学文网【摘要】腕足动物门（Brachiopoda）是最古老的Body plan之一，最早发现于早寒武世，繁盛于志留、泥盆二纪，其后延续至今[1-3]。多数腕足动物类群现已灭绝，舌形贝（Lingula Bruguire）是仅存的现生腕足动物之一。本文在Halanych等最新腕足动物分类标准的大前提下[3]，以Lingula Bruguire为研究对象，通过microRNA谱的特征分析[4]，探索原口动物与后口动物共同祖先（Protostome-deuterostome ancestor， PDA）的microRNA祖征（Plesiomorphy）状态[5]。本研究中，我们首先提取成体Lingula Bruguire的总RNA，然后以标准方法特异性提取其中的总MicroRNA，运用东南大学自主研发的AG-100高通量测序平台和ABI Solid 3.0测序系统，检测成体Lingula Bruguire的microRNA表达状态。在此基础之上，运用现代生物信息学手段，结合MiRBase现有数据，逐级分析现生触手冠类群（Lophophorata）、冠轮动物（Lophotrochozoa）和所有两侧对称动物（Bilateria）的microRNA分布关系，推测出PDA基因组可能拥有let-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5个microRNA，为研究microRNA在真后生动物（Eumetazoa）亿万年演化历程中的相关变化提供研究基础。
【关键词】舌形贝；microRNA；腕足动物门；早寒武世；演化生物学
介绍
舌形贝（Lingula Bruguire）类，俗名海豆芽，最早出现于早寒武世[1]，属腕足动物门（Brachiopoda）/舌形贝型亚门（Linguliformea）/舌形贝纲（Lingulata）/舌形贝目（Linguilida）/舌形贝超科（Linguloidea）/舌形贝科（Lingulidae）[6，7]。其壳由几丁质组成，常见于热带及亚热带的浅海近滩。现生舌形贝类与相关化石属比较，形态变化甚微，是现生真后生动物次亚界中最古老、形态变化最小的物种之一。
***1为现生舌形贝类与相关化石属的形态比较，***中可看出，二者形态结构差异甚微，表明5亿多年的演化历程并没有对舌形贝类的形态结构造成较大影响。由于触手冠类群在形态结构和胚胎发育等方面，同时具有原口动物和后口动物两方面特征，其分类地位至今仍存较大争论[2， 3]。触手冠类群的分类大致有以下四种观点：1、由于触手冠类群大多具有其独特的滤食器官—轮器（Lophophoral organ）[8.10]，在物种分类上被认为是有别于冠轮动物，而***成支[8.9]；2、因触手冠类群与后口动物具有一些相似的胚胎发育共性（如三体腔结构等），故归于后口类群[13.14]；3、鉴于触手冠类群兼有原口和后口动物的混合发育特征[8.11]，有些学者主张把触手冠类群单独划分为一个***于原口和后口动物之外的类群[2]；4、基于不完整18s DNA序列的单基因系统发生（Phylogeny）分析，将触手冠类群划入原口动物[12]。为解决上述分类争议，Halanych等利用完整的18s DNA序列重新解读了相关门类的演化关系，把触手冠类群重新鉴定为一个完整的超门类群，与担轮动物（Trochozoa）共同构成更高一级分类的冠轮类群（Lophotrochozoa），冠轮动物与蜕皮动物（Ecdysozoa）共同组成真后生动物次亚界（Eumetazoa）的最大分支——原口动物类群（Protostomia）[9]。在此基础之上，原口动物与后口动物（Deuterostomia）及扁虫动物总门（Platyzoa）共同构成两侧对称动物[15-16]。综合分析现有触手冠类群分类格局，本文以Halanych等的分类观点为研究背景，以舌形贝类为研究对象，从microRNA角度出发[4]探索Brachiopoda与其它Body plan之间的演化关系[5]。本研究中，我们首先提取成体Lingula Bruguire的总RNA，然后以标准方法（mirVana? RNA Isolation Kit）特异性提取其中的MicroRNA，运用高通量测序平台和现代生物信息先进分析手段，检测成体Lingula Bruguire的microRNA表达状态，结合MiRBase现有数据，鉴定触手冠类群（Lophophorata）、冠轮动物（Lophotrochozoa）及原始两侧对称动物（Bilateria）的microRNA分布类型，研究microRNA在真后生动物次亚界（Eumetazoa）演化历程中的相关变化。
材料与方法
样本收集
舌形贝（Lingula Bruguire）样本取自广西北海。以15倍体积的RNAlater（ABI，am7020）于4℃过夜保存新鲜样本，第二天转入-20℃长期保存（有效期为1年）。
文库制备
采用液氮碾磨法，按标准流程提取总RNA（life technologies公司主页，http：///）。采用mirVana? RNA Isolation Kit（AM1556）提取总RNA中的总miRNA，按照AG-100和SOLiD 3.0高通量测序平台各自的测序流程要求，对相关的总microRNA分布进行测序文库制备。所用相关试剂均购自Life Technologies公司和无锡艾吉因生物信息技术股份有限公司。
测序流程
使用SOLiD 3.0和AG_100两高通量测序平台，对相关测序文库分别上机测序，测序流程完全遵守相关操作要求。
信息分析
首先利用SOLiD 3.0和AG_100两测序平台的自动分析软件，对原始测序数据进行初步筛选聚类，过滤掉rRNA、tRNA以及其它各种类型的非编码RNA，获得精确测序数据。然后利用Rfam、MIREAP等经典分析手段对测序所得数据进一步细化分析。再结合miRBase、NCBI等大型数据库对相关测序数据进行深度分析总结。
试验结果
经过三轮精确数据分析，确定成体舌形贝至少表达let-7、miR-749、miR-548、miR-221、miR-79、miR-133、miR-15、miR-1729、miR-184、miR-2284、miR-146、miR-128、miR-3426、miR-194、miR-10、miR-92等microRNAs，其序列信息和表达丰度关系如表1和***2。从表1和***2可看出，和其它大多数动物一样，舌形贝也表现为let-7高表达状态，let-7最早发现于线虫（Caenorhabditis elegans），主要行使调控细胞周期等生理功能。
根据现有文献的相关介绍和成体舌形贝的组织学基础，从演化生物学角度，挑选生理功能保守且已研究清楚的microRNA，进行生理功能概略分析，从而简要推测成体舌形贝的相关生理学特征。miRNA-221可通过负调控细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1B/p27和CDKN1C/p57来促进内皮细胞的增殖。miR-133为肌肉特异性miRNAs，是一种强有力的非肌性基因的表达抑制因子，Chen等发现miR-133在骨骼肌细胞分化成熟过程中的有效表达，可成功抑制非肌性基因，从而提高成肌细胞的增殖速度。miR-15能从转录后水平对Bcl-2进行负调节，从而引起细胞的凋亡，另外，miR-15a可抑制cyclin E及其它细胞周期调节因子的合成。miR-184对上皮细胞的黏附及迁移具有调控作用，miR-184可促进细胞迁移，同时miR-184还在细胞凋亡中发挥重要作用，超表达miR-184可导致细胞进入凋亡程序。miR-146能够促进转录抑制因子ReIB结合到TNF-α的启动子上，来抑制细胞凋亡。miRNA-128在神经系统的发育过程中肩负重要调控作用。miR-10能够有效抑制Hox1和Hox3的表达。miR-92在性别调控过程中参与雄性性腺的发育分化。从上述microRNA的保守生理功能出发，可看出舌形贝的细胞凋亡与细胞周期调控机制与其它动物基本一致，其肌细胞塑型基因的调控机制已基本健全，其体腔上皮细胞的迁移调控已经基本成型。从表1中可以看出let-7、miR-749、miR-548、miR-221、miR-79、miR-133等microRNAs于成体舌形贝机体的表达量较高，但结合现有文献的相关报道和舌形贝的组织学特征，很难直接判断miR-749、miR-548、miR-79等microRNAs在成体舌形贝机体内如何行使生理功能，这部分工作需要进一步的功能性试验来补充。
讨论
将上述数据与miRBase中冠轮类群、蜕皮类群和后口类群的microRNAs进行演化生物学比较分析。分析结果显示，舌形贝与冠轮动物共有microRNAs包括：let-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79和miR-749（按同一门内物种间共有频率由大到小排序）。
从***3可看出，let-7和miR-10为所有冠轮动物共有的microRNAs，而miR-133、miR-184、miR-92和miR-79等4个microRNAs可能是冠轮动物的祖征microRNAs。
再结合蜕皮动物的现有数据，放大到整个原口动物类群，可看出let-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79等6个microRNAs为原口动物共同祖先的祖征microRNAs；再进一步结合后口动物现有数据，放大分析范围，可看出let-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5个microRNA可能为原口—后口动物共同祖先所拥有的microRNA。
进一步结合现生原始两侧对称动物—真涡虫（Schmidtea mediterranea）的microRNA数据进行放大比较，可发现真涡虫的microRNA特征与原口动物相似，共同拥有let-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79等6个microRNA。现生真涡虫并不具有口和的分化，一直被认为是原始的两侧对称动物的现生代表和原口—后口动物的共同祖先类型，但从本研究得到的microRNA数据出发，可推测出原口和后口动物的祖先可能在口与分化之前就已分离，从而间接支持异无动物门为后口动物祖先类型[16]的结论。