学文网摘要： 在生物实验教学中常用的生物玻片标本制作方法有涂片法、装片法、切片法等。本文对常用的生物玻片标本的制作技巧进行了总结，以提高生物实验教学水平。
关键词： 生物实验教学 生物玻片标本 制作技巧
在生物实验教学和课外科技活动中，经常需要制作生物玻片标本。笔者在长期的工作实践中积累了一定的经验，现把生物玻片标本的制作技巧总结如下：
1.玻片的清洗
玻片的清洁将直接影响到制片质量，所以制作玻片标本的第一步是要对载玻片和盖玻片进行清洁处理。
1.1新购买的玻片不能直接使用，要先浸泡于95%酒精中，以去除表面的附着物质，临用前取出，晾干或烘干备用。
1.2使用过的旧玻片，先用肥皂水或洗衣粉水煮沸0.5h，冷却后用软毛刷刷掉脏物，用流水冲洗干净后，置于95%酒精中备用。如果是石蜡切片可先放于二甲苯（可用制片时回收的废弃二甲苯，既避免污染环境又节省实验成本）中浸泡数小时，把封片用的树胶溶解掉，将盖玻片和载玻片分开后，再用肥皂水煮沸。对于很脏的旧玻片可先用洗液浸泡24h（洗液配制：取重铬酸钾50g，加水300ml，加热搅拌溶解，待其冷却后，徐徐注入浓硫酸250ml，边加边搅拌即成，可长期使用），取出用自来水冲洗干净后，置于95%酒精中备用。
2.涂片的制作
2.1取材要快速，避免发生细胞自溶现象；操作要轻巧，防止损伤细胞结构。
2.2涂片要均匀，厚薄要适度，太厚细胞堆叠，太薄细胞过少，都会影响观察。操作时，以在载玻片上涂上淡淡的一层样品为宜。如果样品细胞密度过大，如过浓可用生理盐水稀释后再做涂片。
2.3制作血涂片时，须用双蒸水，否则易引起染料沉淀；Giemsa染液对酸碱度极敏感，当染液偏酸时，红细胞染成红色，偏碱时则染成蓝色，所以最好用pH6.8―7.0的缓冲液来配制染液。
3.装片的制作
3.1在观察动物组织细胞的临时装片时，为保持细胞的正常形态，应根据动物种类的不同使用相应的生理盐水。如哺***类等温血动物用0.9%生理盐水，两栖类等冷血动物用0.65―0.7%生理盐水，无脊椎动物用0.45%生理盐水，海产无脊椎动物可用过滤海水。
3.2染色可使观察更清楚，除了碘液（碘0.5g、碘化钾1g、水150ml）以外，还可用1%美蓝或甲基绿（0.5%甲基绿100ml，醋酸1ml）染色。
3.3制作半永久装片，可用甘油封片。将固定、染色过的标本放入5%甘油中，用纱布封口，放在阴凉处2―3天，使水分蒸发、甘油变浓后，吸一滴带有标本的甘油于载玻片上，盖上盖玻片。对于怕压、易碎的标本，可在甘油的两边放两根细玻璃丝，再加盖玻片。
3.4制作永久装片，一般用树胶封片。封片前，要先将固定、染色过的标本经各级酒精及两次纯酒精脱水、每级15min，然后用酒精二甲苯等混液、两次纯二甲苯透明各15min。处理小型的浮游生物，在换液时可离心，使其沉淀，便于操作。
4.切片的制作
4.1徒手切片
在常规的徒手切片制作中，效果不好控制，且易切伤手指。可将废弃的唇膏盒废物利用，清洗干净后，切削合适的萝卜、土豆等作为夹持物插入盒内，旋转盒底，夹持物及材料可随意升降，用刀片沿管口平切，即可获理想切片。
4.2石蜡切片
4.2.1多采用Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液75ml+福尔马林25ml+冰醋酸5ml）固定24h后，移入70%酒精保存。如需长期保存，可在70%酒精中加入10%甘油，以避免标本发脆。
4.2.2在脱水换液时，可用吸水纸将标本表面水分轻轻蘸掉，再投入到下一级高浓度酒精中，这样可提高脱水效果。
4.2.3透明时如果室温较低，可适当延长时间或置于温箱中加热。
4.2.4浸蜡要选用适当熔点的石蜡，一般春秋季室温20℃左右时，用熔点52―54℃的石蜡，冬季用熔点45―50℃的石蜡，夏季用熔点56―58℃的石蜡。用过的蜡可收集起来熔化过滤后再次使用，并且旧蜡比新蜡还好用。浸蜡时要控制好蜡温，温度过高会使组织烫坏，操作时注意以蜡缸边缘有少量蜡凝固为宜。
4.2.5对于卵黄多的材料如蛙卵、鱼卵等，采用常规的制片方法不易成功。笔者对脱水、透明和浸蜡等关键步骤进行了改进，效果良好，具体为：将固定后、保存于70%酒精的标本移入80%酒精1h95%酒精+氯仿+冰醋酸混合液1h（95%酒精与氯仿体积比1∶1，每100ml加5ml冰醋酸）叔丁醇+氯仿+冰醋酸混合液1h（叔丁醇与氯仿体积比1∶1，每100ml加5ml冰醋酸）松油醇1h松油醇与石蜡1∶1混合液30min石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ30min石蜡Ⅲ4―5h。
4.2.6蜡块修整时，从标本的四周距离蜡块边缘要有2―3mm，修整成长方体或正方体以利于切片时能连成蜡带。夏季室温过高，可将蜡块放于冰箱中保存，以保持硬度，切时取出。切片刀要锋利且洁净。
4.2.7苏木精与伊红（HE）染色法最关键的步骤是分色。苏木精染色后的切片呈深紫红色，在分色时可经常取出切片，背面衬一张白纸对着光线看，当切片褪色至浅紫红色即可。初学者须用显微镜检查，镜下细胞核结构清晰即停止分色。
4.3冰冻切片
4.3.1根据所切材料的性质，调节所需的温度。脑、淋巴结、甲状腺、肝脏、脾、骨髓等，适宜温度为：0―-15℃；舌、肌肉、肠、胰脏、前列腺、子宫、卵巢等，适宜温度为：-15―-30℃；脂肪宜用-30―-60℃。
4.3.2材料的冰冻程度要掌握好。冰冻过度，切片易碎也易损伤刀口；冰冻不足切片会呈粥糜状。冰冻适度时，组织块上端的白霜即渐消失，和刀接触时，发出嘶嘶细小的声音，并有轻度阻力感觉，切出的切片大部分都能卷附在切片刀上，如连续地进行切削，切片能连接起来，自下而上卷转，投入水中，好的切片即能自然伸展开来，丝毫看不到有条纹和伤痕。
4.3.3切片的动作要敏捷，因为冰融会影响切片。如遇切片破碎时，宜检查组织块中部，若中部还软，说明冰冻不足，应继续冰冻；如冰冻过硬，稍等片刻再切，如仍切碎或不完整，应检查刀口，更换位置再切片。
4.3.4冰冻切片可以不贴片进行染色，也可贴片后染色。如果操作细致，不加贴附剂切片亦可粘牢于玻片上。如果切片易脱落，可先在玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后将玻片插入水中用弯头小玻棒帮助把切片捞起，摆正位置，放于37℃温箱内烘干，入70%酒精5min，即可染色。
参考文献：
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基金项目：淮海工学院教学改革立项课题（2006106）
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