学文网1微卫星DNA与遗传标记的发展
当DNA上的多态性顺序与某一位点(常用在致病位点)连锁时,我们便可利用其作为一种标记物,进行遗传缺陷的产前诊断、杂合子携带者的鉴定以及亲子鉴定、群体研究等。遗传标记的发展大致可以分为RFLP、VNTR(主要指小卫星DNA)、微卫星DNA3个阶段。1978年Kan和Dozy第1次发现限制性片段长度多态性(RFLP)并用于镰刀形细胞贫血症的诊断。1980年Bostein等预言有可能利用分布在整个基因组中的RFLP作为连锁研究的遗传标记。但RFLP酶切片段在人群中的高频率杂合子往往较难发现,在基因组中的多态程度往往也较低,这就限制了其应用。小卫星DNA是RFLP之后的又一类多态性遗传标记。它首先由Wyman和While在筛选人类基因文库时发现,随后Bell等又在人胰岛素基因上游363bp处发现一种小卫星DNA。它也具有种类多,分布广,高度多态等特点,作为一种遗传标记,它比RFLP更具有应用价值。1989年Litt和Weber等两个研究小组分别用PCR证明一种(CA)/(GT)的二核苷酸串联重复顺序具有高度的多态性[4,5];随后Edwards等又发现了三核苷酸和四核苷酸串联重复顺序的多态性[6],人们称这种串联重复顺序为微卫星DNA,从符合遗传标记的高度多态,杂合性高,突变率低等标准来说,微卫星DNA比小卫星DNA更优越;且在方法上由于微卫星DNA长度较短,更适合于PCR扩增。1991年“冷泉港基因组作***和序列分析会议”提出了对微卫星DNA研究的重视和投入。尽管人们首先发现的是二核苷酸微卫星DNA,但现在人们正把目光越来越多地投向三核苷酸微卫星DNA和四核苷酸微卫星DNA,三核苷酸微卫星DNA和四核苷酸微卫星DNA也显示出二核苷酸微卫星DNA那样的多态性,但更易检测,且电泳***谱上没有二核苷酸微卫星DNA常常产生的复合带纹[原因是DNA双链在变性胶上解开,含(AC)重复的链与含(TG)重复的链移动速率不同]。Edwards等研究表明三联和四联重复顺序比二联重复顺序变异性更高且扩增更忠实,且发现只有三联重复顺序可能存在于编码区,如他们发现(AGC)重复顺序存在于人雄激素受体基因和果蝇切迹基因的蛋白质编码区[6]。目前三联与四联重复顺序的不稳定性与人类疾病的关系正越来越多地引起人们的注意。
2微卫量DNA在医学遗传中的应用
2.1微卫星DNA与基因定位和基因组研究基因定位最早是在实验动植物中进行的。1911年Wilson利用连锁分析第一次将色盲基因定位在X染色体上。但是运用连锁分析定位孟德尔遗传式疾病的致病基因以及连锁***谱的完成需要高效标记的获得,长期以来由于缺少一种既具高信息量又均匀分布的标记,连锁***谱一直是项费力费时的工作。遗传标记的多态性信息量(PIC)是指某一家系可以利用某一多态性位点或单体型作为遗传标记进行基因连锁分析的概率,通过PIC可以衡量一个多态性位点的好坏。一个好的多态性位点应具有的特性是:检测方法简单可行;与被检测的致病位点尽可能近,即紧密连锁;各等位基因在群体中的频率尽可能高,即有较高的杂合度,使被测个体在该位点尽可能为杂合子。微卫星DNA多态性的发现使基因组的遗传***谱工作进入了一个新的阶段,并且使疾病基因的定位也更容易。其原理是:对特定染色体上的特定遗传标记进行PCR扩增,首先将其连锁到染色体某一区带然后依次减小到物理距离,这些标记也可用于YAC物理***谱以及遗传***谱与物理***谱的相互关系上。微卫星DNA的扩增片段一般在100～500bp,在聚丙烯酰胺顺序胶上可达到一个碱基的分辨率。用微卫星DNA作标记可使人类遗传性疾病基因的定位能在半年甚至更短的时间内就能完成,并且随着标记的增多,连锁距离能被减小到几个厘米。这种进展在其它哺***动物,如大鼠和小鼠中也得到实现。Murry等用微卫星标记构建了人的高分辨全基因组***谱,筛选出500个GATA类的克隆,15个CEPH家族的标记定出了基因型,而且将基因型信息不断加入遗传***中。Wilsondisease(WND)是一种常染色体隐性遗传病,Bowcock等将疾病相关基因定位在D13S31与D13S59之间,并且构建了一个YAC,长约4.5mb,包括9个高度多态的微卫星标记,D13S31与D13S59也在其中[7]。到目前为止,微卫星DNA在应用上最成功的例子要数人和小鼠基因组高密度连锁***谱的完成[8]。《Science》1994.9报道:经过3个发掘微卫星DNA的团体和110个CEPH合作者的努力,已经完成了一个完整的连锁***谱,它包括5840个位点(其中970个为单一顺序),涵盖4000个cM;在这些位点中,3617个为微卫星标记,427个为基因,平均每0.7个cM就有一个标记。这一成功为物理***谱的完成做了很好的准备,达到了人类基因组工程的第一个目标。有研究表明,在所有已完成的人群多态性研究中,Y染色体表现出相当低的多态性,迄今为止发现的微卫星位点仅为10个左右,但是Y染色体连锁的多态性位点在进化研究中却有其独特地位,原因在于其父系遗传方式和无重组现象[9]。另外对于微卫星DNA的研究也要注意一个问题:即突变频率有时是不可忽略的;这种突变率在不同标记间是不同的,估计在10-5～10-3之间,某些标记可能更高一些,这在连锁不平衡研究和其他非参数分析中必须考虑到,尤其在等位基因频率计算中要注意。此外微卫星DNA的多样性在非洲人中是最高的,这与其他遗传标记正好相反,但是却支持了非洲起源的假说[10]。
2.2微卫星DNA与遗传性疾病及肿瘤大量实验表明微卫星DNA重复单位数目的不稳定性与一些人类遗传性疾病有关,到目前为止已发现有8种相关的疾病,属于CGG/CCG重复的有:脆性X综合征、Fraxe综合征;属于CAG/CTG重复的有:重症肌无力(DM)、X连锁的脊柱和延髓肌萎缩(X-linkedspinalandbul-barmuscularatrophy)、脊髓与小脑运动失调-Ⅰ型(Spinocerebellarataxiatype-1,SCA1)、Huntington舞蹈征、齿状核与苍白球萎缩征(Dentatorubral-palli-doluysianatrophy)、Machado-Joseph综合征。在脆性X综合征中,FMR1gene中的(CGG)顺序在正常人中的重复次数少于60次,携带者60～100次,而发病者则多于100次[11]。Huntington舞蹈症的突变基因中(CAG)重复次数往往超过35次,Andrew等证明扩展的(CAG)序列在通过种系的传递过程中是不稳定的[12]。而对于MJD,在MJD基因(14q32.1)中的(CAG)重复次数在正常人为12～37次,而发病者为62～84次,并且发现男性比女性变异大[13]。Richard和Southerland称这种不稳定的突变为动态突变,突变情况和重复单位数目有关,且突变体往往具有和前一辈不同的突变频率。最近发现的微卫星DNA与肿瘤的密切关系更引起了人们的极大兴趣。Peltomaki发现了遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)与微卫星DNA的密切关系。作者一共用了345个微卫星标记进行筛查,发现HNPCC基因与D2S123标记紧密连锁,并且大多数HNPCC肿瘤中的D2S123片段电泳泳动速率与正常组织中的片段不同,在D2S123标记两侧的D2S119、D2S147以及其他染色体上的某些标记片段也有电泳速率的改变,说明各标记片段长度有变化。这种微卫星不稳定现象发现存在于HNPCC肿瘤中,但在散发性肿瘤中非常少见[14]。此外Thibodean等在对90例结直癌研究中也发现微卫星不稳定现象,变化程度为从2bp到大片段的缺失或扩增[15]。因为子宫内膜癌常与HN-PCC关联,Burks等研究了30例子宫内膜癌患者,发现7例(23%)表现微卫星不稳定现象,作者认为这种遗传上的变异可能是此类肿瘤在发生上的重要特征。Ionov则发现12%的结直肠癌在(AT)顺序和其他简单串联重复顺序上存在缺失,作者认为这种突变可能反映了结肠的癌变是由于DNA复制或修复的不忠实造成[16]。近来利用微卫星DNA对***-卵巢癌的研究大大增多,研究首先是用许多微卫星标记对患者家系进行连锁分析,将疾病相关基因定位于17q21,命名为BRCA1[17,18],现已经发现最常见的BRCA1突变是第2个外显子中一个2bp的缺失[19]。
2.3个体识别Southern杂交技术和大量VNTRs位点的发现使DNA作***广泛应用到个体识别上,于是VNTR很快取代了以往的HLA分型。现在又发展到应用微卫星DNA来进行个体识别。其优点在于快速、简便、所需DNA量少,相比较Southern分析,只需要其1/10～1/100量的DNA,来自粗血溶解物或滤纸上的一点血迹就可以进行分析,这一特点大大适用于法庭分析,因为这种情况下往往不可能得到完整的高分子量DNA。在操作方法上可以使用多重PCR来简化分析,引物设计在24bp左右,(GC)含量约为50%,因此所有扩增反应都有相近的溶解温度,可以一次同时进行。Alford等利用9个微卫星标记做了50例亲子鉴定,准确率达99.73%[20]。Hammond等用13个不相连锁的微卫星标记对4组人群进行了分析,并且证明可以用在解决实验室样品的混淆、骨髓移植、亲子鉴定、性袭击以及各种刑事鉴定中[21]。有些学者还利用了微卫星DNA对某些古代人的遗迹进行分析,这在考古学方面显然是一个新的应用,但要避免样品的混淆和真伪问题。此外目前应用在个体识别上的建立在PCR基础之上的方法也尚有不足:(1)大多数微卫星标记的变异是有限的,平均杂合度小于70%～80%,因此往往需要超过9个(可能要18个)位点才能起到作用;(2)易受近亲繁殖和人群结构的影响。Pena认为目前的检验方法若配合多位点的微卫星探针(MLP)或恰当数目的单位点探针(SLP)会更有效[22]。
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