学文网摘要：目的 研究与分析腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化表现状态及其在宫颈癌中发生及发展的作用及意义。方法 选取本院所收治的120例宫颈鳞癌患者及30例正常宫颈上皮组织进行研究，并采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测其组织中腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化状态，分析并比较。结果 经检测发现，30例正常宫颈上皮组织中未检测到腺瘤性结肠息肉病基因甲基化片段，而宫颈癌组织中，其腺瘤性结肠息肉病基因甲基化阳性率为65.0%（78/120）；两组阳性率比较（P
关键词：腺瘤性结肠息肉病；宫颈癌；基因；甲基化
腺瘤性结肠息肉病（Adenomatous polyposis coli；APC）基因是人体中一种重要抑癌基因[1]。经相关研究发现[2]，腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化变化与多种恶性肿瘤存在紧密联系。然其甲基化变化与宫颈癌间的相关性研究报道较少[3]。本次研究采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测宫颈癌及正常宫颈组织中腺瘤性结肠息肉病基因启动子区甲基化状态情况，以探讨与分析腺瘤性结肠息肉病基因与宫颈癌发生及发展的相关性，为临床诊断及预防宫颈癌提供重要参考依据，报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 选取贵阳市妇幼保健院妇科2011年6月～2014年10月所收治的120例宫颈鳞癌患者及30例正常宫颈上皮组织进行研究，本次研究标本均为手术切除或门诊活检所得新鲜标本。且所有组织均经病理学检查证实，研究方案经医院伦理委员会批准，患者自愿参与研究且签署知情同意书。术前未采用任何方式对患者进行***，患者术后资料完整，精神正常，可配合进行研究。宫颈癌组织中，年龄27～68岁，平均为（46.5±1.0）岁；临床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；组织学分级：G1～G2为78例、G3为42例；病理类型均为宫颈鳞状上皮细胞癌，淋巴结转移者为26例、无淋巴结转移者为94例。正常宫颈上皮组织中，年龄22～65岁，平均为（44.0±1.0）岁。
1.2方法 本次研究的新鲜组织在离体后立即放入液氮速冻，并转入到-70℃冰箱中保存备用。试剂：酚、Proteinase K（Merck）、Taq DNA聚合酶、氯仿（Sigma）、dNTP、W izard DNA纯化试剂盒（Genmed）、引物合成（上海生工）[4]。基因序列：APC甲基化：5-'TATTGCGGAGTGCGGGTC-3'、5-'TCGACGAACTCCCGACGA-3'；长度为98bp。APC非甲基化：5-'GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT-3'、5-'CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3'；长度为108bp。DNA提取：选取新鲜组织100mg于液氮中碾碎，并采用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿法进行抽取，同时采用乙醇沉淀法提取组织中DNA，最后采用TE缓冲液进行稀释、溶解，再采用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，并放置于-20℃冰箱中保存以备用[5]。DNA的亚硫酸氢盐修饰：取2ugDNA放置于EP管中，然后加入双蒸水进行稀释到50ul，并加入5.5ul新鲜配制的3.0mmol/L氢氧化钠溶液，并摇匀，放置于37℃水浴中恒温12min，再加入10mmol/L对苯二酚30ul、3.6mol/L亚硫酸钠520ul，避光并混匀，待混匀后通过纯化柱。使用W izard DNA纯化回收系统提纯DNA，加5.5ul新鲜配制的3mmol/L氢氧化钠溶液，于37℃水浴中恒温12min，再加入5mmol/L醋酸铵41ul，再使用无水乙醇沉淀DNA，并加入20ul双蒸水进行溶解，并放置于-20℃冰箱中保存以备用。MSP反应：PCR反应体系（25ul）：10×PCR buffer 25.0ul 2.5mmol/LdNTP混合物4.0ulMgCL2、4.0ulTaq酶0.2ul。引物分别为1ul，模板DNA2ul；去离子水补齐到25ul。反应条件：95℃环境下预变性9min，95℃变性30s，退火[APC（M）：55℃、APC（U）：62℃]1min，72℃延伸30s，循环37次。72℃延伸5min，产物4℃保存。取10ul PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并采用凝胶成像分析仪来采集***像。
1.3结果判断 甲基化引物扩增出现条带，则判定为甲基化阳性；非甲基化引物扩增出现条带，而甲基化未扩增出条带，则判定为甲基化阴性。甲基化与非甲基化引物均扩增出现条带，则判定为部分甲基化。
1.4统计学方法 数据采用SPSS20.0软件统计与分析，计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验。结果以P
2 结果
2.1甲基化情况 经检测发现，30例正常宫颈上皮组织中未检测到腺瘤性结肠息肉病基因甲基化片段，而宫颈癌组织中，其腺瘤性结肠息肉病基因甲基化阳性率为65.0%（78/120）；2组阳性率比较（χ2=20.41，P
***1 不同宫颈组织中APC基因甲基化情况；A：正常宫颈上皮组织；B、C：宫颈鳞状上皮细胞癌
2.2 APC基因甲基化与宫颈癌临床病理因素间关系 临床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；宫颈癌组织中，其临床分期间腺瘤性结肠息肉病基因甲基化阳性率分别为74.1%（40/54）、45.8%（22/48）、88.9%（16/18）比较（P0.05）；淋巴结转移与非淋巴结转移阳性率分别为53.9%（14/26）、45.7%（43/94），两者比较（χ2=1.57，P>0.05）。见表1。
3 讨论
临床上，大部分宫颈癌为鳞状细胞癌，同时其也是妇科女性人群中常见癌症死亡原因。经相关分子生物学研究发现，大约90%左右的宫颈癌患者伴有HPV感染，但大多数HPV感染患者并不会发展为宫颈癌，因此HPV感染为单一因素，其不足以导致人类宫颈正常细胞发生癌变。DNA甲基化是最早所发现的基因转录前调控途径之一。然在真核生物基因组中，大约有80%CpG位点被甲基化，且这些甲基化主要发生于基因启动子区域的CpG岛。经相关研究表明，DNA甲基化可导致染色质结构和DNA构象及DNA稳定性、DNA与蛋白质相互作用方式发生变化，自身或结合甲基结合蛋白后，其将阻遏转录因子与启动子的结合，最终可有效调控基因表达，同时其也是表观遗传学修饰最重要的基因转录前调控方式。抑癌基因的启动子甲基化与某些肿瘤的临床分期与病理类型存在紧密联系，同时其也成为肿瘤分子诊断及预后判断的重要生物标志物。基因启动子甲基化作为基因水平的标志物，其具有极高特异性和灵敏度。近年来，经研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞甲基化水平发生极大变化，且在肿瘤发生与发展过程中，时常出现整个基因组DNA的低甲基化和CpG岛局部高甲基化。DNA的低甲基化往往因肿瘤细胞中DNA甲基化酶活性增高或CpG岛的局部保护机制受到破坏而引起，最终导致染色体不稳定及原癌基因过度表达。而CpG岛局部高甲基化常常会导致细胞凋亡基因和细胞周期调控基因及血管生成基因等癌相关基因的沉默，最终导致发生癌症。
Wnt信号通路异常与多种肿瘤发生存在紧密联系，其参与多种肿瘤发生的机制和信号传导等。然APC是Wnt通路的构成蛋白之一，同时APC也是B-链蛋白（B-catenin）的负性调节因子，其可引发B-catenin在细胞中堆积，进而启动一些新基因的表达，促使细胞生长发育和调控及凋亡等发生紊乱，最终导致癌变发生。经本次研究发现，经检测发现，30例正常宫颈上皮组织中未检测到腺瘤性结肠息肉病基因甲基化片段，而宫颈癌组织中，其腺瘤性结肠息肉病基因甲基化阳性率为65.0%（78/120）；两组阳性率比较（P
综上所述，APC基因启动子区高甲基化是肿瘤发生过程中早期事件，因此临床筛查APC基因甲基化状态对宫颈癌早期诊断具有重要意义，进而可有效判断患者预后。
参考文献：
[1]袁卫平，吴飞翔，黄山，等.肝细胞癌中APC基因启动子甲基化及蛋白表达的研究[J].现代肿瘤医学，2010，18（9）：1795-1797.
[2]纪莎，玛依努尔・尼牙孜.DNA甲基化与宫颈癌研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2014，22（3）：12-14+11.
[3]郭炜，董稚明，郭艳丽，等.贲门腺癌中转化生长因子βII型受体基因启动子区高甲基化及其与TGF-β1表达的相关性分析[J].肿瘤，2010，30（10）：875-880.
[4]孙勇，李运辉，张鹏.BRCA1基因启动子区甲基化状态抑癌作用研究[J].海南医学，2014，25（12）：1717-1719.
[5]李文兵，余宗涛，何月，等.宫颈癌患者CHFR基因异常甲基化的检测[J].湖北医药学院学报，2014，33（3）：253-255.编辑/哈涛
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