学文网作者：许静 吴立华 徐洁 刘俊霞 孟磊 何一心 宋增璇
【摘要】 目的：从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体（scFv），克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的KG1a细胞吸附法富集文库3轮，再用CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择，分离单克隆后用间接免***荧光法鉴别其细胞结合特异性。对具有不同细胞结合特异性的克隆进行DNA序列分析，用一级结构不同的单链抗体作免***印迹鉴别抗原分子量。结果：间接免***荧光结果显示，64个阳性克隆分别识别不同的细胞系，分属3种细胞结合谱，DNA序列测定结果证明C95、H1两个克隆具有独特的一级结构，利用Western blot成功测定它们特异性识别KG1a细胞膜蛋白的表观分子量分别为34 kD/22 kD。结论：成功建立了分离和鉴定抗细胞表面分子phage?scFv单克隆的方法，并从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离出2个抗造血干/祖细胞的特异性克隆。
【关键词】 噬菌体展示 引导选择 表面分子 单链抗体
Isolation and identification of specific single chain antibodies against cell surface molecules
［Abstract］Objective:Isolation and identification of single chain antibodies against surface molecules of hematopoietic progenitor cells via phage display antibody library.Methods:An individual KG1a+ phage?scFv library for the binding specificity to eight hematopoietic progenitor cell lines by indirect immunoflurorescein were identified. Then,the monoclonality of the scFvs was proved by testing specific binding to antigen proteins by Western blot.Results:64 KG1a+ phage?scFvs were identified. They showed three kinds of cell binding repertoire. The unique primary structures of two phage?scFv clones were proved by DNA sequence. Their recombinant scFv?SA fusion proteins bound to the single band of proteins from KG1a cells with molecular weights of 34 kD and 22 kD,respectively.Conclusion:Reliable methods to identify phage?scFv clones against cell surface molecules have been established and obtained two unique phage-scFv clones against hematopoietic progenitor cell surface molecules from an anti?KG1a cell phage?scFv library.
［Key words］Phage display;Pathfinder selection;Surface molecule;ScFv
免***球蛋白的可变区是抗体识别和结合抗原的功能区，其分子量只有全抗体的1/5左右，由于分子量小、组织穿透力强，因此由抗体可变区构成的单链抗体（Single chain antibody fragments, scFv）具有体内良好的应用前景，也是构建成各种双功能抗体的基本单位[1]。近年快速发展的噬菌体表面展示抗体技术日益成为制备单克隆抗体的有效手段，如何从包含众多非特异性和未知特异性的文库中分离特异性单克隆phage?scFv，涉及到筛选策略选择和多项技术的应用。本研究的目的在于寻找新的有功能的抗造血干/祖细胞表面分子的抗体，并通过所获得的抗体分离抗原分子及其基因，我们探索了从自建的噬菌体抗体库中分离和鉴定特异性单克隆phage?scFv的方法，对分离的特异性单克隆scFv进行表达鉴定，这对于进一步研究抗造血/干祖细胞表面分子和发现新的细胞表面分子具有一定的意义[2]。
1 材料与方法
1.1 材料
抗KG1a细胞噬菌体展示文库由本室构建[3]；NHS?生物素和链霉亲和素磁珠购自Pierce公司；抗M13单抗购自pharmacia公司；抗CD44单抗和兔抗小鼠IgG?FITC购自协和干细胞公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠F(ab)2{HRP?F(ab)2}购自Protos Immunoresearch公司；表达载体pSTE2、辅助噬菌体M13KO7和E.coli XL1?Blue由德国海德堡大学Dubel博士惠赠；HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg?01等细胞系由本室保存备用；限制性内切酶、连接酶等购自Invitrogen公司。
1.2 phage?scFv文库的富集和引导选择
参见文献[4]，经KG1a细胞富集3轮的抗KG1a细胞噬菌体文库，用抗CD44单克隆抗体作引导选择，分离单克隆phage?scFv，再分别与KG1a细胞反应。
1.3 抗KG1a细胞阳性phage?scFv的鉴定
用间接免***荧光法，1×105 KG1a细胞与单克隆phage?scFv结合于室温1小时后与抗M13单抗结合30分钟,再与荧光标记二抗IgG?FITC结合30分钟,每次与抗体反应均用PBS洗3次。在荧光显微镜下观察，使KG1a细胞表面显示点状荧光者判定为KG1a阳性克隆。
1.4 单克隆scFv的细胞结合特异性分析
用间接免***荧光法，全部KG1a+phage?scFv单克隆分别与HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg?01等细胞系反应，按上述步骤和判别方法鉴定KG1a+phage?scFv克隆与上述细胞结合谱。
1.5 DNA序列测定
从KG1a+phage?scFv单克隆中挑选细胞结合谱不同的单克隆送博雅公司作DNA序列测定。
1.6 单克隆scFv与链霉亲和素（Core?streptavidin, SA）融合蛋白的制备
从单克隆phage?scFv质粒DNA中分离scFv基因片段，插入表达载体pSTE2的NcoI/NotI切点，转化E.coli XL1?blue,挑选经鉴定插入正确的单克隆用IPTG诱导表达scFv?SA，按文献[5]纯化scFv?SA融合蛋白，用于免***印迹分析。
1.7 免***印迹分析
取对数生长期KG1a细胞，提取细胞膜蛋白（以每107细胞加裂解液缓冲液：含0.5% TritonX?100的PBS溶液，裂解细胞5分钟,12 000 r/min离心15分钟,取上清），行12%SDS?PAGE,上样量为5×106细胞/孔，电泳结束后，电转移到PVDF膜上,用10%脱脂奶PBS?T(含0.05%Tween20的PBS)封闭2小时, PBS?T洗3次，分别用单克隆scFv?SA纯化蛋白与膜孵育2小时，PBS?T洗6次后，用DAB显色，分析其所识别抗原的分子量。
2 结果
2.1 KG1a+ phage?scFv的分离效率
用KG1a细胞作3轮富集和用抗CD44单抗作引导选择后，随机挑取144个phage?scFv的单菌落，表达单克隆phage?scFv，间接免***荧光反应结果显示64个单克隆phage?scFv与KG1a细胞呈阳性反应，阳性率为44.4%，在荧光显微镜下阳性反应细胞表面有明确的点状荧光（***1），阴性反应细胞无荧光。
2.2 KG1a+ phage?scFv单克隆对其他细胞系的识别
64个阳性单克隆分别与8个造血祖细胞阶段细胞系做间接免***荧光反应，其中41个单克隆与8个细胞系均呈阳性反应，15个单克隆识别7个细胞系而不识别BJAB细胞系，8个单克隆与8个细胞系均呈阴性反应（表1）。结果显示有3种类型scFv，它们的细胞结合谱为9（+）、8（+）1（-）和1（+）8（-）。表1 phage?scFv的细胞结合谱（略）
2.3 phage?scFv单克隆的DNA序列分析
从与细胞结合谱不同的phage?scFv中分别挑取2个克隆作DNA序列测定。测序结果按Kabat编号标明scFv核苷酸排列顺序及其演绎的氨基酸残基排列顺序，比较各个scFv的互补决定区（CDR）[6]。结果3个克隆的DNA序列与以前报导的C4、C131和C193相同；1个克隆的互补决定区与以前报导的C194相差2个氨基酸残基；2个克隆C95、H1的DNA序列完全不同于以前报导（表2，3）[4]。表2 scFv克隆的重链互补决定区氨基酸残基序列（略）表3 scFv克隆的轻链互补决定区氨基酸残基序列（略）
2.4 免***印迹结果分析
免***印迹结果显示scFv?SA?C95 和scFv?SA?H1融合蛋白能识别和结合KG1a细胞膜蛋白中的抗原带，它们的表观分子量分别约为34、22 kD（***2）。
3 讨论
细胞表面分子是鉴别细胞种类及其发育阶段的标志，也有一些是调控细胞行为的信号途径端口。近年来，在细胞表面分子的发现及其信号途径和调控分子应用方面都有长足的进展，尤其在干细胞领域，细胞表面分子已逐渐成为预测细胞分化潜力的依据。但是由于细胞表面分子的多样性，遗传和突变造成的疾病相关分子的瞬时表达等原因，使细胞表面分子领域的研究存在很大的探索空间。人们期待新的细胞表面分子标志来鉴别各种不同发育阶段的干/祖细胞用于移植，也期待新的调控细胞行为的生物分子或药物用于临床***。
发现细胞表面分子的经典方法依赖抗体，30年来用杂交瘤技术制备的单克隆抗体在细胞表面分子的研究中发挥了巨大作用，至今仍在使用。但是一些表达水平很低的细胞表面分子，在细胞表面的浓度很低，很难用杂交瘤技术获得其相应的单克隆抗体，但它引发的抗体基因存在于免***的脾细胞中，可以用基因重组和噬菌体表面展示技术获得其单克隆单链抗体。我们已采用这项技术成功构建了抗KG1a细胞单链抗体库[3]。KG1a细胞分化程度很低，具有造血干细胞特征，其表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子及细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子，本研究用KG1a细胞吸附富集抗KG1a细胞表面分子噬菌体库后再用CD44单抗作引导选择，使KG1a+phage?scFv达到44.4%，与我们以前报道的结果近似，说明这种分离方法高效且稳定[4]。本文分出的6个特异性phage?scFv单克隆中有3个克隆的DNA序列与以前报道的完全相同，1个克隆仅在CDR中有2个氨基酸残基不同，2个克隆的DNA序列完全不同于以前报道，结果提示CD44和CD34分子在KG1a细胞表面的定位距离不远。DNA序列测定，结果显示C95和H1两个克隆的CDR都很独特，推测它们可能识别不同的抗原，免***印迹结果证实了我们的推断。
从phage?scFv文库中筛选特异性scFv单克隆是制备单克隆抗体的新途径，从中可以筛选出许多具有不同特异性phage?scFv单克隆，用此方法获得的单克隆scFv一级结构明确，利于基因重组制备双功能抗体用于临床***[7,8]。我们已筛选鉴定7个单克隆scFv，其中6个克隆通过基因重组技术构建成具有碱性磷酸酶（scFv?AP）或链霉亲和素（scFv?SA）标记的双特异性抗体[9]，这为分离和鉴别新的细胞表面分子，深入研究它们的生物学特性和功能奠定了坚实的基础。
【参考文献】
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3 隋建华,宋增璇,佘 鸣 et al. KG1a细胞免***小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达\[J\].中国免***学杂志,2000；16（6）：318?321.
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9 许 静,刘俊霞,李 侠 et al. 单链抗体?碱性磷酸酶融合蛋白的制备\[J\].中国免***学杂志,2003；19（10）：86?88.
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