[J]. Food Microstructure， 1989， 8（1）： 151-170.
[14] HUFF-LONERGAN E， MITSUHASHI T， BEEKMAN D D， et al. Proteolysis of specific muscle structural proteins by mu-calpain at low pH and temperature is similar to degradation in postmortem bovine muscle[J]. Journal of Animal Science， 1996， 74（5）： 993-1008.
[15] KRISTENSEN L， PURSLOW P P. The effect of ageing on the water-holding capacity of pork： role of cytoskeletal proteins[J]. Meat Science， 2001， 58（1）： 17-23.
[16] LAWSON M A. The role of integrin degradation on postmortem drip loss in pork[J]. Meat Science， 2004， 68（4）： 559-566.
[17] SCH?FER A K， ROSENVOLD P P， PURSLOW H J， et al. Physiological and structural events post mortem of importance for drip loss in pork[J]. Meat Science， 2002， 61（4）： 355-366.
[18] WANG K， WILLIAMSON C L. Identification of an N2 line protein of striated muscle[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1980， 77（6）： 3254-3258.
[19] MARUYAMA K. Connectin， an elastic filamentous protein of striated muscle[J]. International Review of Cytology， 1986， 104： 81-114.
[20] HENK L， LABEIT G S. Titin and Its associated proteins： the third myofilament system of the scarcomere[J]. Advances in Protein Chemistry， 2005， 71： 89-119.
[21] SCHREURS F J G， TOMASZEWSKA-GRAS J， KIJOWEKI J. Post mortem development of meat quality as related to changes in cytoskeletal proteins of chichen muscles[J]. British Poultry Science， 2011， 52（2）： 189-201.
[22] WANG K. Sarcomere-associated cytoskeletal lattices in striated muscle. Review and hypothesis[J]. Cell and Muscle Motility， 1985， 6： 315-369.
[23] WANG K， RAMIREZ-MITCHELL R， PALTER D. Titin is an extraordinarily long， flexible， and slender myofibrillar protein[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1984， 81（12）： 3685-3689.
[24] HUFF-LONERGAN， MITSUHASHI T， PARRISH F C J， et al. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophresis and western blotting comparisons of purified myofibrils and whole muscle preparations for evaluating titin and nebulin in postmortem bovine muscle[J]. Journal of Animal Science， 1996， 74（4）： 779-785.
[25] REES P M， TROUT G R， WARNER R D. The influence of the rate of pH decline on the rate of ageing for pork. Ⅱ： Interaction with chilling temperature[J]. Meat Science， 2003， 65（2）： 805-818.
[26] FAROUK M M， WU G， KRSINIC G. The “sponge effect” hypothesis： an alternative sociated proteins： the third myofilament system of the scarcomere[J]. Advances in Protein Chemistry， 2005， 71： 89-119.
[27] KOOHMARAIE M. Effect of pH， temperature， and inhibitors on autolysis and catalytic activity of bovine skeletal muscle mu-calpain[J]. Anim Sci， 1992， 70（10）： 3071-3080.
[28] SUZUKI K， IMAJOH S， EMORI Y， et al. Regulation of activity of calcium activated nentral protease[J]. Adv Enzymol Rel Area， 1988， 27： 153-169.