学文网【摘要】 目的：探讨DNA-PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法：通过对DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的构建及有效干扰载体的筛选，流式细胞仪检测G2期。结果：转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后进入G2期的细胞比率无差异；转染CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.618，P=0.026），28h时明显低于Hela细胞（t=2.705，P=0.022）；转染DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.965，P=0.014），28h时明显低于Hela细胞（t=2.302，P=0.044）。结论：干扰DNA-PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。
【关键词】 辐射敏感性； 卵巢癌； DNA依赖的蛋白激酶； 检查点激酶1
卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢位于盆腔深处，比较隐蔽，使得早期卵巢癌患者缺乏特异的临床症状和有效的检测手段[1，2]，因此，绝大多数患者在明确诊断时肿瘤已经发生转移，严重威胁着妇女的生命健康[3，4]。本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞周期变化及其ATM信号传导途径中DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）和检查点激酶1（checkpoint kinase ，CHK1）等分子表达的变化，探讨其辐射敏感性差异的机制。
1资料与方法
1.1主要试剂和仪器
pGPU6/GFP/Neo购于上海吉玛制药技术有限公司；BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA ligase、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver3.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver3.0 、E.coli Competent Cells JM109购于日本TaKaRa；Anti-human DNA-PK、Anti-human CHK1购于英国Abcom公司；LipofectamineTM 2000购于Invitrogen。Philip深部X射线***机、美国BD公司FACScan流式细胞仪、AnnexinⅤ–FITC细胞凋亡检测试剂盒。
1.2方法
1.2.1寡核苷酸的设计、合成根据人DNA-PK和CHK1在GenBank登录号HSU34994、AF016582，选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择DNA-PK和CHK1干扰RNA的靶点，设计shRNA。在shRNA中的loop结构选择TTCAAGAGA，避免终止信号的形成，转录终止信号选用T6结构。shRNA正义链的5’端添加CACC序列，与BbsⅠ酶切后形成的粘末端互补；反义链的5’端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的粘末端互补。如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC序列后补加一个G。
1.2.2寡核苷酸的退火将合成的DNA oligo用TE（pH8.0）溶解，调整浓度为100 μM。取相应的正义链和反义链oligo溶液。配制反应体系：10×shDNA Annealing Buffer 5μl、sense strand （100 μM）5μl、antisense strand （100μM） 5μl、ddH2O 35μl、Total 50μl。退火条件：95℃ 5min、85℃ 5min、75℃5min、70℃5min，4℃保存。退火反应后得到浓度为10μM的双链oligo DNA，将其稀释500倍，使终浓度为20 nM。
1.2.3载体构建、酶切、鉴定、测序pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体线性化、琼脂糖凝胶回收、双链oligo DNA与线性载体连接、JM 109感受态细胞转化、质粒提取。酶切反应体系：重组质粒1μg、10×Buffer 2μl、BamHⅠ or PstⅠ1μl、ddH2O To 20 μl，37℃酶切1h，1%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。选取阳性重组质粒测序（上海英骏生物技术有限公司），应用NCBI上的Align two （or more） sequences using BLAST （bl2seq）软件分析所测得的序列。
1.2.4照射条件将细胞以3×105个/孔接种于6孔培养板，照射前用PBS洗细胞2次，加入新鲜的PBS 2ml。分别以0、2、4、6、8、10Gy进行照射，照射后立即更换完全培养基。照射条件：电压200kV，电流10 mA，滤板0.5 mm Cu和1.0 mm Al，球靶距50cm，剂量率0.287 Gy/min。将有效的shRNA载体以脂质体LipofectamineTM2000介导分别转染Skov3和Hela细胞、RNA提取后行RT-PCR。经0、2、4、6、8、10Gy X-射线照射的Skov3细胞和Hela细胞，流式细胞仪分析其凋亡百分数显示Skov3细胞凋亡率分别是1.5%、2.18%、2.9%、4.67%、5.6%、12.5%，Hela细胞凋亡百分数分别是1.1%、19.79%、39.3%、56.7%、70.1%、76.2%。根据此结果，在本研究中选择2Gy作为X射线照射剂量。
1.2.5流式细胞术分析DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA转染细胞后20hr，X-射线照射，继续培养4h或28h，即shRNA转染后24h或48h，分别收集各组细胞，PBS洗涤3次，标记Annexin Ⅴ/PI和PI，美国Becton Dickinson流式细胞术检测其细胞周期的变化，应用软件CellQuest，Modifit分析。各细胞周期的差异变化（fold change， FC）是处理组与对照组的比值。
1.2.6统计学分析应用SPSS14进行统计分析；t检验分析处理组与未处理组间的差异及Skov3细胞和Hela细胞间的差异。P≤0.05则认为差异有统计学意义。
2结果
2.1X-射线照射诱导Skov3细胞和Hela细胞G2期的差异
3讨论
射线对肿瘤细胞的杀伤效应主要是造成细胞的DNA损伤，引起DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）[5]。DDR是一个异常复杂的调控系统，是细胞内一种非常保守的抵御外界及内在因素诱导的DNA损伤的机制，对肿瘤的发生、发展及***具有重要的作用。DNA损伤反应代表了一个多重信号传导通路的复杂网络系统，涉及细胞周期检查点（checkpoint）、DNA损伤修复、转录调控和细胞凋亡（apoptosis）等[6]，通过这些过程细胞可在各种内源性的代谢或环境压力下保持基因组的完整性。其中DNA损伤修复能力和细胞周期调控是影响辐射敏感性的两个主要因素[7]，也就是DNA损伤应答能力影响辐射敏感性。研究表明神经胶质瘤细胞虽然具有高效的DDR，但同时具有顽固的辐射抵抗性，这也是胶质母细胞瘤难以治愈的原因[8]。因此推测，卵巢癌对辐射抵抗性的机制可能也与DDR有关。
当损伤发生时，损伤的DNA激活损伤感受器共济失调性毛细血管扩张症突变基因（Ataxia-telangiectasia mutatedgene，ATM）、运动失调性毛细血管扩张症突变基因ATM相关基因（Ataxia-telangiectasia and Rad-3 related，ATR）、DNA-PK，后者激活细胞周期检查点CHK1，阻断S-期起始、延迟S-期进程，或防止有丝***起始[9]，来阻滞细胞周期进程，修复损伤的DNA[10]。这些过程指导周期特异性修复机制，如碱基切除修复（Base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（Nucleotide excision repair，NER）、错配修复（Mismatch repair，MMR）或双链断裂（Double-strand breaks，DSBs）修复，后者又包括同源重组（Homology recombination ，HR）和非同源末端连接（Non-homology end joining，NHEJ），其中NHEJ是DNA双链断裂修复的主要途径。在NHEJ修复中DNA-PK是关键酶，其磷酸化是NHEJ所必需的，且主要应答辐射诱导的DNA损伤，决定损伤细胞的转归。如果修复失败，检查点启动p53-依赖或p53-非依赖的细胞凋亡。CHK1检查点是DDR网络从损伤传感器到修复或细胞凋亡的中心[11]。如果这些应答机制存在缺陷，将增强各种因素对DNA损伤的敏感性。DNA损伤识别、修复的关键酶DNA-PK决定损伤细胞的转归、修复错误或失败，DNA变异或诱导细胞进入凋亡程序[12]。
研究证实，绝大多数肿瘤细胞缺少G1期检查点，从而导致细胞复制过程具有G2 期检查点依赖性[13]，而G2期阻滞是DNA损伤修复完成，使染色质分开、细胞***的最后关卡。因此G2期检查点消除或缺少G2期阻滞可以使肿瘤细胞对辐射敏感性增高，提高细胞的凋亡率或死亡率[14]。本研究流式细胞术检测结果显示，转染DNA-PK shRNA-5297、CHK1 shRNA、DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的Skov3细胞照射后4h进入G2期的比例减少，为15.84%～18.56%，28h进入G2期的比例继续减少，为5.72%～11.26%；而Hela细胞4h进入G2期的比例下降，为10.12%～14.38%， 28h 进入G2期的比例继续下降，为9.01%～11.92%。G2期阻滞解除，增加细胞的凋亡率。经差异变化分析比较转染CHK1 shRNA、DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的Skov3细胞照射后4h，进入G2期的细胞比例明显高于Hela细胞，而28h却低于Hela细胞。提示干扰DNA-PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性，为卵巢癌***提供新的途径。
参考文献
[1]崔永伟，颜廷婷.CT、超声、CA125联合检测在卵巢癌诊断中的应用分析. 中国性科学，2012，21（9）：37-38.
[2]晏华，刘永生，晏楠，等. 经***彩色多普勒超声诊断卵巢肿瘤.中国性科学，2007，16（4）：18-19.
[3]丰有吉，沈铿主编.妇产科学.2版.北京：人民卫生出版社，2012：340.
[4]董桂苹.影响激素依赖性肿瘤患者生存的因素——激素替代***（HRT）.中国性科学，2007，16（10）：20-22.
[5]Ciccia A， Elledge SJ. The DNA damage response： making it safe to play with knives.Mol Cell，2010（40）：179-204.
[6]Bartek J， Lukas J. DNA damage checkpoints： from initiation to recovery or adaptation. Curr Opin Cell Biol，2007（19）：238-245.
[7]Choudhury A， Cuddihy A， Bristow RG.Radiation and new molecular agents part I： targeting ATM-ATR checkpoints， DNA repair， and the proteasome. Semin Radiat Oncol，2006，16（1）：51-58.
[8]Bao S， Wu Q， McLendon RE， et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.Nature， 2006，444（7120）：756 760.
[9]Lobrich M， Jeggo PA. The impact of a negligent G2/M checkpoint on genomic instability and cancer induction. Nat Rev Cancer， 2007，7（11）：861-869.
[10]Smith J， Tho LM， Xu N， et al. The ATM-Chk2 and ATR-Chk1 pathways in DNA damage signaling and cancer. Adv Cancer Res，2010（108）：73-112.
[11]Kastan MB， Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature，2004，432（7015）：316-323.
[12]Shrivastav M，De Haro LP，Nickoloff JA.Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res， 2008，18（1）： 134-147.
[13]Harper JW，Elledge SJ.The DNA damage response：ten years after.Mol Cell， 2007，28（5）：739-745.
[14]廖琪. CHK1 shRNA-617 与卵巢癌 Skov3 细胞放疗敏感性的研究.中国性科学，2013，22（5）：32-34.
转载请注明出处学文网 » DNA依赖的蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞的研究