学文网摘要 为探讨活性成分藁本内酯的含量与“当归类”药材的产地、性状、质量和品种的相关性，应用HPLC-DAD-MS测定了30份不同产地的中国当归，6份日本当归，4份韩国当归和4份欧洲当归样品中Z-藁本内酯和E-藁本内酯的含量，以Z-和E-藁本内酯的含量之和为指标进行样品间比较。中国当归Angelica sinensis中藁本内酯的质量分数为5.63～24.53 mg·g-1，样品间差异较大，平均值为11.02 mg·g-1（n=30）。其中，云南、四川、甘肃和陕西产当归中藁本内酯的质量分数分别为13.90（n=6），12.51（n=6），10.04（n=13），5.631 mg·g-1 （n=1）；同一省内各县产的当归中藁本内酯的含量也有差异。药材性状以当归小、侧根多而细、断面色黄白、气味浓郁者，藁本内酯的含量高。6份日本当归A. acutiloba和A. acutiloba var. sugiyamae和2份欧当归Levisticum officinale中藁本内酯的质量分数分别为1.00（n=6），2.78 mg·g-1 （n=2），为中国当归的9.12%，25.23%。4份韩国当归A. gigas和2份欧洲当归A. archangelica中未检测到藁本内酯。由此可见，不同产地中国当归的性状不同，藁本内酯的含量和药材质量也有差异；中、日、韩和欧洲当归原植物的来源不同，藁本内酯等活性成分有显著差异，其功效也会不同，不宜替代、混淆用药。
关键词 中国当归；日本当归；韩国当归；欧洲当归；藁本内酯；HPLC；含量测定
收稿日期 2013-02-18
基金项目 国家自然科学基金项目（81073044）
通信作者 *吕光华，Tel：（028）61800232，Fax：（028）61800234，E-mail：
作者简介 李曦，硕士研究生，Tel：13408626758，E-mail：
当归是一味常用的大宗中药材，来源于伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功能。当归富含挥发油，经验鉴别质量以香气浓郁者为佳；《中国药典》（2010年版）规定：当归中挥发油的含量不得少于0.4% （mL·g-1）[1]。藁本内酯是当归挥发油中的主要成分，也是活性成分，具有保护神经、舒张血管、抗肿瘤、镇痛、消炎等功效[2]。因此，当归中藁本内酯的含量与药材质量密切相关。目前，对当归中藁本内酯含量测定的方法报道较多，但对不同产地、不同质量当归中藁本内酯的含量及其相关性报道极少，或测定样品的数量较少[3-5]。同时，“当归”在中国的中医、日本药局方和韩国的传统医学中入药的功能、主治一致，甚至组方相同，但原植物来源不同。日本当归来源于植物A. acutiloba Kitagawa 和A. acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino的根[6]；韩国当归来源于植物A. gigas Nakai的根[7-8]。50年代从欧洲引种欧当归（Lovage root）到我国河北、山东、内蒙古等多个省栽培，该植物为Levisticum officinale Koch.，收载于欧洲和英国《药典》[9-11]。欧洲另一种容易与中国当归混淆的植物药“angelica root”，原植物为A. archangelica L.[10-12]。这些不同植物来源药材的性状、气味明显不同，挥发油的含量及其组成不同，功效也可能不同。但是，目前国内外均存在不同程度的混用现象。为此，作者在前期工作的基础上[4， 13]，收集了30份不同产地的中国当归的全根样品，6份日本当归，4份韩国当归和4份欧洲当归样品，应用HPLC-DAD-MS测定了E-藁本内酯和Z-藁本内酯的含量，探讨了藁本内酯的含量与药材产地、质量、品种之间的相关性，以期为“当归类”药材的真伪鉴别、质量评价、临床应用提供科学依据。
1 材料
Agilent 1100型高效液相色谱仪 （美国），配置G1322A真空***脱气机，G1312A四元梯度泵，G1329A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1315A二极管阵列检测器。LC-（APCI） MS-MS系统（PE-SCIEX API 365型，美国）。电子分析天平为德国Satorius （d=0.1 mg， CP224S） 和瑞士Mettler Toledo（d=1 μg，MT5）。超声提取器为Branson 5510E-MTH型（美国）。Z-藁本内酯对照品由本实验室自制，经核磁共振氢谱和碳谱鉴定，其纯度以HPLC色谱峰的面积归一化法计算大于98.0%。甲醇（分析纯）和乙腈（色谱纯）为Lab-scan （泰国），纯净水由Millipore净水器 （美国）产生。
30份中国当归样品（CDG1～CDG30）为A. sinensis 的根，分别从甘肃、四川、云南、陕西等地收集，见表1。
6份日本当归样品为A. acutiloba或A. acutiloba var. sugiyamae 的根；其中，JDG1～JDG4产于日本奈良或北海道；JDG5由韩国Kyunghee大学药学院 Hong Jongki博士提供；JDG6购于韩国首尔市的药店。4份韩国当归样品为A. gigas的根；其中，KDG1采集于吉林省安***县，由吉林省中医药研究院严仲凯研究员提供；KDG2～KDG4购于韩国首尔市的药店和药材市场。4份欧洲当归样品中，EDG1和EDG2为 Levisticum officinale的根，由奥地利格拉兹大学Rudolf Bauer 教授提供。EDG3和EDG4为A. archangelica 的根，产于波兰，前者购于德国，后者购于奥地利。药材样品由赵中振教授、吕光华教授以及吉林省中医药研究院严仲凯研究员鉴定。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱为Alltima C18 （4.6 mm× 150 mm，5 μm）；保护柱为C18 （4.6 mm× 7.5 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（60∶40）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为室温；进样量为10 μL；检测波长是350 nm，HPLC-DAD***收集紫外光谱为200～400 nm。LC-MS/MS收集正、负离子的质谱。在该色谱条件下，Z-藁本内酯和E-藁本内酯色谱峰分离良好，见***1。
2.2 藁本内酯色谱峰的鉴定
在药材样品HPLC***中，Z-藁本内酯色谱峰与对照品的保留时间（tR）、HPLC-DAD***检测的UV光谱，见***2，和LC-MS-MS的分子离子峰m/z 191[M+H]+及其碎片峰（m/z 173， 145， 117， 83） 一致，而被鉴定。E-藁本内酯色谱峰与Z-藁本内酯色谱峰同时存在，强度比后者低；其UV光谱与文献[14]一致；LC-MS/MS的分子离子峰及其主要碎片峰与Z-藁本内酯相同，并与文献值一致[15]，因此得以鉴定。
表1 “当归类”药材中藁本内酯的质量分数（n=4）
Table 1 Content of ligustilides in "Danggui" samples（n=4）
注：*.未以干燥品计；CDG.中国当归Angelica sinensis；JDG.日本当归A. acutiloba 或A. acutiloba var. sugiyamae；KDG.韩国当归A. gigas；EDG1，EDG2.欧当归lovage root，原植物为Levisticum officinale；DEG3，EDG4.angelica root，原植物为A. archangelica；-. 未检测到藁本内酯。
A. 对照品；B. 中国当归A. sinensis；C. 日本当归A. acutiloba；D. 欧当归Levisticum officinale；1.E-藁本内酯；2.Z-藁本内酯。
***1 对照品及“当归类”样品HPLC***
Fig.1 HPLC chromatograms of Z-ligustilide standard and "Danggui" samples
***2 HPLC-DAD***检测药材样品中E-藁本内酯（A）和Z-藁本内酯（B）的UV***
Fig.2 On-line UV spectra of E-ligustilide （A） and Z-ligustilide in Danggui samples detected by HPLC-DAD method
2.3 藁本内酯对照品溶液制备及线性范围考察
精密称取Z-藁本内酯对照品适量，置棕色量瓶中，立即加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为1.0 g·L-1的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL于10 mL量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀。依选定的色谱条件进样 （10 μL） 测定，以峰面积与对照品量 （μg） 进行线性回归，得回归方程Y=16.472X + 17.535，r=0.999 8 （n=9）。结果表明，Z-藁本内酯进样量在0.10～4.0 μg时，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.4 供试液的制备
取样品粉末 （20目） 0.5 g，精密称定，置60 mL具密封盖的棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL， 密闭，称定质量；超声提取90 min后取出， 称重，补足减失的质量；摇匀，静置；取上清液经0.20 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.5 精密度试验
取对照品溶液，依选定的色谱条件连续进样6次，测定Z-藁本内酯的峰面积，其RSD为0.78%（n=6）。
2.6 稳定性试验
分别取对照品溶液和供试品溶液于棕色瓶中，密闭、室温保存。于0，12，24，48，72，96 h进样2次，测定Z-藁本内酯的峰面积，其RSD分别为0.45%和0.85% （n=6）。说明Z-藁本内酯在此溶液中的稳定性良好。
2.7 重复性试验
取同一中国当归样品粉末6份，照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，进样测定，计算Z-藁本内酯的含量，其RSD为0.85% （n=6） 。
2.8 回收率试验
取已知Z-藁本内酯含量的中国当归药材0.25 g，9份，精密称定。分别精密加入其含量的0.5，1，1.5倍量的Z-藁本内酯对照品溶液，每个浓度3份。按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别测定Z-藁本内酯的含量。3个浓度的回收率分别为（98.3±1.66）%，（96.8±0.93）%和（101.7±1.24）%（±s， n=3）。其平均回收率为（98.9±2.52）% （n=9）。
2.9 样品测定
每份药材粉末称取2份，按供试液的制备方法制成供试液，各进样测定2次。根据回归方程计算样品中Z-藁本内酯的含量。因未获得E-藁本内酯对照品，而 E-藁本内酯与Z-藁本内酯系顺、反异构体，其紫外光谱相似，最大吸收波长相同，见***2。因此，本实验中将E-藁本内酯在样品中的含量以Z-藁本内酯计算。44份不同来源的“当归类”药材中藁本内酯的含量见表1。
3 讨论
藁本内酯结构中具有环外双键，在植物体中以Z-藁本内酯和E-藁本内酯2种顺反异构体存在。在38份检测出藁本内酯的“当归类”药材样品中，Z-藁本内酯与E-藁本内酯的含量之比为4.03～47.08，平均值16.9（n=38）。说明“当归类”药材中以Z-藁本内酯为主，是开发新药的原料。
现代药理及临床研究结果表明Z-藁本内酯为活性成分。虽然目前尚未见E-藁本内酯生物活性的研究报道。但是，E-藁本内酯为Z-藁本内酯和E-藁本内酯总量的7.57% （n=38），也是当归挥发油的主要成分之一。因此，本研究以Z-藁本内酯和E-藁本内酯含量之和作为“当归类”样品中藁本内酯含量的指标进行讨论。
3.1 中国当归中藁本内酯含量的比较
3.1.1 当归性状与藁本内酯含量的相关性 为便于样品之间比较，本研究测定了30份中国当归全根样品中藁本内酯的含量，其质量分数为5.63～24.53 mg·g-1，差异很大，平均值为11.02 mg·g-1（n=30）。结果表明：①当归根断面色黄白，气味浓郁者，藁本内酯的含量高。断面色棕褐、气弱者，藁本内酯含量低。这与传统经验鉴别评价当归质量优劣的指标一致。②当归小，侧根多而细者，藁本内酯的含量高。反之，当归主根、侧根粗大者，藁本内酯的含量低。这可能是由于藁本内酯在皮部的分布高于木部所致，有待于进一步研究证实。③样品中含水量高，易变质，断面变成棕褐色者，藁本内酯的含量低。为此，建议加工时应控制药材的含水量，保证药材的质量。
3.1.2 不同产地当归中藁本内酯含量的比较 当归主产于甘肃；在四川、云南、陕西等地也有栽种。为此，作者从甘肃、四川、云南、陕西分别收集了13，6，6，1份全归样品，测定藁本内酯的含量。藁本内酯的质量分数从大至小依次为云南产当归（13.90 mg·g-1，n=6）、四川产当归（12.51 mg·g-1，n=6）、甘肃产当归（10.04 mg·g-1，n=13）和陕西产当归（5.631 mg·g-1，n=1）。总体性状特征为：甘肃产的当归较大，云南产的当归较小，四川省平武县的当归侧根细长。
同一个省内不同县产的当归样品中藁本内酯的含量也有差异。在甘肃省内的4个县之间，当归样品中藁本内酯的质量分数从大至小的顺序为依次为宕昌（11.04 mg·g-1，n=3） 、岷县（10.55 mg·g-1，n=7）、漳县（8.23 mg·g-1，n=1）、渭源（7.66 mg·g-1，n=2）。其中，从岷县和渭源收集的当归较大。四川省平武县产的当归中藁本内酯的质量分数（13.35 mg·g-1，n = 5） 大于四川九寨沟产的当归（8.31 mg·g-1，n=1）。从九寨沟仅收集到1份样品，当归较小，藁本内酯的含量低，可能是由于该样品为一年生当归，其他地区生产的当归为2年生的原因。说明一年生当归不仅产量低，而且藁本内酯的含量也低。从云南省收集的6份当归样品中藁本内酯的质量分数为7.18～24.53 mg·g-1，差别较大。体形小的当归，藁本内酯的含量高。可能与海拔高度有关，有待于进一步确认。
3.1.3 其他当归样品中藁本内酯的含量 作者分别从成都、广州、杭州、湖南芷江县的药材市场和公司中收集了4份样品。藁本内酯的质量分数为6.50～12.10 mg·g-1，平均值为8.98 mg·g-1 （n=4）；比从不同产地收集的26份当归样品中藁本内酯的质量分数（11.344 mg·g-1，n=26） 低，可能与加工、贮藏方法有关。
从总体情况看，30份当归样品中藁本内酯的质量分数（5.63～24.53 mg·g-1）已达到了《中国药典》（2010年版）对当归中挥发油不低于0.4%（mL·g-1）的标准。若按样品的干重计算，藁本内酯的含量更高。也表明中国各地产的当归中挥发油的含量能够符合《中国药典》（2010年版）的要求。
3.2 其他国家“当归类”药材中藁本内酯的含量
3.2.1 日本和韩国当归中藁本内酯的含量 “当归”在中国的中医、日本药局方和韩国的传统医学中入药的功能、主治一致，甚至组方相同，但原植物的来源不同。中国当归来源于A.sinensis[1]，日本当归来源于A. acutiloba和A. acutiloba var. sugiyamae[6]。从日本和韩国收集的6份日本当归（JDG1～JDG6）中藁本内酯的质量分数（1.00 mg·g-1，n=6）仅为中国当归（11.02 mg·g-1，n=30）的9.12%。
韩国使用的当归有2种植物来源，一种来源于植物A. gigas Nakai，记载于相关医药文献中[7-8]。作者分别从吉林省和韩国首尔市收集了4份样品，均未检测到藁本内酯；与文献报道一致；该药材中富含香豆素[16]。另一种为日本当归。根据性状鉴定韩国Kyunghee大学药学院 Hong Jongki博士提供的样品（JDG5）和作者在韩国首尔市的药店中购买的样品（JDG6）均为日本当归。这2份样品中藁本内酯的质量分数为1.39 mg·g-1 （n=2），为中国当归的12.61%。
3.2.2 欧洲“当归”中藁本内酯的含量 《欧洲药典》和《英国药典》收载的植物药“Lovage root”（Levistici Radix）的原植物为欧当归Levisticum officinale Koch [10-11]，曾于1957年引种到我国河北、北京、山东、河南、内蒙古、陕西、江苏等多个省/市栽培，产量高，拟解决当时中国当归的紧缺问题[9]；现在仍有个别地区充当中国当归入药。本实验测定了2份从欧洲收集的样品（EDG1和EDG2），藁本内酯的质量分数（2.78 mg·g-1，n=2）为中国当归的25.23%。需要说明的是这2份样品分别为粗颗粒和粉末，加工和贮藏过程中藁本内酯会有一些损失。
《欧洲药典》和《英国药典》中记载的另一种植物药“Angelica root”（Angelicae Radix），来源于植物A. archangelica L.的根[10-12]，很容易与中国当归（Angelicae Sinensis Radix）混淆。为此，作者从德国和奥地利收集了2份产于波兰的这种植物药（EDG3和EDG4），未检测到藁本内酯。文献报道这种植物药中香豆素的含量高[17]。
由此可见，中、日、韩、欧洲“当归”药材的性状及气味明显不同，说明挥发油的组成成分不同，藁本内酯的含量也有显著差异。藁本内酯是活性成分，具有保护神经、舒张血管、抗肿瘤、镇痛、消炎等作用[2]。因此，这几种“当归类”药材的功效很可能不同，不宜替代、混淆用药。
[致谢] 吉林省中医药研究院严仲凯研究员，奥地利格拉兹大学Rudolf Bauer 教授，韩国Kyunghee大学药学院 Hong Jongki博士提供部分药材样品。
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Comparison on content of ligustilides in different Danggui samples
LI Xi， ZHANG Li-hong， LV Guang-hua， WANG Xiao-xiao， JIANG Wei-dong， JIN Yu-qing， ZHAO Zhong-zhen（1. Key Laboratory of the Ministry of Education in China on the Standardization of Chinese Materia Medica，
School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；
2. Sichuan Provincial Institute for Food and Drug Control， Chengdu 610097， China；
3. School of Chinese Medicine， Hong Kong Baptist University， Kowloon Tong， Hong Kong 00852， China）
[Abstract] Bioactivity of Danggui is linked to the content of ligustilide， but the relationship between ligustilide with herb shape， cultivating areas and plant species is still unknown. The relationship was investigated by quantifying on the amounts of Z-ligustilide and E-ligustilide by HPLC-DAD-MS method， and then comparing the content of ligustilides （the sum of Z-ligustilide and E-ligustilide） among forty-four various "Danggui" samples containing thirty Chinese Danggui （CDG）， six Japanese Danggui （JDG）， four Korea Danggui （KDG） and four European Danggui （EDG）. Results showed that the content of ligustilides in CDG samples （Angelica sinensis） was in the range of 5.63-24.53 mg·g-1 with the mean of 11.02 mg·g-1（n=30）. Ligustilides amounts were varied among samples cultivated in different areas in China， i.e. 13.90 mg·g-1 （n=6） in Yannan， 12.51 mg·g-1（n=6） in Sichuan and 10.04 mg·g-1（n=13） in Gansu. It was also found that ligustilides content was related to the shape， color and fragrance of herb， e.g. the relative larger amount of ligustilides was in the small main root， long rootlet and perfumed sample. Further， ligustilides contents were estimated to be 1.00 mg·g-1（n=6） in JDG samples （A. acutiloba and A. acutiloba var. sugiyamae） and 2.78 mg·g-1 （n=2） in EDG samples （lovage root， Levisticum officinale）. However， ligustilides could not be detected in the four KDG samples （A. gigas） and two EDG samples （angelica root， A. archangelica）. It has been concluded that ligustilide is significant variant among plant species， which may result in the variety of bioactivity and therapeutic effect.
[Key words] Angelica spp.； Levisticum officinale； ligustilide； HPLC； content determination
doi：10.4268/cjcmm20131718
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