学文网摘要：采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾鯝病毒（Channel catfish virus， CCV），利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白，包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供了参考。
关键词：斑点叉尾鯝病毒（Channel catfish virus，CCV）；结构蛋白；蔗糖密度梯度离心；质谱
中***分类号：S941.41+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）21-4841-05
Identification of Structural Proteins of Channel Catfish Virus （CCV）
BI Peng，WU Zhi-xin，SU Nian，LI Li-juan
（College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： Channel catfish virus （CCV） in channel catfish ovary cells were purified through sucrose density gradient centrifugation， and then analyzed using the ESI-Q-TOF mass spectrometry technique. Totally， 13 structural proteins were identified， including a novel structural protein ORF22. This study provided a good reference to further study the function of structural proteins and proteomics of the CCV.
Key words： channel catfish virus（CCV）； structural proteins； sucrose density gradient centrifugation； mass spectrometry
随着我国斑点叉尾鯝养殖业的不断发展，其病害也日趋严重，已成为制约鯝鱼养殖业发展的主要因素[1]。斑点叉尾鯝病毒病（Channel catfish virus disease， CCVD）具有传染快、死亡率高等特点，其病原为斑点叉尾鯝病毒（Channel catfish virus， CCV），主要感染鱼苗和鱼种。该病的病程比较短，一般为3～7 d，当饲养水温在25～30 ℃时疾病呈流行高峰，死亡率可达到90%以上[2]。CCV的传播方式主要有两种，即通过与***水和患病鱼体接触进行水平传播以及经受精卵垂直传播[3]。1968年Fijan首次对CCV进行分离，随后Wolf和Darlington[4]根据其形态学特征鉴定为疱疹病毒。尽管CCV在结构上和人类单纯疱疹病毒1型（HSV-1）相似，但是两者核苷酸和氨基酸序列差异较大，亲缘关系较远[5]。2009年，国际病毒分类委员会（ICTV）将CCV从α-疱疹病毒亚科中分离出来，并且将其分类地位划分为鱼类疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鯝鱼疱疹病毒属（Ictalurid herpesvirus）[6]。CCV是一种双链DNA病毒，病毒粒子大小约为175～200 nm，由囊膜、间层和核衣壳组成。核衣壳呈二十面体结构，由162个直径约为100 nm的壳粒组成[7]。CCV的基因组大小约为134 kb，整个基因组预测由76个开放阅读框（Open reading frame，ORF）组成。
蛋白质是生理功能的执行者，是生命活动的体现者，对蛋白质的结构和功能的研究将直接阐明机体在生理或病理条件下的变化机制[8]。目前，国内已有较多关于CCV研究的相关报道，以CCVD的防治对策研究为主。同时，也有部分CCV检测方法的研究，如李惠芳等[9]建立了TaqMan实时荧光PCR检测方法，杜玉东等[10]对CCV核酸探针检测方法进行了研究。除此之外，相关CCV多克隆抗体的制备[11]以及CCV“自杀性”DNA***苗的构建[12]等研究也得到开展。尽管如此，国内对CCV结构蛋白的相关研究相当匮乏。Davison等[5]早在1995年就对纯化的CCV病毒粒子进行了SDS-PAGE分析，并利用基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱法鉴定了11种结构蛋白。随后，Kunec等[13]利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对CCV病毒粒子进行了分析，鉴定了37种结构蛋白。其中，囊膜蛋白有ORF10、ORF46和ORF59；核衣壳蛋白有ORF27、ORF28、ORF39和ORF53等；间层蛋白有ORF11、ORF12和ORF65等。也有很多学者对其他疱疹病毒进行了相关研究，如Varnum等[14]通过对巨细胞疱疹病毒（HCMV）粒子的研究鉴定了5种核衣壳蛋白、14种间层蛋白和19种糖蛋白；而Stefania等[15]则鉴定并定位了HSV-1的糖蛋白B促融合基因位点，为病毒入侵机理的研究提供了参考，也为基因***苗的开发制备奠定了基础。虽然CCV近一半的ORF被报道，但是还有很多ORF未被报道，因此，通过质谱技术不断发现、鉴定新的CCV结构蛋白，不仅从表观上完善了CCV各组分的蛋白质组成，也为下一步确定CCV各组分特别是囊膜蛋白的蛋白质组成以及***苗的开发提供基础，同时也为进一步研究病毒入侵机理以及基因药物的研发提供了重要的理论依据。本研究采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾鯝病毒，利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）对得到的样品进行分析，为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的斑点叉尾鯝卵巢细胞（CCO）和斑点叉尾鯝病毒（CCV）为华中农业大学水产学院细胞保藏中心保存。
1.2 病毒的分离与纯化
以CCO为宿主，用于培养CCV。样品收集后冻存于-80 ℃，室温冻融后于4 ℃ 8 000 r/min离心30 min，取上清并于4 ℃ 28 000 r/min 离心3 h，去上清后将沉淀溶于1～2 mL TNE（0.5 mol/L Tris-HCl， 0.1 mol/L NaCl， 0.01 mol/L EDTA， pH 7.4）缓冲液中，混匀，即为病毒粗提液。将病毒粗提液转移至蔗糖密度梯度离心管，蔗糖浓度梯度分别为20%、30%、40%、50%、60%（m/m），然后于4 ℃ 40 000 r/min进行密度梯度离心2 h，吸取病毒条带，加入适量TNE，混合均匀后再次于4 ℃ 40 000 r/min离心1.5 h，将得到的沉淀溶于40 μL TNE中，即为纯化的病毒液。
1.3 电镜观察
取纯化的病毒液用2%（m/V）的磷钨酸溶液染色5 min，室温自然干燥后在透射电子显微镜（日立H-5760）下观察。
1.4 SDS-PAGE分析
取30 μL纯化病毒液，加6×Buffer 6 μL，沸水变性处理10 min后采用恒流方式进行SDS-PAGE分析，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时停止电泳，取下凝胶后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色，脱色至凝胶背景透明，用凝胶成像系统对凝胶扫描成像。
1.5 质谱分析
将凝胶上的目的条带切下，送往武汉大学蛋白质组学及质谱学共享实验室进行质谱分析。按照Shevchenko等[16]的方法进行胶内酶解。然后利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）进行结构蛋白的鉴定。采用飞行时间模式进行串联质谱分析，一级质谱进行母离子检测，二级质谱进行碎片峰检测，二级质谱的质量容忍度为0.4 Da，最多允许2个酶切位点的遗漏。通过与Swissport数据库比对进行蛋白质鉴定。
2 结果
2.1 CCV的分离与纯化
蔗糖密度梯度离心后可以清晰地看到1条***白色的病毒条带（***1），位于50%和60%蔗糖梯度之间。将纯化病毒液进行负染，电镜下显示病毒粒子呈圆形或椭圆形，病毒粒子的直径为175～200 nm，具囊膜及典型的疱疹病毒特征（***2）。
2.2 CCV的SDS-PAGE分析结果
取适量纯化的病毒液进行SDS-PAGE分析，采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色，可见约17个蛋白条带（***3）。
2.3 CCV的质谱分析结果
在PAGE凝胶中大多数蛋白条带都与被鉴定结构蛋白一一对应，即一个蛋白条带对应一种结构蛋白。少数蛋白并不呈现这种对应关系，其中第八、九、十这三个蛋白条带对应的是ORF66，可能是蛋白质的降解所致；第15和16两个条带中检测到4种结构蛋白，但是由于电泳的分辨率不够，不能形成清晰的蛋白条带并进行质谱鉴定，还有可能是由其他大分子量的蛋白质降解而产生分子量小的ORF，因此质谱能够检测到4种ORF，但是不能进行一一鉴定。对ESI-Q-TOF MS/MS得到的结果进行分析，共鉴定出CCV的13种结构蛋白（表1）。主要包括：2种膜蛋白（1种囊膜蛋白ORF59，为CCV的主要囊膜蛋白，另外1种为糖蛋白ORF46，Kuctktas等[7]通过对CCV基因序列分析显示，ORF46携带26个N-糖基化位点，为CCV的糖蛋白，可能在病毒入侵宿主时起重要作用）、5种间层蛋白（ORF74、ORF73、ORF72、ORF65和ORF15）以及3种核衣壳蛋白（ORF39、ORF53和ORF27，其中，ORF39为主要的核衣壳蛋白），另外还有2种已报道但是未对其功能描述的蛋白，分别是ORF66和ORF79。此外，质谱还发现了1种从未被报道的蛋白ORF22，其结构和功能都尚未被描述。
3 讨论
CCV是一种具囊膜的疱疹病毒，由于囊膜在提取过程中容易脱落，因此在提取时应尽量使用新鲜的病毒培养液，避免反复冻融造成病毒粒子的破损[17]。目前提取病毒的方法很多，主要有沉淀法、离心法和层析法等。文明等[18]分别采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯病毒粒子，发现不连续密度梯度离心法可分离纯化病毒粒子，电镜下可见少量、大小一致的完整病毒粒子；姜有声等[19]使用蔗糖密度梯度离心法纯化得到大量对虾白斑综合征病毒（WSSV）。Tasi等[20]对WSSV病毒粒子进行蔗糖密度梯度离心，负染后电镜观察表明，完整病毒粒子的纯度很高，约为96%，其他的4%为不成熟的病毒粒子形态。因此，本实验采用了蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，得到了大量纯化的完整的CCV病毒粒子，但是电镜***片中显示还有一些无囊膜包被的颗粒，可能是提纯过程中由于囊膜脱落而形成的核衣壳颗粒[19，21]。
Davison等[5]通过MALDI质谱法鉴定了11种结构蛋白，本实验共鉴定了13种结构蛋白，包含1种未被报道的结构蛋白。造成这种差异可能是由于实验中采用了灵敏度更高、范围更广的ESI-Q-TOF MS/MS，还可能和纯化的CCV纯度以及凝胶电泳的条件有关。另外，Davison等[5]的实验结果显示，质谱鉴定的CCV结构蛋白分子量与理论值相差最小约2 kDa，最大约27 kDa，这可能是由于在进行质谱分析前样品中蛋白质修饰作用比较明显所致。本实验中蛋白质分子量与理论值保持了较高的一致性，相差1 kDa左右，真实地反映了CCV的分子特性。Kunec等[13]通过LC-ESI MS/MS质谱法鉴定了37种结构蛋白，本实验采用SDS-PAGE分离病毒蛋白，可能造成一些低丰度和分子量小的蛋白质未被检测到[22]，从而导致被鉴定的蛋白质数目减少，因此只鉴定到13种结构蛋白。另外，Kunec等[13]对CCO和被CCV感染的CCO的蛋白质同时进行质谱鉴定，然后进行差减得出CCV的结构蛋白数目，这样避免了因其他实验操作而使一些蛋白质被遗漏。本实验中使用SDS-PAGE联合质谱的方法和目前研究蛋白质组学较常见的双向电泳串联质谱的研究方法相比，灵敏度相对较低，范围也较小，容易造成小分子ORF的丢失。因此，对CCV主要的结构蛋白进行鉴定，对小分子ORF的鉴定需要更多后续研究。
质谱结果显示凝胶中的第六个蛋白条带有两种结构蛋白，分别是ORF46和ORF73。在对其进行鉴定时，虽然ORF46分子量与在凝胶中上下条带的蛋白分子量比对稍微有些出入，但是在质谱分析时发现ORF46有较高的检索分数以及较多相匹配的肽段，因此将ORF46作为候选蛋白。在第八、九、十这三个蛋白条带中，第八个条带丰度最大，其中ORF66检索分数最高且丰度大，其余的蛋白和鉴定过的蛋白重复或者分值很低，出现3个条带可能是由于在SDS-PAGE电泳过程中蛋白质发生了降解。因此鉴定这3个条带的结构蛋白为ORF66。在第15和第16两个条蛋白条带中检测到4种结构蛋白，分别为ORF7、ORF10、ORF11和ORF19，其中，ORF7、ORF10和ORF19是与囊膜相关的结构蛋白，但是这4种结构蛋白检索分数都很低，而且匹配的肽段不多，仅仅通过SDS-PAGE分析和现有的质谱结果还不能将其一一鉴定出来，很可能是由于大部分的囊膜蛋白被降解从而产生了小分子量的多肽。
CCV基因组预测含有76个ORF，间层蛋白在CCV的生命活动中扮演着极其重要的作用，如传递病毒的基因组、调控某些基因的表达、促进病毒囊膜的形成以及协助病毒入侵等[23]，在CCV的76个ORF中，有近一半为间层蛋白，这可能与间层蛋白在CCV整个生命活动中的重要作用有关。本实验共鉴定了5种间层蛋白，包括ORF15、ORF65、ORF72、ORF73和ORF74。鉴于间层蛋白在CCV生命活动中的重要作用，对各个间层蛋白的研究以及与其他蛋白之间相互作用的研究可能会进一步揭示其功能。另外，通过质谱鉴定发现了一种新的结构蛋白ORF22，分子量约为153 kDa，和理论分子量保持了一致性。Davison等[5]和Kunec等[13]均未检测到这种结构蛋白，可能是由于所采用的质谱精确度和灵敏度不一样引起的。关于ORF22是否是一种新的病毒结构蛋白以及其分子生物学特征和相关功能需要进一步研究。目前CCV基因组的ORF只有部分通过实验被人们所认知，大部分的ORF还未被报道，因此，通过质谱不断发现、鉴定新的结构蛋白，既是对CCV基因组内容上的补充，也是对结构蛋白在CCV生命活动中所起的作用以及蛋白质与蛋白质之间相互作用等蛋白质组学研究内容的丰富。
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收稿日期：2012-05-18
基金项目：国家自然科学基金项目（30700624）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2012ZYTS028）
作者简介：毕 鹏（1986-），男，湖北浠水人，在读硕士研究生，研究方向为水产动物医学，（电话）13554125682（电子信箱）；
通讯作者，李莉娟，（电子信箱）。
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