学文网[摘要] 目的：研究乌贼墨的体外抗菌作用和对小鼠感染模型的体内抗感染作用。方法：琼脂打孔法检测乌贼墨体外抗菌活性,并通过小鼠死亡率观察乌贼墨对小鼠抗感染能力的影响。结果：新鲜乌贼墨与粗提乌贼墨在体外对琼脂打孔法中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎双球菌无抑菌圈产生。但实验组小鼠大肠埃希菌感染后与对照组小鼠比较，其死亡率有明显降低。结论：用琼脂打孔法测新鲜乌贼墨与粗提乌贼墨在体外无抗菌活性，但粗提乌贼墨在体内可以提高小鼠对大肠埃希菌感染的抵抗力。
[关键词] 乌贼墨；免***作用；抗感染
[中***分类号] R285.5 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（a）-031-02
Research on the effect of antibiosis in vitro and anti-infection of the Squid Ink WANG Xin, Li Guo-ming
(1.Department of Clinic Microbiology Laboratory Medicine, the Institute of Laboratory Medicine of Guangdong Medical College, Dongguan523808, China;2.Department of Microbiology and Immunology, the Guangdong Medical College, Zhanjiang524023, China)
[Abstract] Objective: To study the effect of antibiosis in vitro and anti-infection in vivo of the squid ink.Methods:The effect of antibiosis in vitro of the squid ink was detected by agar punch method. The effects of the squid ink on the anti-infection ability of KM mice were measured by the death rate. Results:The strains of Staphylococcus aureus,Escherichia coli， Pneumoniae diplococcus could not be inhibited by the fresh squid ink and abstracted squid ink in vitro by agar punch method. The death rate of KM mouse of EG was lower than CG. Conclusion:The fresh squid ink and abstracted squid ink have no effect of antibiosis in vitro by agar punch method，but the abstracted squid ink can raise the resistibility to E. coli infection of KM mouse.
[Key words] Squid ink; Immunifaction; Anti-infection
乌贼墨汁是由黑色颗粒构成的黏稠的混悬液，主要成分为黑色素和蛋白多糖复合体[1]。早在唐代陈藏器的《本草拾遗》中便记载了乌贼墨有“主血刺心痛”的作用，现作为一种中药，主要作为止血剂***出血性疾病[2]。自从日本学者发现乌贼墨的抗肿瘤活性以来[3]，对其免***调节作用、抗肿瘤作用的研究已成为热点。本实验主要通过体外抗菌实验和动物实验，研究乌贼墨在抗感染方面的作用，挖掘其潜在药用价值，从而为乌贼墨的开发应用提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物及菌种
昆明种小鼠：SPF级，6~8周龄，18~22 g，雌雄各半，广东医学院实验动物中心提供。大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)由广东医学院病原生物学实验室提供。
1.2乌贼墨的粗提
取新鲜乌贼墨汁，冷冻干燥后用研磨器研磨，100目铜筛筛出乌贼墨细粉，冷藏，使用时用无菌生理盐水配制成需要浓度。
1.3体外抗菌活性测定[3]
采用琼脂打孔法进行乌贼墨体外抗菌活性[3]测定。将新鲜乌贼墨汁稀释2倍、4倍，将乌贼墨粗提细粉用无菌生理盐水配制成5%、10%浓度，用比浊法将大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)3种菌悬液浓度稀释为1×108 cfu/ml、1×104 cfu/ml、1×10 cfu/ml备用。将各浓度3种菌悬液各取3个MH琼脂平板预温，吸取0.1 ml注入琼脂平板上，以L型玻棒涂布均匀，用外径6 mm的无菌打孔器在含菌平板上等距离打4个孔，每孔加入待试样品液0.1 ml，一种样品液加3孔，于37℃恒温箱中培养18~24 h后，测量抑菌圈直径，各药的均值参照有关标准确定其抗菌力强弱。
1.4体内抗感染试验
将大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌(ATCC
25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)悬液浓度稀释为1×1010、5×109、1×109、5×108、1×108、5×107 cfu/ml备用。以上述6种浓度的3种菌悬液分别给小鼠腹腔注射0.5 ml，观察2周内各组动物的死亡情况[4]。选择毒力较为适中的细菌及菌液进行体内抗感染实验。取40只昆明小鼠，随机分为2组，每组20只。实验组小鼠每天灌胃5%浓度乌贼墨0.5 ml，连续7 d。对照组小鼠给予等量生理盐水。于第3天给小鼠腹腔注射0.5 ml浓度为所选菌悬液。观察1周内小鼠的感染情况及死亡率。用无菌棉签沾取死亡小鼠腹腔液进行涂片镜检、分离培养和生化鉴定。
1.5统计学方法
用SPSS13.0统计软件包进行分析，计算相应的统计参数，组间比较采用卡方检验。P
2 结果
2.1 乌贼墨体外抗菌活性
在大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎链球菌(ATCC 49619)生长的平板上，乌贼墨新鲜墨汁和粗提悬液的孔周围均无抑菌圈产生。
2.2乌贼墨体内抗感染作用
实验组与对照组比较，死亡率明显降低。结果见表2。
浓度分别为1：1×1010 cfu/ml，2：5×109 cfu/ml，3：1×109 cfu/ml，4：5×108 cfu/ml，5：1×108 cfu/ml，6：5×107 cfu/ml
取小鼠腹腔液涂片作革兰染色，实验组小鼠腹腔液涂片镜下可见G－杆菌，培养于普通琼脂平板，可见边缘整齐、表面光滑、湿润、半透明的中等菌落，生化反应IMViC结果为（++--）。对照组小鼠腹腔液涂片镜下及培养均未见细菌。
3讨论
抗感染免***是免***学研究最早、应用最广泛的领域，尽管长期以来，研究者们在这方面做了大量的研究，且在保障人类健康，消灭、控制人类传染病方面取得了辉煌的成就，但抗感染免***的研究，尤其是在基础免***研究方面仍然有很多领域尚未阐明。
本实验以乌贼墨这一活血化瘀中药，用于抗感染的研究，结果显示新鲜乌贼墨与粗提乌贼墨在体外对琼脂打孔法中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎双球菌无抑菌圈产生。其可能原因为：①日本学者发现的使乌贼肉储存时间明显延长的抗菌成分，是一类具有生物活性的酶类，在保存和处理乌贼墨的过程中这一类物质容易被破坏；②如果乌贼墨的抗菌成分是大分子酶类，即使没有被破坏，琼脂打孔法这种适用于传统中药提取液的方法并不适用于乌贼墨抗菌活性的测定；③杜铁平等[6]人也发现了乌贼墨提取物的体外，体外抗菌作用，提示我们新鲜和粗提的乌贼墨不溶于水的特性使其可能具有的抗菌成分无法发挥的作用。综合以上三点考虑，我们可以在提取乌贼墨抗菌活性成分的基础上进一步研究乌贼墨的抗菌活性。本实验中粗提的乌贼墨在体内可以使大肠埃希菌感染的小鼠的死亡率明显下降，表明了粗提乌贼墨可通过提高机体的免***力来增强机体的抗感染能力。其可能机制是乌贼墨对巨噬细胞有较强的刺激作用，使巨噬细胞活化成为效应细胞，同时增强NK细胞杀伤活性从而增强小鼠抗大肠埃希菌的能力。虽然粗提乌贼墨的这种抗菌作用不如抗生素抗菌作用强，但其廉价、性质稳定、无副作用、能增强机体免***力的优点，已被日本等国家重视，他们将乌贼墨添加到食品中，制成乌贼墨面、乌贼墨冰淇淋等健康食品，深受大众欢迎[7]。这种对中药的开发利用非常值得我们去学习。
[参考文献]
[1]Nicolaus RA, Piattelli M, Fattorusso E. The structure of melanins and melanogenesis. IV. On some natural melanins[J]. Tetrahedron, 1964, 20(5): 1163-1172.
[2]谢光临, 吕昌龙, 洪明标，等.乌贼墨促凝血作用机制的实验研究[J].中国医科大学报，1994，23(6): 530-531.
[3]张友菊, 周邦靖, 熊素华.120种中药对脑膜炎球菌抑菌作用的实验观察[J].中医药研究,2001,17(2):40-41.
[4]邵瑞霞, 陶先进, 王静,等. 盆腔炎颗粒对小鼠感染模型的体内抗菌作用观察[J]. 安徽医学,2005,26(2): 102-109.
[5]马维娜, 杨吉贤.乌贼墨的研究[J].长春中医学院学报,1996,57 (12):52-52.
[6]杜铁平, 周培根, 卫小怡.乌贼墨抗菌活性的分离与研究[J].现代食品科技, 2005, 21(1): 69-71.
[7]王群, 吕昌龙, 吕超, 等.乌贼墨诱生小鼠IFN-γ及调节LAK细胞活性的研究[J].中国海洋药物, 2001, 20(1): 37-39.
（收稿日期：2008-05-07）
注：本文中所涉及到的***表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文