学文网【摘 要】DGGE 技术是由Fischer等于1979年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。1993年，Muyzer等将DGGE技术应用于微生物的生态学研究，并且证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性[2]。与传统的菌种分离培养技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更准确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不可培养的菌株。由于DGGE技术具有重现性高、可靠性强和高效快捷等优点[3]，现以用于微生物群落的复杂性分析、检测微生物种群动态变化、对比细菌的富集培养及分离培养、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品研究以及发酵工艺、植物内生真菌研究、种群演替规律研究等领域广泛应用。
【关键词】DGGE；微生态；纯培养
1.DGGE技术的原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳***谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DN段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区―GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
2.DGGE技术在微生物生态学中的应用
自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培养的[5]，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的实验方法下不能提供足够的微生物学信息，这严重阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观认识。PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer 等人于1993年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分研究都是通过扩增原核生物 16S rDNA 基因来研究各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而研究真菌的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来研究功能基因及功能菌群的差异。
Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，研究Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培养和形态学研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本直接进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDN段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培养的菌株的检测提供了新的方法[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。
PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态变化。宋亚娜等运用16SrDNA和18S rDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，研究不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显改变玉米的根际细菌、真菌的菌落结构[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的变化，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都减少，并且一年后真菌的多样性并没有完全恢复到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌减少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的改变，并且六个月后就与对照组没有显著差异了[11]。
PCR-DGGE技术还可用于发现新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培养的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培养手段及单纯的分子技术方法均没有发现的[12]。
3.DGGE技术的局限性及改进方法
DGGE 技术作为一种分子生物学手段在研究微生物群落的动态行为和复杂性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外（如PCR产物偏差等），本身也有一定的应用局限性。
首先，利用DGGE分离的PCR产物一般要求DNA长度在200～ 700bp范围内[1]，超出该范围DGGE的分辨率会下降，然而这些序列只能提供有限的系统发育信息，不利于判断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer研究发现该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析[1]。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因[13]，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另外，如果选用的条件不是特别适宜就不能保证将每类DN段完全分开，这样序列不同的DN段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌[14]。
对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而减少误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培养、直接形态观察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的认识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态研究中发挥更大的作用。
【参考文献】
[1]Fischer S G，Lerman L S.Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis[J].Cell，1979，（16）：191-200.
[2]MuyzerG，Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerasechain reaction amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，59：695-700.
[3]邢德峰，任南琪，宋业颖等.DG-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及其种群多样性[J].生态学报，2005，25（7）：296-301.
[4]朱南山，李丽立，张彬.变性梯度凝胶电泳技术的原理及其在畜牧业中的应用[J].广东畜牧兽医科技，2007，32（2）：14-16.
[5]张宝涛，王立群，伍宁丰.PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用[J].生物信息学，2006，3：132-134.
[6]AmannRI，Ludwig W，Schleifer K.Phylogenetic identification and in situdetection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.
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[10]Zhou Jian zhong，Liu Xiaoli，Jiang Hanhu.Analysis of the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis[J].Food Microbiology.2009，26：770-775.
[11]宋亚娜，包兴国，李隆等.利用DGGE法研究不同种植体系中根际微生物群落结构[J].生物学杂志，2006.23（5）：12-16.
[12]YukoTakadaHoshino，NaoyukiMatsumoto.Changesinfungalcommunity structure in bulk soil and spinach rhizosphere soil after chemical fumigation as revealed by18S rDNA PCR-DGGE[J].Soil Science and Plant Nutrition，2007，53：40-55.
[13]，毕学***，汝少国.DNA提取方法对活性污泥微生物多样性PCR-DGGE检测的影响[J].安全与环境学报，2007，（2）：53-57.
[14]Klapponbach J A，Saxman P R，Cole J R，etal .The ribosomal RNA operon copy number database[J].Nucleic Acids Res，2001，29：181-184.
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