学文网作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨?F，袁志，胡蕴玉
【摘要】 目的：构建并制备血管生成素?1和egfp双基因共表达重组腺病毒载体. 方法 ：采用基因克隆技术克隆目的基因ang?1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因egfp的穿梭载体padtrack?cmv；使用padeasy?1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌bj5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入qbi?293a细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果：ang?1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经xho i/ecor v双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带，证明padtrack?cmv?ang?1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与padeasy?1质粒重组后，产物经pac i酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒pad?ang?1?egfp构建成功；线性化重组的腺病毒转染入qbi?293a细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./l，egfp活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论：成功制备了pad?ang?1?egfp腺病毒. 为骨组织工程血管化的 研究 打下基础.
【关键词】 血管生成素； 腺病毒； 基因转染； 增强型绿色荧光蛋白
0引言
大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因. 因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要. 血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而ang?1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］. 所以对于ang?1的研究对于大段骨缺损的 *** 显得极有意义. 本研究中， 我们设计、 构建了携带ang?1基因的腺病毒（adenovirus）， 为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.
1材料和方法
1.1材料pcdna3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒padtrack?cmv(含egfp基因)、padeasy?1, 菌种bj5183购自stratagene公司；293a细胞株、转染试剂(lipofectamine 2000)购自invitrogen公司. 各种限制性内切酶，t4连接酶、反转录酶primescripttm reverse transcriptase, dna聚合酶（primestartm hs dna polymerase）, pmd18?t vector购自takara公司. 质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（omega bio?tek）公司,mrna提取试剂（polyatract system 1000）,m?mlv购自promega公司.
1.2方法
1.2.1血管生成素?1 （ang?1）基因的克隆及鉴定①在genebank上查询ang?1的序列为nm_001146. 根据此序列设计引物. 引物序列为：f: ccgctcgag atgacagttttcctttcc, r: tttgatatctcaaaaatctaaaggtcg上游引物引入xhoⅰ位点，下游引物引入ecorⅴ位点. ②rna的提取及cdna的获得：使用polyatract system 1000试剂盒从胎盘组织中提取mrna提取步骤按照说明书进行，将提取的mrna使用反转录酶primescripttm reverse transcriptase反转录为cdna，步骤按照说明书进行. ③pcr扩增ang?1 基因片段：以上述获得的cdna为模板，进行pcr反应. 反应条件为98℃ 10 s, 65℃ 5 s, 72℃ 2.5 min. 35个循环. 琼脂糖电泳鉴定. ④ang?1克隆入pmd18?t vector，dna测序鉴定：将pcr产物进行凝胶回收纯化后，克隆至pmd18?t vector中，将质粒pmd18?t?ang?1转化至细菌dh5α中，扩增后送公司测序.
1.2.2携带ang?1基因和报告基因egfp 的腺病毒载体的构建①将基因ang?1克隆至腺病毒穿梭载体padtrack?cmv：质粒pmd18?t?ang?1和穿梭载体padtrack?cmv（含有基因egfp）分别进行xhoⅰ/ecorⅴ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，加入t4连接酶进行连接. 转化入细菌dh5α，提取克隆进行酶切鉴定. ②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒padeasy?1转化入细菌bj5183中，得到含有padeasy?1的bj5183细菌，将鉴定正确的携带目的基因ang?1的穿梭载体转化入含有padeasy?1的 bj5183中进行同源重组. 挑取其中较小的菌落扩增、提取质粒. ③重组病毒的鉴定：将重组的质粒pac i酶切后进行8 g/l琼脂糖电泳，与标准的重组腺病毒酶切谱形进行对比，鉴定得到的重组病毒是否正确.
1.2.3重组腺病毒的包装及扩增①腺病毒的包装：培养293a细胞，6孔板按每孔4×105铺细胞，第2 d将重组的腺病毒质粒pac i酶切线性化，并胶回收法纯化. 然后将线性化的质粒dna使用脂质体lipofectamine 2000转染入293a细胞中. 第4 d换液，第11 d收集细胞，反复冻融收集病毒. ②腺病毒的扩增：得到病毒的1/3用于感染新的293a细胞，48 h收集细胞. 如此反复共进行4轮扩增，收集所有细胞，反复冻融，得到重组腺病毒.
1.2.4重组病毒物理滴度测定采用点杂交法测定重组病毒的物理滴度（以载体基因组数量/l表示，即v.g./l）具体 方法 如 参考 文献 ［5］.
1.2.5重组病毒egfp的活性检测培养293a细胞，按5×104/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，常规培养24 h. 按moi梯度值（2×105, 1×105, 5×104）确定重组病毒加样量. 阳性对照病毒由本元正阳基因基因技术有限公司提供(物理滴度为1×1015 v.g./l),加样moi值为1×105.
2结果
2.1ang?1基因的克隆及鉴定经过提取mrna、反转录、pcr扩增得到了大小约为1.5 kb的预期片段. 经酶切鉴定，及dna测序 分析 证实ang?1基因克隆成功.
2.2腺病毒载体的构建及鉴定基因ang?1成功克隆至腺病毒穿梭载体padtrack?cmv中，穿梭载体pad track?cmv?ang?1与骨架dna在细菌bj5183中成功重组出腺病毒pad?ang?1?egfp. 重组的腺病毒质粒经pac i酶切，8 g/l琼脂糖电泳分析. 在***2中可见经pac i酶切后出现一大一小2个片段，大片段约为30 kb，小片段约为4.5 kb. 与预期的谱形相同. 证实重组腺病毒成功.
2.3重组腺病毒的包装及扩增重组的腺病毒dna经线性化后转染入293a细胞，在293a细胞中包装腺病毒. 在包装的第3，5，8，11 d分别用倒置荧光显微镜观察，发现荧光逐渐增多，光镜下观察细胞在8 d出现病理性变化（cpe）. 证实病毒包装成功. 将得到的病毒继续感染新的293a细胞，扩增病毒. 经过4轮扩增，最终病毒的滴度达到2×1014 v.g./l.
2.4重组腺病毒的egfp活性检测重组腺病毒各moi梯度的egfp活性不一（表1，***3）.表1重组病毒egfp的活性检测结果
3讨论
目前 在血管化的 研究 中，促血管形成的细胞因子的研究正在成为热点. 相对于直接 应用 蛋白分子 *** ，基因***有着价格低廉，作用持久的优势. 本研究设计使用重组腺病毒作为基因***的手段. 相对于其他方式，重组腺病毒有着其本身独有的优势：毒感染效率高，可达到90%以上；不整合如宿主细胞的dna，安全性较好；携带基因表达的时间约4~8 wk，这与骨愈合的时间相符，因此是骨组织工程研究的理想的工具［6］.
ang?1基因在1996年由davis首次克隆出来，具有抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞出芽、迁移和趋化等重要作用，在成骨细胞有明显表达，在骨折愈合过程中发挥重要作用. 我们克隆了基因ang?1,并使用经典的padeasy?1系统［7］构建并包装扩增带有ang?1和egfp的腺病毒. 在腺病毒的重组中，我们较之经典方法做了一些改进. 在经典的方法中，穿梭载体和骨架质粒是使用磷酸钙法同时转入细菌bj5183中进行同源重组的，而我们在本研究中采用分步转化的方法先将骨架基因转化入bj5183中，然后再将携带目的基因的穿梭载体padtrack?cmv?ang?1转化入含有病毒骨架基因的bj5183中，完成同源重组. 经过改进后的方法同源重组正确的几率大大提高. 在我们的实际工作中，该方法重组后挑选最小的10个克隆，经pac i酶切鉴定，有8个正确. 同源重组的正确率在80%. 重组后的病毒dna经293a细胞包装并扩增后滴度可达到2×1014 v.g./l.
病毒感染效率实验显示本研究制备的腺病毒有着较高的感染效率, 可用于血管化的相关实验研究.
【参考文献】
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