学文网摘 要：为研究锦鲤腐皮病的防治方法，试验分离了锦鲤腐皮病治病菌一株，经VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分析仪鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）；采用改良二倍稀释法，研究了甲醛、高锰酸钾和三氯异氰尿酸3种消毒剂对其的作用效果。结果表明：甲醛、高锰酸钾和三氯异氰尿酸对该致病菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为14 μl・L-1、3 mg・L-1、12 mg・L-1，最小杀菌浓度（MBC）分别为28 μL・L-1、15 mg・L-1、36 mg・L-1。
关键词：消毒剂；锦鲤；腐皮病；最小抑菌浓度(MIC)；最小杀菌浓度(MBC)
中***分类号：R187+.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.06.010
Isolation and Identification on One Pathogenic Bacteria Strain of “Skin fester” Disease in Koi (Cyprinus carpio) and Germicidal Efficacy of Three Kinds of Disinfectant Against Isolated Pathogenic Bacteria
XIN Wei-tao，DONG Shao-jie，YANG Guang
(Department of Fishery Science, Tianjin Agricultural University, Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture of Tianjin, Tianjin 300384,China)
Abstract: To study control methods of “Skin fester” disease in Kio, one pathogenic bacteria strain was isolated from Koi that suffered from “skin fester” disease and identified as Sphingomonas paucimobilis by using VITEK-2 automated microbiology system. By improved double dilution method, germicidal efficacy of methanal, potassium hypermanganate and trichloroiminocyanuric acid against S. paucimobilis was studied. The results showed minimal inhibitory concentration (MIC) of three kinds of disinfectant was 14 μL・L-1, 3 mg・L-1 and 12 mg・L-1 and minimal bactericidal concentration (MBC) was 28 μL・L-1, 15 mg・L-1 and 36 mg・L-1.
Key words: disinfectant; Cyprinus carpio; “Skin fester” disease; minimal inhibitory concentration（MIC）; minimal bactericidal concentration (MBC)
锦鲤（Cyprinus carpio）在分类学上隶属鲤形目、鲤科、鲤属，因其多变的体色和美妙的泳姿，被人们用作观赏动物进行养殖。为维系锦鲤性状稳定而采取的近亲方式，降低了其对病原的抵抗力，导致在锦鲤养殖过程中常会因病原生物感染而出现各种疾病。
腐皮病又称打印病、溃烂病，是锦鲤常见的细菌性疾病之一，主要危害一龄以上大鱼，夏、秋季节是该病的高发期。鱼种患该病的部位主要在附近的两侧，或尾鳍基部，亲鱼则全身各处均可出现病灶。症状初期病灶部位出现红斑，严重时鳞片脱落，肌肉腐烂，鱼体消瘦，严重破坏了锦鲤的观赏性。目前对该病的防治多使用抗生素类药物，长期使用和不科学的使用方法使该病致病菌对抗生素类药物产生了耐药性。王旭等[1]的研究表明该病病原菌对万古霉素等19种抗生素存在耐药性问题。
本试验分离锦鲤腐皮病致病菌1株，使用VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分离仪对其生理生化特性进行了鉴定，并研究了甲醛、高锰酸钾和三氯异氰尿酸3种常见消毒剂对其的作用效果，以期为该病的防治提供参考。
1 材料和方法
1.1 病原细菌的分离和鉴定
采用常规方法从病鱼内脏器官中分离、纯化细菌；使用VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分析仪对细菌进行鉴定；通过注射感染的方法进行攻毒试验以确定致病菌。
1.2 致病菌菌悬液的制备
将致病菌接种于液体培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.2）中，28 ℃、180 r・min-1振荡培养24 h后，3 000 r・min-1离心30 min。去上清液后用无菌生理盐水洗脱细菌，制备成5×106 cfu・mL-1的细菌悬液备用。
1.3 试验用消毒剂的制备
用无菌水将分析纯高锰酸钾和三氯异氰尿酸分别配制成浓度为2 048 mg・L-1的母液，将甲醛溶液（浓度35%~38%）配制成浓度为2 048 μL・L-1的母液。
用无菌水按二倍稀释法将母液依次稀释10个梯度，配制成浓度分别为1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 mg・L-1（μL・L-1）的消毒剂。
1.4 最小抑菌浓度与最小杀菌浓度测定
最小抑菌浓度与最小杀菌浓度的测定参照王印庚等[2] 的方法略作改动。在3 mL含有消毒剂的培养液中加入0.1 mL细菌悬液，充分混匀，28 ℃恒温培养24 h。取上述混合液0.5 mL，加入含有2.5 mL无菌生理盐水的试管中，28 ℃恒温培养24 h后，肉眼观察，以没有细菌生长的最低浓度作为消毒剂对细菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
在上述试管中取0.1 mL液体接种于固体培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.2），28 ℃恒温继续培养24 h后，肉眼观察，以没有细菌菌落生长的最小浓度为消毒剂对细菌的最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）。
首先用二倍稀释法测定出MIC和MBC的大概浓度范围，再用灭菌双蒸水将消毒剂母液稀释成小梯度的含有消毒剂的培养液，进行药物作用浓度的准确测定。
试验设3组平行（组I、组II、组III），用无菌水替代消毒剂作为阳性对照组。
2 结果与分析
2.1 致病菌的鉴定结果
在病鱼内脏器官中共分离出3株细菌，攻毒试验结果表明其中一株为致病菌。经VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏分析仪鉴定，该致病菌为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。
2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定结果
甲醛、高锰酸钾和三氯异氰尿酸3种消毒剂对少动鞘氨醇单胞菌的生长均具有抑制和杀灭作用，最小抑菌浓度（MIC）分别为14 μL・L-1、3 mg・L-1和12 mg・L-1（表2），最小杀菌浓度（MBC）分别为28 μL・L-1、15 mg・L-1和36 mg・L-1（表3）。3种消毒剂的最小杀菌浓度均比其最小抑菌浓度高2～5倍。
3 讨 论
引起水产动物腐皮病的病原菌种类较多，彭强等[3]指出引起斑点叉尾腐皮病的主要病原菌为柱形屈挠杆菌（Flexibacter columnaris）和点状产气单胞菌（Aeromonos punctata），其中点状产气单胞菌还可引起金鱼腐皮病[4]。张伟妮等[5]从患腐皮病的日本鳗鲡体表溃烂处分离到病原菌嗜水气单胞菌（A. hydrophila）；曹红梅等[6]指出杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、停***链球菌（S. dysgalactiae）、温和气单胞菌（A. sobria）和无***链球菌（S. agalactiae）是引起大西洋鲑腐皮病的致病菌；温海深等[7]指出点状产气单胞菌点状亚种（A. punctata Sub. punctata）是鲫腐皮病致病菌。有关于锦鲤腐皮病病原的研究较少。陈万光等[8]的研究指出温和气单胞菌是引起锦鲤溃烂病的病原菌。李梅等[9]从自然发病，全身不同程度溃烂的锦鲤病灶处分离出致病菌嗜水气单胞菌。本次研究结果表明，感染少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）可导致锦鲤发生腐皮病。该菌是革兰氏阴性杆菌，在自然环境中广泛存在，可引起人类创伤后溃疡、败血症和急性脑膜炎等疾病。
综合目前关于药物对鱼类腐皮病致病菌作用效果的研究结果，不同致病菌对不同消毒剂的敏感性有差异（表4），这就要求我们在使用消毒剂防治水产动物疾病时，首先要进行药物敏感性试验，检测病原菌对所用消毒剂的敏感性情况，选择合适的药物剂量，以达到杀死病原菌、防治疾病的目的。
本研究表明，高锰酸钾和三氯异氰尿酸对少动鞘氨醇单胞菌的MIC和MBC，较该两种消毒剂的常用剂量有所升高，而甲醛对少动鞘氨醇单胞菌的MIC和MBC低于其常用剂量（高锰酸钾全池泼洒时一般为4～7 mg・L-1[14]、甲醛为20～30 μL・L-1 [15]、三氯异氰尿酸为0.4 mg・L-1[16]）。这在一定程度上说明该致病菌在长期和消毒剂相接触过程中，对部分消毒剂的耐药性有所增强。因而在防治锦鲤腐皮病的过程中，应合理科学的使用消毒剂，以达到控制疾病并且降低致病菌对药物耐药性的目的。
参考文献：
[1] 王旭,颜其贵,雷燕,等.中国大鲵腐皮病病原菌的分离与鉴定[J].中国共患病学报,2010,26(10):946-948.
[2] 王印庚,牟潜,张肖荣.七种消毒剂对大菱鲆烂鳃病致病原鳗弧菌的杀灭作用研究[J].齐鲁渔业,2009,26(5):12-16.
[3] 彭强,张宗慧.斑点叉尾腐皮病的***[J].水利渔业,2004,24(1):61.
[4] 刘骏,霍以群,王云.金鱼腐皮病的诊治[J].中国动物检***,1994,11(3):12,43.
[5] 张伟妮,朱志华，陈志伟，等.日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定[J].淡水渔业，2010,40(2):41-46.
[6] 曹红梅,刘力. 大西洋鲑腐皮病研究进展[J].安徽农学通报, 2009, 15(9):192-193.
[7] 温海深,刘振琦,马国文.鲫腐皮病病原菌的初步研究[J].大连水产学院学报,1995,10(1):49-55.
[8] 陈万年,蔡冰.7种日本锦鲤疾病的诊治方法[J].安徽农业科学,2007,35(23):7173-7174.
[9] 李梅,刘文利,黄树涛,等.锦鲤嗜水气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国预防兽医学报,2010,32(8):591-594.
[10] 覃达由.欧洲丁病害防治技术[J].中国水产,2005（12）:57.
[11] 毛叔良.鲢鳙腐皮病的防治[J].渔业致富指南,1999（15）:32.
[12] 徐洋. 3种消毒剂对水生动物3种主要致病菌的载体定量杀菌试验[J].水产科学,2010， 29(2):102-105.
[13] 习志江. 常见蛙病及防治对策[J].内陆水产,2004（1）:35-36.
[14] 何杰.高锰酸钾在水产养殖中的应用[J].河北渔业,2007（5）:18.
[15] 张益昌.甲醛在水产养殖中的应用及其注意事项[J].河南水产,1998（3）:18.
[16] 张世光.高效新鱼药-三氯异氰尿酸[J].中国水产,1996（1）:28.
转载请注明出处学文网 » 一株锦鲤腐皮病致病菌的分离与鉴定及3种消毒剂对其的作用效果