学文网摘要：目的 观察青蒿琥酯对人结肠癌细胞系SW620细胞增殖、细胞周期及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p16、p21、p27）表达的变化，探讨ART可能的作用机制。
方法：不同浓度青蒿琥酯作用SW620细胞后，MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期，Western blot分别检测细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p16、p21、p27）蛋白变化。
结果：在一定浓度范围之内，青蒿琥酯能抑制SW620细胞增殖，细胞周期发生G1―S期阻滞，并上调p21、 p27的蛋白、mRNA水平，但对p16的蛋白、mRNA水平没有影响。
结论：青蒿琥酯可抑制人结肠癌细胞增殖，其机制与上调p21 、p27蛋白有关。
关键词： 青蒿琥酯；结肠肿瘤；细胞周期； p16； p21；p27
Effect of Artemisunate on proliferation ,cell cycle and the expression of cyclin-dependent kinase inhibitors(p16,p21,p27) of human colon carcinoma cell line SW620
Abstrat：AIM To study the prolifration, cell cycle and expression of CKIs of human colon carcinoma cell line SW620 treated with artemisunate（ART）, and to investigate the mechanism of ART to inhibit tumor cell’s growth and induce their differentiation.
METHODS：After SW620 cells treated with varible dose ART, we detectd the proliferation by MTT，observed cell cycle by flow cytometer,stuied the protein level of CKIs (p16, p21, p27) using Western blot.
RESULTS：ART could inhibit the proliferation of SW620, and caused about G1 phase arrest and up-regulate the level of protein of p21 as well as p27, but have no effect on the level of protein of p16.
CONCLUSIONS：ART could inhibit proliferation and induce differentiation in human colon cancer cell line SW620 through up-regulating of expression of CKIs, especially p21 and p27.
Key words：Artemisunate; Colon cancer;Cell cyclecyclin-dependent kinase inhibitors(CKIs); p16; p21;p27
青蒿琥酯（Artemisunate，ART）是我国研制的抗疟药品。研究发现，青蒿琥酯具有重要的抗肿瘤作用[1，2]，但是其抗癌机制尚不完全清楚。P16、p21、p27蛋白是细胞周期重要的调控因子，属于细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs），对细胞周期的负调控作用[3]。在多种肿瘤细胞系和实体瘤中都不同程度地存在CKIs表达失活的情况[4]。我们选用人结肠癌细胞SW620为模型，作用后，观察了ART对细胞增殖、细胞周期以及p16、p21、p27表达的变化情况，以探讨ART可能的作用机制。
材料和方法
1.细胞 人结肠癌细胞系SW620购自中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所，在37℃，5%CO2培养箱中培养，培养液为含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640（美国GIBCO BRL）。
2.MTT法 青蒿琥酯，广西桂林第二制药厂产品，用0.5%NaHCO3溶解后再用生理盐水配置成所需浓度。取对数生长期的SW620细胞，调整细胞浓度为2×104/ml，按每孔0.1ml接种于96孔细胞培养板中。无血清RPMI-1640同步化48h后，加入ART。设立空白对照组和不同ART作用浓度实验组，每组均设立3个复孔。培养72h后进行MTT比色并绘制ART浓度与A570之间的关系曲线。细胞抑制率=[（A对照-A实验）/（A对照）]Χ100%。
3.流式细胞仪检测细胞周期 实验分组和ART处理同MTT检测。收集ART不同作用浓度的细胞，用预冷的PBS洗涤2次后加入70%乙醇1.0ml固定细胞。上机前离心洗涤制成单细胞悬液，加PI（Sigma 公司）染色，暗室放置，用流式细胞仪检测细胞周期分布。
4.Western blot检测CKIs（p16、p21、p27）蛋白水平 采用western blot检测p16、p21、p27蛋白水平，步骤参照文献[5]。主要蛋白抽提试剂NP-40、PMSF、Aprotinin 购自上海Sangon公司，BCA蛋白分析试剂盒购自PIERCE公司，鼠抗p16、p21、p27的单克隆抗体购自Santa Cruz公司，内参照兔抗b-actin多克隆抗体购自武汉博士德公司。分别收集ART不同作用浓度细胞的总蛋白，定量后进行Western blot，检测p16、p21、p27和内参照b-actin的蛋白表达水平并进行比较。
5.统计学处理 所有数据资料均经SSPS10.0统计软件进行处理。P
结果
1.ART对癌细胞增殖的影响 MTT分析显示，青蒿琥酯能抑制SW620细胞增殖，且呈剂量依赖性（***1）。
***1 ART（μmol/L）对人结肠癌细胞SW620的增殖抑制作用
2.ART对W620细胞周期的影响 ART能引起SW620细胞周期发生G1-S期阻滞。ART作用48h后，各个ART浓度作用组G1期细胞均明显多于空白对照组，而S期、M期细胞则相应减少，差异存在显著性意义（P
3.ART对CKIs（p16、p21、p27）蛋白水平的影响ART能上调SW620细胞中p21、p27蛋白的表达；与空白对照组相比，各个ART剂量组p21、p27的积分光度值均有较明显的上升，差异均具有统计学意义（P
讨论
本研究采用不同浓度的ART处理结肠癌细胞，于不同时间收集细胞，探讨了细胞增殖、细胞周期以及CKIs 重要成员P16、p21、p27表达。
我们将ART作用于人结肠癌细胞系SW620，MTT结果表明ART可明显抑制SW620细胞生长；并且这种增殖抑制作用在一定范围内呈剂量依赖性效应。证实ART对结肠癌细胞生长有负调控作用。
细胞周期失控与肿瘤细胞分化有关。细胞分化的主要标志是合成特异性的功能蛋白，出现细胞类型的功能性改变，同时进行细胞表型的形态结构变化，这些标志性变化均在G1期及细胞分化期完成。肿瘤细胞去分化的一个重要特征就是G1―S期卡点失常，进入S期的细胞异常增多[6，7]。因此，G1期阻滞可看作细胞分化的一个判断指标。流式细胞仪检测结果发现，在ART抑制SW620细胞增殖的同时也可使其细胞周期的分布发生明显变化。ART作用48h后，停滞于G0/G1期的细胞比例明显上升，而进入S期的细胞明显减少，且这种阻滞效应表现为一定程度上的剂量依赖性关系。本研究提示，ART对结肠癌细胞SW620的增殖抑制作用可能是由于ART改变了细胞周期的分布，使多数肿瘤细胞停滞于细胞分化期即G1期，阻止细胞向S期转化，从而减少了DNA合成和有丝***并促进其分化。
在此过程当中，CKIs在肿瘤分化中的的作用已引起人们的注意。P16、p21、p27是CKIs家族重要成员。其中p16属于INK家族，能特异性地抑制cylclin D/CDK2和cylclin D/CDK4复合物。而p21、p27都属于Cip/Kip家族，能广泛抑制cylclin D/CDK复合物的活性。它们可减弱cylclin D/CDK复合物对Rb蛋白的磷酸化作用，使细胞发生G1―S期阻滞，从而对细胞周期发挥负调控作用[8,9,10]。在多种肿瘤细胞系和实体瘤中都不同程度地存在CKIs表达失活的情况[4]。Western blot显示，人结肠癌细胞系SW620中三种CKIs蛋白p16、p21、p27都有表达。但p21和p27蛋白水平很高，而p16蛋白水平很低。进一步发现，ART对p21和p27表达的诱导作用非常明显，分别可使其蛋白水平上升5.25、4.65倍以上，且这种诱导作用呈剂量依赖性效应。但ART作用细胞之后，p16蛋白水平无明显变化，提示p16在介导ART对SW620细胞作用时意义不大。
总之，本研究提示，ART可抑制癌细胞的恶性增殖，其机制可能与上调p21、p27的表达有关。
参考文献
1肖柳英,林培英,张丹,等， 青蒿琥酯对小鼠肝癌及S180实体瘤的抑制作用，实用癌症杂志,2001,16(3): 245
2王勤,吴理茂,李爱媛,等.青蒿琥酯抗肝癌作用的实验研究.中国中药杂志,2001, 26(10): 707
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10 Cordon-Cardo C. Mutations of cell cycle regulators. Biological and clinical implications for human neoplasia.Am J Pathol. 1995 147(3):545