学文网肌球蛋白篇1
心脏收缩-舒张是一个非常复杂的生理过程，受诸多生理性和/或病理性因素影响而发生变化，因此而影响心功能。尤其临床上许多疾病都伴有心功能改变，严重时出现心功能障，心肌收缩力下降，心输出量减少。
随着分子生物学等相关学科的迅猛发展，人们从细胞水平、分子水平对心肌收缩-舒张过程及其调节的诸多参与成分各自的作用及相互间作用有了更进一步的了解和认识。近十几年来，人们针对糖尿病、甲状腺功能异常(包括功能亢进和低下)、心肌肥厚、心肌病、缺氧等病理条件下引起的心功能改变，特别是收缩蛋白、调节蛋白与心功能的关系做了大量深入细致的工作。
1 收缩蛋白和调节蛋白
收缩蛋白包括肌球蛋白和肌动蛋白。肌球蛋白是由学者Kuhne于1859年首先报道的，半个多世纪之后，对肌球蛋白的生化分析才开始进行。肌球蛋白是心肌粗肌丝的主要成分，分子呈杆状，一端具有两个球形区域，似豆芽的头部，由两条重链(MHC)和两对轻链(MLC)构成，是肌球蛋白重要生物活性所在地，另一端是一个丝状“尾巴”，由两股α-螺旋肽链绞在一起形成一种盘卷螺旋结构［1］。肌球蛋白具有二个生物学作用：一是具有ATP酶活性，能裂解ATP，释放化学能；二是具有与肌动蛋白结合的能力。研究表明心脏的MHC是由两种基因编码，即α-MHC和β-MHC基因，这些基因产物在肌球蛋白分子中形成二聚体，所以相应的有三种分子异构体存在，即V1(α、α同源体)、V2(α、β异源体)、V3(β、β同源体)。由于α、β-MHCATP酶活性不同，因此不同的异构体之间所具有的ATP酶活性及收缩活性也不同。肌球蛋白ATP酶活性主要由心肌所含V1或V3的量多少而决定，故肌球蛋白以V1占优势的心肌ATP酶活性最高，肌肉收缩速率最快，耗能也最多，而以V3占优势的心肌情况正相反，以V2占优势的心肌表现介于两者之间［2，3］。肌球蛋白异构体之间的转换是心肌的适应性改变，是心脏本身负荷和能量供应两方面调节适应的结果。V1通过增加心肌收缩速度来增加供能达到能量供求平衡，V3通过减少耗能而适应压力超负荷。当能量供不应求时，肌球蛋白异构体向V3转化，使ATP酶活性下降，心肌收缩功能降低，表现为Vmax下降，最大张力正常，而达到最大张力的时间延长，心肌作功时耗氧量下降，结果使心脏在节能的情况下产生同样的张力，所以V3增加虽可使心肌速度变慢但是却提高了机械效率。
正常哺***动物和人的心室肌球蛋白异构体的分布与种属、年龄等因素有关。成年人左心室心肌肌球蛋白以V3为主占60%～90%，而小哺***类动物左心室心肌肌球蛋白以V1为主占60%～90%，人类和哺***类小动物心房肌球蛋白以V1为主［4］。
对心肌肥厚等病理状态研究显示，心脏肌球蛋白基因表达及蛋白异构中存在着可塑性，推测这可能是动物机体的一种适应反应，例如超负荷刺激引起大鼠心肌肥厚可诱导左心室β-MHC基因表达及V3肌球蛋白增多，结果使心肌耗氧降低，收缩速率下降，被认为是一种经济的适应性反应［5］。
与肌球蛋白相比，肌动蛋白结构及功能相对简单。分子单体为球形，单体上有与肌球蛋白头相结合的位点，许多单体相互连接形成两条有极性的相互缠绕螺旋体。
调节蛋白包括原肌球蛋白(Tm)和肌钙蛋白(Tn)，Tm和Tn结合钙离子构成调节蛋白复合物，通过影响肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互作用调节收缩活动［6］。Tm分子由二条完全相同或不同的螺旋形肽链组成(同源或异源二聚体)，不同组织来源(如房、室)和特殊种类的Tm不尽相同。Tn由三种亚单位组成，即TnI、TnT、TnC。TnI是肌动球蛋白复合物的Tn抑制形，具有调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的能力，这种调节作用主要是一种抑制作用。TnT即肌钙蛋白结合原肌球蛋白，其作用是将肌钙蛋白复合体附着在Tm上。TnC即钙结合肌钙蛋白，是钙离子的受体，具有两个高亲和力和两个低亲和力的钙离子结合点。这三种肌钙蛋白亚型以协同方式相互之间与Tm及肌动蛋白互相作用［7］。
2 病理条件肌球蛋白的改变
2.1 机械性作用
利用***鼠分离培养的心肌细胞，在体外进行机械牵张与心肌肥厚的实验研究表明，机械牵张引起大鼠心肌细胞MHCmRNA表达增高。Shyu等人［8］用Northernblot分析研究了分离培 养的***鼠心肌细胞周期性牵张对MHCmRNA表达的影响，与对照组相比显示在不同时相点MHCmRNA最高增加了12倍。Vandenburgh等人［9］研究证实机械作用增加MHC含量，包括β-MHC和α-MHC都增加。Kojima等人［10］在自发性高血压(SHRs)动物模型研究中看到从9周龄到25周龄经vehicle***组的SHRs，MHCV3异构体进行性增加。
2.2 限制饮食、缺氧
限制饮食使大鼠心肌V3肌球蛋白异构体增高［11］，早已被人们所认识［12］，这些改变被认为由血中T3水平降低而触发［13］，而最近一些研究显示限制饮食使β-MHC增高并无循环T3的明显改变［12］，Pissarek等也得出相同的结果。但Swoap等认为这不能排除由于心脏甲状腺激素受体的减少而引起一个功能性高甲状腺素的可能性［14］。Pissarek等在慢性低氧(CHH)大鼠模型研究中发现大鼠左、右心室都有一个明显的α-MHC向β-MHC的转换。慢性缺氧引起心肌收缩器(Apparatus)实质性变化，V3肌球蛋白异构体的表达使得心脏降低收缩耗能，提高工作效率［15］。
3 几种疾病状态下肌球蛋白及调节蛋白改变
3.1 糖尿病
糖尿病是许多常见的慢性病之一，它与心血管疾病引起的死亡有较密切的关系。其心功能的破坏不依赖于血管性疾病，提示在糖尿病存在一个原发的心肌的缺陷。大量动物实验研究提示慢性糖尿病动物心功能改变与收缩蛋白ATP酶活性受抑制及肌浆网(SR)和肌膜(SL)钙运输异常有关，这些异常经胰岛素***都能逆转。另外用钙通道阻滞剂维拉帕米***，心脏收缩蛋白ATP酶活性及肌浆网钙离子活性得到改善［16～18］。进一步研究显示慢性糖尿病动物心脏肌球蛋白异构体-βMHC与ATP酶活性降低和收缩速率(Shortingvelocity)密切相关［19］。
在STZ(Streptozotocin)糖尿病大鼠心肌力学和肌球蛋白酶学研究中，Takeda等人报道了糖尿病影响心肌收缩，肌球蛋白V1向V3转换及心脏能量学的变化。与心肌肌球蛋白以β形占优势相比较，肌球蛋白以α重链占优势的心肌表现收缩速率增加，高ATP酶活性，收缩能量消耗也增加。
在啮齿动物心脏一些病理条件下如高血压心肌肥厚、糖尿病、心肌梗死及老龄心肌，肌球蛋白异构体也显示出明显的转换。糖尿病心脏收缩速率的降低也许可用大鼠模型中肌球蛋白异构体的变化得到部分或全部解释［20］。
成年人心室肌球蛋白以V3异构体占优势，所以这也许是严重病理状态下人类心脏中并没有观察到肌球蛋白ATP酶活性变化的原因，但观察到肌纤维ATP酶曲线下降，推测病理状态下微小差异可能存在于人类肌球蛋白重链，这种差异用一个范围的焦磷酸盐凝胶电泳往往观察不到。故认为非常小的异构酶(Isoenzyme)转换与收缩蛋白的其它主要改变一起可能导致肌纤维活性的明显变化［21］。
除了收缩蛋白，调节蛋白及钙离子因素也直接或间接影响心脏的功能。在脊椎动物的横纹肌，细肌丝的调节成分TnTm负责传导收缩蛋白活动中钙离子效应，并且当钙离子缺乏时则抑制这种活动［22］。人们通过对照组或糖尿病组调节复合物TnTm存在的条件下利用对照组或糖尿病组肌球蛋白观察Ca2+依赖性心脏肌动球蛋白ATP酶活性。当糖尿病大鼠心脏的肌球蛋白被从对照组心脏分离的调节蛋白复合物调节时，肌球蛋白ATP酶可以部分逆转，提示糖尿病大鼠病理模型中调节蛋白能部分上调心脏的肌球蛋白［23］。在SDS平板凝胶中，来自慢性糖尿病大鼠和对照组动物心脏的调节蛋白在TnI和TnT表现不同，加了对照组动物TnTm的糖尿病心脏被调节的肌动球蛋白ATP酶活性发生逆转，这可能说明糖尿病心肌病理中或TnTm亚单位出现的量不同或存在调节蛋白亚单位异构酶组成不同。另外来自糖尿病心脏的调节复合物被重组，导致心脏肌动球蛋白系统调节中钙敏感性下降［24］。而对来自正常的和疾病的人类心肌完整的和分离的心肌中PKC活性作用的一些研究中，Gwathmey和Hajjar报道了肌丝的Ca2+敏感性和收缩活性的改变可能是由TnI和TnT磷酸化所致［25］。也有报道肌球蛋白轻链-2(MLC-2)与PKC的直接磷酸化或PKC的受体介导的刺激物都分别可以导致去膜的［skinned］心肌细胞和肌纤维中Ca2+敏 感性和ATP酶活性的增加［26］。
3.2 甲状腺功能亢进或低下
心脏是甲状腺激素作用的一个主要靶器官，激素水平过高或过低时都明显影响心脏功能。T3对心脏功能的影响是通过它对心脏的直接作用和间接作用。直接作用指T3对心脏细胞的直接效应，是通过核或核外机制介导的。核外T3效应：它的发生不依赖与核T3受体的结合，增加蛋白质合成，主要影响氨基酸、糖及钙离子的穿膜运输；核的T3效应：通过T3与特殊的核受体蛋白结合而被介导，导致T3反应性心脏基因转录增加，另外T3对肌膜(SL)Ca2+a-ATP酶也存在核外效应，引起钙离子从肌细胞流出增加。甲状腺激素对蛋白合成的效应使总体心脏蛋白形成增加，并且增加特殊蛋白的合成率，这种增加远远超过了由甲状腺激素诱导的蛋白合成的一般性增加。对其它一些特殊的蛋白象肌球蛋白重链(MHC)β合成率是降低的，使肌球蛋白V1异构体增加，V3降低，心肌收缩速率增加，ATP消耗也增加。间接作用是T3引起外周改变进一步导致血液动力学变化而影响心功能［27～29］，甲亢时，T3除了增***1肌球蛋白异构体，也增加心肌的舒张率，被认为与肌浆网(SR)的Ca2+-ATP酶泵的活性有关。有学者报道T3诱导增加了SRCa2+-ATP酶(SERCA2)基因的转录使SERCA2mRNA水平增加［30］。SERCA2是一个离子泵，负责舒张期将胞浆中的钙离子运回到肌浆网。V1肌球蛋白异构体和SERCA2泵数量增加导致甲亢时心脏ATP消耗明显增加，另外ATP化学能少部分用于心肌收缩过程，大部分用于产生热量，降低了心脏的收缩效率［31］。
甲状腺功能低下时情况正相反。T3缺乏在成年啮齿类动物心脏观察到肌球蛋白异构体V1向V3转换，SERCA2活性降低。由此而引起心脏收缩率，代谢等方面的改变在此不再赘述。
总之在病理条件下，肌球蛋白异构体明显转化，肌球蛋白由V1向V3转化，引起心肌收缩力下降，收缩速度变慢。耗氧降低被认为是心肌的一种适应性反应。另外调节蛋白，SERCA2等结构的改变从不同作用环节影响心脏的功能。
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肌球蛋白篇2
摘 要：超高压加工技术是一项能够影响肉类凝胶功能特性的非热加工技术，肌球蛋白是肉类凝胶形成过程中起主要作用的蛋白质。虽然人们对于高压处理对肉类凝胶影响的机理研究不断深入，但是在肌肉与肌原纤维蛋白层面的研究常受限于其复杂的体系，因此针对单体蛋白的基础研究有助于对这一体系的进一步探索，从而更好地指导实践生产。该文着重于介绍高压处理对肌球蛋白凝胶形成过程机理的研究进展和存在的技术限制以及对未来的展望。
关键词：肌球蛋白；超高压；凝胶机理
Abstract： High pressure processing （HPP） technology is a non-thermal processing technology that could affect functional properties of meat gel. Myosin， one of the myofibrillar proteins， contributes dominantly to the meat gelation process. Although the effect and underlying mechanism of high pressure processing on meat gelation have been elaborately investigated， knowledge is still lacking as to the complex system consisting of muscle and myofibrillar proteins. Studies focused on the alterations of myosin under high pressure environment might provide us an opportunity to drill down to the details of this complex system and in turn provide a better guidance for practical production. This paper is centered on a review of the progress which has been made in understanding the mechanism of the high pressure induced gelation of myosin as well as technical restrictions for relevant studies. Future prospects are also discussed.
Key words： myosin； high pressure processing； gelation mechanism
DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008
中***分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）10-0040-05
引文格式：
薛思雯， 钱畅， 王梦瑶， 等. 肌球蛋白高压凝胶机理的研究进展[J]. 肉类研究， 2016， 30（10）： 40-44. DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008. http：//
XUE Siwen， QIAN Chang， WANG Mengyao， et al. Progress in understanding the mechanism of the high pressure-induced gelation of myosin[J]. Meat Research， 2016， 30（10）： 40-44. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008. http：//
肌球蛋白，是肌原纤维蛋白在凝胶形成过程中起最主要作用的蛋白质，对肉类凝胶的功能特性如保水性、保油性、***化特性等都起决定性作用，它在特定条件下会形成多聚体，在生理条件或者低离子强度条件下是不可溶解的，大部分的肌球蛋白分子在0.5 mol/L氯化钾和20 mmol/L磷酸钾缓冲液中呈单体状态（pH 7.0）[1]。
肌球蛋白分子是形如豆芽状的单体蛋白分子（有头部和尾部），由6 条多肽链组成，分别为2 条重链（myosin heavy chain，MHC）和4 条轻链（light chain，LC），
经胰蛋白酶水解后会形成重酶解肌球蛋白（heavy meromyosin，HMM）和轻酶解肌球蛋白（light meromyosin，LMM）[2]。在肌球蛋白的头部有Ca-ATPase的活性位点，它会随着加热或者加压逐步失活而导致蛋白构象的变化。有研究认为当有50%的Ca-ATPase失去活性时，肌球蛋白就会聚集形成良好的凝胶网络结构[3]。
超高压加工（high pressure processing，HPP）技术是近几十年来兴起的非热加工技术之一，较传统技术而言，其不仅可以有效灭菌、钝酶，还能通过修饰蛋白来改善产品的质构和保油、保水性；同时又不会破坏小分子及共价键，能最大程度地保持产品的风味与色泽[4-5]。随着相应设备的不断开发，该技术已被广泛运用于商业化生产中[6]。
许多学者针对高压处理对肉制品或肌原纤维蛋白的影响做过相应的研究探讨，发现将肉类蛋白质在合适的参数下进行高压处理能够显著改善其加工特性，起促溶、增强***化、持水以及凝胶能力的效果；更能在不改变或提高其功能特性的前提下达到减少氯化钠或磷酸盐添加量的目的[7-10]，即高压作用会影响盐离子对肌球蛋白分子的修饰作用以及他们之间的相互作用。但同时高压参数的微小变化也会使蛋白质的功能特性呈现出极为显著的变化，对肉类蛋白造成不良的影响从而减弱其功能特性。为最大程度地在肉品加工领域应用超高压技术，需要更深入地研究高压对肌肉或者肌原纤维蛋白体系的作用。而肌球蛋白层面的基础研究有助于对这一复杂体系的深入了解，从而为高压凝胶类肉制品的生产提供理论指导和技术支持。
1 超高压作用于肌球蛋白分子的主要方式
高压对肌球蛋白分子的影响与热处理不同。加热是一个时间较长的过程，在20世纪末，Yamamoto[11]、Sharp[12]等分别利用金属投影透射电镜和负染法透射电镜观察，发现在加热过程中肌球蛋白的头部与头部、尾部与尾部、头部与尾部之间相互作用交联，在非共价键（疏水相互作用、范德华力等）和共价键（二硫键等）作用下形成相互交联的凝胶网络结构。Sharp等[12]更发现温度越高，参与的肌球蛋白分子越多，肌球蛋白形成的聚合体越大，随着温度进一步升高到50 ℃以上，尾部开始变得模糊，形成交联，研究强调肌球蛋白头-头之间的交联形成了球状聚合物，而尾部之间的交联可能才是形成链之间交联和凝胶网络的重要作用。
高压处理是瞬时、均一的作用过程，整个反应体系没有显著的压力梯度变化。当压力作用于蛋白质时，产生的最大影响是蛋白质的体积会被压缩，分子形态会变化以及凝胶形成过程中分子间会形成相互作用，从而发生可逆或不可逆的改变；而这一过程也离不开温度的作用，在升压过程中，压力使得腔体的体积变小，引起腔体内的温度升高；而降压时温度也会随之下降，且温度高低、变化快慢都与升压/降压速率密切相关[13]。因此前人关于肌球蛋白热凝胶的研究也是今后探究高压对肌球蛋白成胶机理的重要基础。但与热变性成胶不同的是，肌球蛋白的高压变性聚集和之后的凝胶形成没有一个统一的模式且高压参数的影响很大；更有许多学者研究指出高压作用下的凝胶和热凝胶机制不同，头部极有可能是关键区域[14-15]。
超高压技术在肉制品中的应用根据参数和与热处理的结合主要分4 种，而其中对肌球蛋白凝胶特性有显著影响的主要是非变性温度下高压处理后热加工以及变性温度下高压处理直接形成凝胶，这2 种工艺分别称为高压辅助凝胶和高压凝胶，两者使蛋白变性以及成胶的影响也不同。Fernández-Martín等[16]的研究便发现非变性温度下高压处理会使肌球蛋白稳定性降低，有利于其进一步变性；而变性温度下高压处理，高压作用反而会保护肌球蛋白分子中的某些天然构象，延迟其变性，继而导致整个体系的变性温度升高，过程减缓。故形成的高压凝胶与单纯的热诱导凝胶相比，保水保油性有较大改善，但凝胶的质构特性有所下降。同时由于高压凝胶所要求的压力水平较高，对设备的要求也更为苛刻，因此从企业效益出发，高压辅助凝胶技术更受青睐，该技术不仅能够有效地改善蛋白质的功能特性（例如可以改善鸡肉中的类PSE肉的功能特性[17]），还能达到减盐、减脂的目的[18]，
更能大幅度提高肉制品的安全性，在肉制品加工行业有广阔的应用前景[19]。
2 高压对肌球蛋白分子的影响
2.1 高压对肌球蛋白分子形态的影响
由于高压辅助凝胶技术能显著地改善肉制品蛋白凝胶的功能特性，且所施加的压力水平一般低于400 MPa，在现有的高压工艺肉制品加工中应用较多，高压作用对于蛋白分子最直观的影响是使其分子形态产生变化。Yamamoto[11]发现，当压力达到140 MPa以上时，溶解于0.5 mol/L KCl、pH 6.0溶液中的肌球蛋白分子开始聚集，而当压力进一步加大到210 MPa时，溶液中大量肌球蛋白分子头部发生聚集，尾部向外分散，形成菊花轮状的分子簇结构；且有部分肌球蛋白分子经高压处理后会丢失一个头部结构。Sikes等[20]发现对牛肉加热前高压处理可以增加肌球蛋白的溶解性促进黏结，同时使分子部分解折叠；这有助于在后续的加热过程中形成良好的蛋白凝胶，从而降低生产过程中食盐和磷酸盐的添加量，这和Crehan等[21]的研究结果一致。Iwasaki等[22]发现200 MPa以上压力处理会压缩肌球蛋白分子的体积，从而使凝胶强度和表面弹性下降。Simonin[14]、Sun[15]等研究发现，高压辅助凝胶工艺会改变肌球蛋白的变性机制。在非变性温度下高压处理，肌球蛋白分子会先解聚，这不仅可增加肌球蛋白的溶解，还会破坏其头部肌动蛋白和ATP结合位点的天然构象，这些变化在很大程度上都会影响其热凝胶的性质。
2.2 高压对肌球蛋白间化学作用力的影响
Hsu等[23]的研究发现，在高压处理的过程中，蛋白质的流变特性和热动力特性逐步转变；高压下蛋白质分子的聚集和胶凝现象主要是活性巯基被氧化后形成分子间和分子内二硫键，蛋白发生变性形成交联引起的，这与Yamamoto[11]的研究结果一致。通过比较，Ko等[24]认为肌球蛋白经150 MPa高压处理后加热可以形成有强度和弹性的凝胶网络结构，而其中发挥主要作用的是分子间疏水作用力和二硫键。但同时也有研究指出，非变性温度下高压处理会保护或增强氢键，从而稳定肌球蛋白分子内部一部分天然构象[25]。
Cao等[26]将兔肌球蛋白溶液在100～400 MPa、20 ℃条件下保压10 min，通过测定高压处理后蛋白溶液的表面疏水性、巯基含量、动态流变等指标，并结合活性电泳***谱分析，发现在100～200 MPa条件下，肌球蛋白溶液的表面疏水性和活性巯基含量略有升高，但是当压力到达300～400 MPa时，这两者含量显著增加，动态流变结构显示肌球蛋白溶液（20 mg/mL）在400 MPa压力作用下会形成凝胶。他们认为高压诱导肌球蛋白变性成胶的机制可主要概括为压力作用下肌球蛋白解折叠，暴露出疏水基团和包埋的巯基基团，当压力进一步升高时，压力、温度和氧化剂的共同作用使巯基氧化成二硫键以及疏水相互作用形成，肌球蛋白分子进一步变性、聚集，最终连结成凝胶网络结构。
多位学者的研究结果还表明，不同物种来源的肌球蛋白对高压的敏感性也有差异，如鱼类的肌球蛋白一般在150 MPa的压力作用下就能发生变性，而畜禽类的肌球蛋白分子需要在200 MPa以上的压力作用下才能观察到其对凝胶形成的影响[17，27-31]。但到目前为止，大部分研究都认为，高压作用主要通过影响肌球蛋白分子的表面疏水性及二硫键（凝胶形成过程中最重要的2 种化学作用力）的形成，进而抑制或促进蛋白凝胶网络的形成。
2.3 高压对肌球蛋白形成的凝胶网络结构的影响
肌球蛋白凝胶的功能特性受其所处的环境（离子浓度、溶液体系中的添加物等）以及成胶处理（加热或加压）影响。高压处理通过外部施加的作用力使肌球蛋白分子发生变性与聚集，而聚集的蛋白簇进一步相互交联形成凝胶网络。和热处理相似，高压处理也需要达到一定的压强才能使肌球蛋白充分变性、聚集、交联[32-34]。因此，不同高压参数下处理后肌球蛋白间的相互作用以及凝胶结构是存在差异的。
Yamamoto[11]对兔骨骼肌肌球蛋白进行210 MPa高压处理后，利用旋转阴影透射电镜观察发现虽然肌球蛋白头部形成聚集，但是无凝胶网络结构形成，需要进一步加热，且加热后的凝胶微结构与未经高压诱导的凝胶网络微结构没有显著差异。也有研究发现，在低离子浓度条件下，将肌球蛋白先高压处理再线性升温所形成凝胶的强度较未经高压处理组的更大，且与肌球蛋白纤丝的长度呈正相关关系[35-36]。
Cao等[26]通过分析扫描电镜结果发现，在200 MPa以下的压力作用下形成的凝胶呈纤丝结构并有许多小的空洞，当压力达到300 MPa时，凝胶开始形成球形聚集并伴随有大的空洞出现，再升高压力到400 MPa时形成的空洞变大，球状聚积物出现，肌球蛋白分子之间的交联减少，活性电泳的结果表明肌球蛋白在400 MPa压力下已经发生变性。但目前的研究中鲜有关于更高压力（>500 MPa）作用下肌球蛋白形成的凝胶网络微结构的研究。
2.4 高压对肌球蛋白分子结构的影响
拉曼光谱法、傅里叶变换红外光谱法、圆二色谱法、荧光探针法都是研究蛋白二级、三级结构的常用方法。Huppertz等[37]发现在整个高压处理过程中，蛋白质的空间结构都会受到不同程度的影响，如150 MPa高压处理会破坏蛋白多聚体之间的非共价键，影响蛋白质的高级结构；压力大于200 MPa时，维持蛋白三级结构的疏水作用力和离子键遭破坏，这些均会导致蛋白的三维凝胶网络结构在进一步的加热过程中改变，进而引起蛋白凝胶的功能特性变化。这与Yamamoto等[38]的发现一致。King等[39]将鸡骨骼肌肌球蛋白进行酶解，以其杆状部分和杆状纤丝部分为研究对象，利用荧光探针法和圆二色谱法研究发现43～49 MPa的压力可以使杆状纤丝部分（0.4 mg/mL）发生中等程度的分解，但是杆状部位的2 条螺旋链则要在更高的压力条件（约130 MPa）下才会解离，杆状部位的2 条α螺旋链的分子内相互作用比杆状纤丝部分的分子间相互作用更稳定。
Iwasaki等[40]利用ANS荧光探针法研究肌球蛋白以及其次结构（S-1和杆状部位）在高压作用下分子结构的变化。实验发现，在400 MPa下肌球蛋白的内荧光光谱会发生4 nm的红移，且ANS荧光强度随着压力的增加而变大；肌球蛋白及其次结构的内荧光光谱的变化经量化后表达为质谱中心，该质谱中心与压力的大小呈线性正相关关系；但ANS标记的杆状部分的荧光强度却没有随压力水平的变化而改变；压力大于300 MPa时S-1部分的质谱中心出现滞后现象，在压力高于350 MPa时该现象更加明显。在高于350 MPa的压缩过程中，质谱中心并没有减小，表明S-1部分在高于350 MPa时部分变性且保持稳定；直到400 MPa时，S-1部分相应荧光强度的变化仍能检测到，并且会随着压力的增加而增加，但在压力释放后却没有改变。ANS荧光强度在恒定压力下增加意味着压力诱导的肌球蛋白的变性在升压过程中加速。内荧光和ANS分子荧光强度的检测结果表明，肌球蛋白的头部和尾部对高压的敏感程度不同，在肌球蛋白头部，色氨酸残基的极性增加，疏水内芯暴露到分子表面，相比之下尾部的多肽链结构只有部分发生变性。故对高压最敏感的部分是肌球蛋白的头部，这些也符合Ko等[24]将肌球蛋白酶解为头部S-1和尾部Rod，再经高压处理后发现S-1解聚交联并成胶。而Rod并无太大变化的结果[20]。
这些研究结果均表明，较低压力水平（
3 结 语
肌球蛋白形成高压凝胶是一个复杂的动力学过程，包括蛋白构象、化学作用力、分子形态等各个方面的综合作用。另外，肌球蛋白的高压辅助凝胶和高压凝胶的成胶机制不尽相同，形成凝胶的作用力也有所差异，而今受研究设备和方法的局限，高压凝胶过程的肌球蛋白变化还没有得到充分彻底的研究。虽然超高压技术目前已经日趋成熟，在肉类工业中的应用也日渐广泛，但仍需从理论角度去诠释肌球蛋白在超高压作用下变化的动力学过程，才能更深入地研究高压作用对肌肉、肉糜以及肌原纤维蛋白等复杂体系的影响，真正使科学基础研究造福肉类工业，减少生产浪费，提高产品品质，研发新型肉制品。因此，如何在现有技术的基础上研究不同高压条件处理下肌球蛋白的变化将是相关科研人员的挑战。
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肌球蛋白篇3
摘要：目的在于探讨低氧及低氧耐力训练条件下肌球蛋白重链（MHC）转换的方式，了解低氧及低氧运动下骨骼肌微细组成的改变。方法：选取SD大鼠30只，随机分为常氧对照组（NC）、低氧对照组（HC）和低氧训练组（HT）。HC组和HT组动物均生活在模拟海拔4000米高度的低氧舱中，HT组进行跑台练习，28天后取浅层胫前肌。RTPCR方法测定四种MHC亚型mRNA表达，SDSPAGE方法测定各种MHC亚型蛋白表达。结果：低氧及低氧运动均使MHC－Ⅱa 蛋白表达显著下降, MHC－Ⅱx和MHC－Ⅱb 蛋白表达显著升高；低氧影响MHC基因表达为MHC－Ⅱa mRNA显著升高，MHC－ⅠmRNA不显著下降；低氧运动使MHC－Ⅱb mRNA显著升高。结论：低氧及低氧训练使MHC蛋白和基因表达慢型向快型转化。
关键词：肌球蛋白重链；低氧；低氧运动
中***分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)07-0919-03
低氧环境已显示可引起骨骼肌形态学显著的改变，如毛细血管密度增加、平均肌纤维横截面积下降，同时线粒体数目、肌红蛋白明显增多，机体的有氧代谢能力得到改善。
伴随着代谢方式等一系列的改变肌纤维类型也可能会发生相应的调整。如Itoh［1］的研究表明雄性SD鼠置于模拟4 000 m低氧舱10周后，比目鱼肌快缩氧化糖酵解型肌纤维（FOG）增加，慢缩氧化型纤维（SO）减少；Bigard等对Wistar鼠4 000 m高度游泳训练14周的研究［2］显示，高海拔耐力练习引起快肌趾长伸肌（Extensor digitorum longus，EDL）和足底肌（Plantaris，PLA）Ⅱa型纤维增加，同时Ⅱb减少。
由于肌纤维分类方法的差异使得对于低氧及低氧耐力训练影响肌纤维组成的报道结果存在差异。现在常用的肌纤维分类方法有肌原纤维ATP酶（肌球蛋白ATP酶）、肌球蛋白重链(MHC)单克隆抗体免***组化、肌球蛋白重链(MHC) 聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法。
肌原纤维ATP酶（肌球蛋白ATP酶）的方法一般只能区分出Ⅱa、Ⅱb和Ⅰ三种肌纤维［3］；免***组化方法由于缺乏特异性的Ⅱx MHC抗体，目前还不能检测到Ⅱa与Ⅱx或Ⅱx与Ⅱb同时存在的纤维类型。肌球蛋白重链(MHC) 聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法可以清晰地看到四种纯合的肌纤维（Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC），依其敏感性好、特异性强、可重复的特点广泛用于分离MHC。
Talmadge［4］总结多人研究结果发现，由MHC确定的肌纤维最大收缩速度顺序为Ⅰ
1材料与方法
1.1实验动物与分组7周龄健康雄性Spraque Dawley(SD)大鼠30只，平均体重(210±20)g，购自河北医科大学实验动物中心，为国家二级卫生动物。饲养温度控制在(22±3)℃，动物自由进水进食，适应性喂养两天后，随机分为三组，每组10只:
常氧对照组（Normoxic Controls,NC）
低氧对照组（Hypoxic Controls,HC）
低氧训练组（Hypoxic Training,HT）
1.2训练方式HC组和HT组动物均生活在模拟海拔4 000 m高度的低氧舱中（氧浓度12.7％），每天至少保证22 h低氧时间。
低氧训练组经5 d跑台适应后，进入正式训练。训练在常氧条件下进行，训练方式为跑台练习：
跑台坡度＋10°，跑速20 m／min，每天1次，每次1 h，每周训练6 d，28 d后取材。
1.3取材腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（45 mg/kg），迅速剥离两侧浅层胫前肌，去除结缔组织，锡纸包叠后置于液氮中冻存。
1.4主要测试方法和仪器
1) 骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法（SDS-PAGE）。参照Talmadge(1993)［5］
2） 骨骼肌MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx/d、Ⅱb四个亚型mRNA 基因表达：（RT-PCR方法 ）
低氧设备：HYPOXIC TRAINING SYSTEMS, Hypoxico Inc.(USA)
PCR引物设计：PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司设计、合成。
引物序列如下表：
1.5统计分析
采用SPSS11.5统计软件，利用多因素方差一般线性模型（GLM）LSD方法检验各组间是否有显著性差异，P
2结果
2.1低氧、低氧耐力训练对肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成的影响
SDS-PAGE结果如***1所示，依各个亚型不同的电泳迁移速率由上向下依次为Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb、Ⅰ。
由***1和表1，慢型MHCⅠ比例不受低氧和低氧训练的影响；低氧、低氧训练均显著降低了Ⅱa比例，其中低氧对照组下降幅度更明显（P
上述结果可以总结为：单纯低氧降低了Ⅱa MHC蛋白表达，取而代之的是Ⅱx和Ⅱb MHC表达升高，即低氧引起“慢型”MHC向“快型”转化；低氧训练的效果与单纯低氧变化趋势一致。
2.2低氧、低氧耐力训练对MHCs mRNA表达的影响
3讨论
3.1低氧、低氧耐力训练对肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成的影响肌球蛋白是骨骼肌细胞中表达最多的蛋白，占总蛋白的25％，由两条重链和两对不同的轻链组成。因其具有ATP酶活性，所以又称肌球蛋白Ca2+-ATP酶，肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性高低,直接决定肌纤维的收缩力量和速度。
成年骨骼肌有Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC四种类型，由MHC确定的肌纤维最大收缩速度顺序为Ⅰ
目前学者们对低氧的关注很多，但低氧对肌纤维和MHC组成的报道为数并不多，且研究结果也不尽相同。
如Bigard［6］将Wistar鼠置于模拟5 500 m海拔环境中4周，足底肌Ⅰ、Ⅱa型MHC显著下降，Ⅱb MHC增加；比目鱼肌Ⅰ型MHC显著下降，Ⅱa MHC增加。肌纤维转换方向与我们实验一致，一般来说，肌纤维的转换容易发生在快肌纤维间，Ⅰ和Ⅱ型间很难相互转变，Bigard的实验足底肌Ⅰ型MHC向Ⅱ型MHC转换可能由于低氧刺激严重引发的。
多数低氧影响比目鱼肌结果都是Ⅰ型MHC下降，Ⅱa增加，或者SO肌纤维下降同时FOG增加［7］。
尽管上述一些研究显示低氧引起慢型MHC向快型转化，但若形成缺氧不明显MHC和肌纤维组成不会改变。
如Perhonen［8］对于Wistar鼠2 250～2 500 m高度低氧跑台训练观察氧化酶活性增加的同时，体重下降，但肌原纤维ATP酶方法检测的肌纤维组成无明显变化。
低氧影响肌纤维和MHC组成受低氧高度的制约。模拟低氧高度低，造成组织缺氧不足，不能引起肌纤维和MHC改变。
慢性低氧引起肌组织中的氧压水平较低可能是引起肌纤维转化的一个有利因素。低氧一般会使快肌纤维表达增加，这些肌纤维多数在低氧压条件下工作，一方面是由于它们毛细血管供应不足，另一方面它们在高强度练习中易被募集。
慢性持续性低氧与运动引起的低氧不同，前者持续时间久，且造成缺氧程度高，这可能更适于Ⅱb等快肌纤维的表达，Ⅱb肌纤维以糖酵解为主，比氧化型纤维如Ⅰ或Ⅱa更易受局部低氧的影响。
耐力训练是一种增加负荷的训练，有研究报道负荷强度适宜、持续时间足够长的耐力训练会引起快型MHC向慢型转化。如有研究大鼠轮跑4周比目鱼肌Ⅰ型MHC显著增加。SD大鼠75％强度跑台训练10周的实验观察到训练时间大于60 min时比目鱼肌MHCⅠ显著增加，同时MHCⅡa下降［9］。Wistar鼠4周耐力练习（20 m/min,60 min/d,5d／周）［10］结果显示，足底肌MHCⅡb下降的同时MHCⅡa明显增加。
本实验中低氧耐力训练组MHCⅡa下降幅度低于低氧对照组，与此同时MHCⅡb升高幅度同样低于低氧对照组，这可能缘于耐力训练易引起快型MHC向慢型转化。
3.2低氧、低氧耐力训练对MHCs mRNA表达的影响RT-PCR方法测定的各种MHC mRNA是在转录水平观察MHC的变化。转录是蛋白合成的前提，转录水平的变化为蛋白水平的改变提供可能性。
低氧对MHC mRNA的影响表现为MHC－Ⅱa mRNA显著增加，MHC－ⅠmRNA不显著减少。许多关于低氧影响MHC蛋白组成的研究也表明低氧会使慢型MHC向快型转化。低氧影响MHC蛋白的结果显示MHC－Ⅱa向MHC－Ⅱx和MHC－Ⅱb转化，虽然低氧影响MHC蛋白和mRNA表达改变的具体MHC不同，但均显示快型MHC表达的增加。具体MHC不同的原因可能在于mRNA的增加能在刺激的即刻发生，其半衰期约为2～3 d，而相应蛋白的半衰期为2～3周［11］，MHC表型的表达可能是MHCmRNA与蛋白不同时机上调和下调的结果。因而MHC表型表达与MHCmRNA间会出现错配的现象。除此之外，翻译或翻译后机制的调控也妨碍mRNA准确地表达蛋白活性［12-15］。
4结语
低氧及低氧耐力训练作为一种剧烈的缺氧刺激，不仅能增加骨骼肌毛细血管的分布，改善局部血液供应，增加有氧氧化酶活性，还能引起骨骼肌微细结构的改变，本研究显示快型肌球蛋白重链表达增加，基因和蛋白表达均有表现。肌球蛋白是骨骼肌内主要的结构蛋白和收缩蛋白，其组成的改变直接会影响到肌肉的收缩速度、收缩力量及其他代谢特性。此实验必将会对低氧训练的深入研究提供一有益的启示。
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