学文网摘要：目的 观察软脉灵口服液对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内血管新生的影响，探讨其稳定斑块的机制。方法 30只6～8周龄ApoE基因敲除小鼠，饲以高脂饲料12周后，随机分为模型组、软脉灵组、辛伐他汀组，另以6只正常C57BL/6J小鼠作为对照组。分别给药12周后，小鼠眼眶静脉采血测定胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），HE染色观察小鼠主动脉病理形态学变化，免***组化法测定以CD105标记的斑块内微血管密度（MVD）及小鼠主动脉CD105表达。结果 与模型组比较，软脉灵组、辛伐他汀组TC、LDL-C、TG显著降低，而HDL-C显著升高（P
关键词：动脉粥样硬化斑块；软脉灵口服液；ApoE基因敲除小鼠；血管新生
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.09.013
中***分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）09-0037-03
Effect of Ruanmailing Oral Liquid on Angiogenesis in Atherosclerotic Plaque of Apoliporotein E Gene knock-out Mice WU Tian-min， CHEN Jin-shui， ZENG Xi-yang （The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China）
Abstract：Objective To observe the effect of Ruanmailing Oral Liquid on angiogenesis in atherosclerosis plaque of Apolipoprotein E （ApoE） gene knock-out mice， and explore the mechanisms of plaque stabilizing. Methods Totally 30 mice 6-8 weeks old ApoE knockout mice were fed a high fat diet for 12 weeks until the formation of a mature atherosclerotic plaque. They were randomly divided into three groups- model group， Ruanmailing group， simvastatin group， with another 6 normal C57BL/6J mice as the control group， and were ***istered for 12 weeks. Blood was extracted from orbital venous to measure the lipid （TC， TG， LDL-C， HDL-C） variation. HE-stain was used to observe aortic pathomorphological changes， meanwhile， immunohistochemical method was adopted to determine the microvessel density of plagues which is marked by CD105， as well as the expression of CD105 in aorta. Results Compared with the model group， TC， LDL-C， TG of Ruanmailing group and simvastatin group decreased significantly， while HDL-C increased significantly （P
Key words：atherosclerotic plaque；Ruanmailing Oral Liquid；Apolipoprotein E gene knock-out mice；angiogenesis
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是危害人类健康的常见疾病，有较高的致残率和致死率。但AS本身并不足以致命，而是随着AS的发展，斑块破裂及继发血栓形成，导致急性冠脉综合征。有研究发现，在发生斑块破裂、管壁出血或不稳定心绞痛的患者，斑块内新生血管的检出率较高[1]。Tanaka等[2]发现CD105在新生血管内皮细胞上强表达，在AS病理过程中的作用越来越受到重视。抑制粥样斑块内的血管新生正成为抗AS
基金项目：福建省卫生厅中医药科技项目（WZY0919）
***的一个新方向。
临床研究表明，软脉灵口服液对冠心病心绞痛有较显著的疗效，并能有效改善生化指标，具有抗AS、***高脂血症等作用[3-4]。本实验拟建立实验动物模型，用免***组化法测定斑块内新生血管的标志物CD105的表达及微血管密度，探讨其改善AS疾病进程及稳定斑块的可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物
实验动物由北京大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2006-0008。30只6～8周龄ApoE基因敲除小鼠，雄性，体质量18～20 g，品系C57BL/6J，购自美国jackson实验室；6只相同遗传背景C57BL/6J小鼠，雄性，体质量18～20 g。
1.2 药物、试剂与饲料
软脉灵口服液，批号110802，福建新大陆药物有限公司提供，辛伐他汀，批号313530，北京万生药业有限公司生产。兔抗小鼠CD105多克隆抗体购自epitomics公司；SP二步法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购自福州迈新生物科技有限公司。高脂饲料配制以胆固醇2.0%、猪胆盐2.5%、猪油10.0%加入小鼠标准饲料中，饲料经充分混匀后由福建福州吴氏动物实验中心加工成颗粒。
1.3 造模、分组与给药
ApoE基因敲除小鼠，5只1笼饲养于本院动物实验室内。经普通饲料适应性喂养7 d后给予高脂饲料，连续喂养12周，在恒温（22±2）℃、恒湿（55%±5%）、人工光照明暗各12 h的饲养室内，自来水随机取食。小鼠随机分为模型组、软脉灵组、辛伐他汀组，每组10只，同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J雄性小鼠6只，作为对照组。
小鼠用药剂量体表面积换算方法：X mg/kg×70 kg×0.0026）/0.02 kg=9.1X mg/kg（其中X代表成人每千克体质量用药量，单位mg/kg。0.002 6为小鼠与人的体表面积比）。
模型组：喂饲高脂饲料，同时给予蒸馏水0.2 mL/d灌胃；软脉灵组：给予软脉灵口服液，每日20 g/kg溶于蒸馏水0.2 mL灌胃；辛伐他汀组：给予辛伐他汀，每日5 mg/kg溶于蒸馏水0.2 mL灌胃（每日0.1 mg/只）；对照组：给予小鼠标准饲料，同时给予蒸馏水0.2 mL/d灌胃。
1.4 标本获取与处理
药物干预12周末，禁食12 h，于小鼠眼眶静脉采血，经2500 r/min，离心10 min后，取上清液，保存在-20 ℃冰箱中，用于检测小鼠血脂水平。小鼠眼眶静脉采血后即剖腹开胸，从主动脉根部开始将小鼠主动脉剥离取出，标本经10%多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片，用于HE染色光镜下观察主动脉病理变化及免***组化检查。
1.5 CD105标记微血管密度及其蛋白表达测定
1.5.1 微血管密度结果判定方法 参照Weidner等[5]报道的方法计数微血管密度（MVD）。凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数。先用低倍镜选取5个血管密度高的区域，判断CD105阳性细胞（染成棕色的内皮细胞），以确定血管密度最高的区域，再用高倍镜下（×200）观察，镜下孤立的内皮细胞或细胞丛作为1个血管计数，记录5个视野内的微血管数，取其均数为MVD值。微血管的计数标准：①单个阳性染色的血管内皮细胞：②1个阳性染色的血管内皮细胞簇；③血管干上的分枝结构。
1.5.2 CD105蛋白表达 各组5个标本各1张切片，在200倍视野下随机选择背景和阳性组织区域合5处，表达结果利用免***组化定量分析软件IPP6.0分析，用积分光密度值（IOD）表示其表达强度，OD值越大表达越强。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，多组间比较采用方差分析。P
2 结果
2.1 小鼠一般情况
在造模、药物干预期间各组小鼠均无死亡；对照组小鼠实验期间正常饮食、饮水（小鼠约每日1 0 g/只标准饲料）；模型组小鼠、软脉灵组、辛伐他汀组在药物干预期间，饮食量减少（小鼠约每日6 g/只高脂饲料），正常饮水。
2.2 软脉灵口服液对小鼠血脂的影响（见表1）
表1 各组小鼠血脂水平比较（―x±s，mmmol/L）
组别 只数 TC TG LDL-C HDL-C
对照组 6 2.72±0.56 0.47±0.14 0.68±0.08 5.24±0.73
模型组 10 26.82±2.39** 1.91±0.23** 19.95±2.52** 1.67±0.20*
软脉灵组 10 21.34±2.61**## 1.17±0.25**## 14.28±4.39**## 4.56±0.69**##
辛伐他汀组 10 22.11±3.34**## 1.24±0.21**# 12.93±2.59**## 5.05±0.41##
注：与对照组比较，*P
2.3 小鼠主动脉病理形态学改变
对照组：主动脉管壁内膜平整，未向管腔突出，中膜平滑肌排列整齐，未见脂肪细胞沉积，无斑块形成。模型组：主动脉管壁明显增厚，内膜增生管腔突出，见明显斑块形成，斑块“纤维帽”结构，斑块中见大量空泡形成，靠近中膜可见大量增生细胞及呈针孔样胆固醇结晶，中膜管壁变薄。软脉灵组：与模型组比较，斑块面积明显减小，内膜相对平整，未见明显“纤维帽”结构，斑块中可见少量空泡及增生细胞形成，中膜下有少量细胞增生，中膜平滑肌排列规则。辛伐他汀组：与模型组比较，斑块面积明显减小，内膜不平整，内膜处斑块向管腔突出，斑块内可见少量泡沫细胞和增生细胞形成，斑块外未见明显“纤维帽”结构，中膜平滑肌排列相对规则。
2.4 软脉灵口服液对小鼠微血管密度的影响（见表2）
表2 各组小鼠主动脉MVD比较（―x±s，个）
组别 只数 MVD
对照组 6 1.83±0.41
模型组 10 21.30±5.72#
软脉灵组 10 13.70±3.37#*
辛伐他汀组 10 11.40±1.71#*
2.5 软脉灵口服液对小鼠CD105蛋白表达的影响
对照组胞浆中见少量散在棕黄色颗粒沉淀；模型组胞浆中见大量片状棕黄色颗粒沉淀；软脉灵组棕黄色颗粒沉淀比对照组多，与模型组比较相对减少；辛伐他汀组棕黄色颗粒沉淀比对照组多，与模型组比较相对减少。结果见表3。
表3 各组小鼠CD105蛋白表达水平比较（―x±s）
组别 只数 OD值
对照组 6 2 721.55± 508.01
模型组 10 30 564.63±5337.13**
软脉灵组 10 7 422.52± 884.41*##
辛伐他汀组 10 8 969.58± 656.84*##
3 讨论
AS是一个逐渐发生、发展的病理过程，通常在症状出现前经历了一个无症状的寂静期。临件的发生是随着AS的发展，斑块破裂及继发血栓形成，因此稳定AS斑块是一个核心。在AS的进展过程中，血管新生是一个重要的伴随现象，新生血管的密度和斑块稳定性密切相关，易损斑块的新生血管密度明显高于稳定斑块[6-7]。研究显示，CD105与动脉粥样硬化斑块内新生血管形成及斑块稳定性密切相关[8]，故本实验选择CD105作为斑块内新生血管的标记物。采用较为公认的比较理想的ApoE基因敲除小鼠为动物模型。此模型可使血脂升高，迅速形成广泛而典型的AS斑块，且多为不稳定斑块[9]。
众所周知，他汀类药具有降脂作用外的多种效应，短期***可使斑块内新生血管减少，从而抑制斑块的发展。但因其具有肝肾功能受损、肌溶性等不良反应，且停药后血脂回升快，使其使用受到一定限制。故积极探索、寻求更多有效的干预血管生成药物和方法无疑具有重要的意义。
中医学认为，AS是本虚标实之证，本虚根本在于肾虚，而肝肾同源，故不可忽视补益肝肾等药物的应用。软脉灵口服液具有滋补肝肾、益气活血功效，主要成分为熟地黄、枸杞子、牛膝、茯苓、制何首乌、白芍、炙黄芪、陈皮、***羊藿、当归、川芎、丹参、人参等。用于肝肾亏虚、气虚血瘀证。
本实验研究结果显示：软脉灵组小鼠TG、LDL-C、TC水平显著低于模型组（P
综上所述，软脉灵口服液具有抗血管生成的作用，可能通过其降低斑块内CD105蛋白的表达抑制动脉粥样硬化斑块内血管新生，从而达到稳定斑块的作用。
参考文献：
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（收稿日期：2013-03-01，编辑：华强）
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