学文网摘要:目的 采用三种方法对含有大量血红蛋白溶液的样本进行总蛋白量的测定，并进行对比，确定一种可行且简单的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法。方法 分别采用BCA法、Bradford法和Lowry法测定溶液总蛋白量，并采用HiCN法测定溶液中血红蛋白的含量。比较不同方法测定数据的差异。结果 5份样本用BCA测得总蛋白量为76.33g/L，Bradford法测得值为179.59g/L，Lowry法测得值为22.81g/L，HiCN法测得血红蛋白量为133.65g/L。结论 Bradford法是一种可行且重复性好的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法，BCA法和Lowry法的测定值明显低于实际值。
关键词 血红蛋白溶液 总蛋白量
The Compsrison of Different Handwork Methods on Measuing the Total Protein Concentration of the Hemoglobin Solution.Cai Ming-cui.The Blood Center of Liangshan,Xichang 615000,Sichuan,China.
【Abstract】Objective Three methods commonly used do determine the protein concentration were taken to measure the total protein of the solution containing stroma-free hemoglobin. And we tried to confirm a feasible way on measuring the total protein concentration through comparison of different methods.Methods The BCA, Bradford and Lowry methods were used to determine the total peotein, and the HiCN method was exploited to measure the level of hemoglobin.Results The average concentration of the total protein of 5 samples was 76.33g/L by BCA,179.59g/L by Bradford, and 22.81g/L by Lowry. The average concentration of hemoglobin by HiCN method was 133.65g/L.Conclusion The Bradford method was feasible and precise to determine the total protein concentration of hemoglobin solution. The results of BCA and Lowry methods were obviously lower than that of Bradford method and even the level of hemoglobin.
【Key words】Hemoglobin solution;Total protein concentraton
自Amberson等［1］首次使用粗制血红蛋白溶液作为血液代替品以来,研究人员通过层析［2］、超滤［3］、制备型HPLC等［3］方法纯化得到了高纯度的血红蛋白溶液，并以此为基础进行各种修饰，开发出不同的红细胞代用品［4］。在此过程中，血红蛋白纯度的检测是一个关键指标，影响化学修饰和产品的化学特性。文献报道多采用HPLC发，但该方法复杂，且仪器昂贵。笔者试***通过对常用测定蛋白质含量的方法（BCA法、Bradford法、Lowry法）的测定结果比较，为制备血红蛋白溶液寻找一种简单、快速的检测方法。
1 材料与方法
1.1 血红蛋白溶液样品的制备 新鲜采集的血样按文献［5］方法制备并编号。
1.2 血红蛋白含量测定 对上述制备的5份样本按HiCN［5］测定，并应用MD2型库尔特计数仪检测。
1.3 总蛋白测定 取40ul血红蛋白溶液加入10ml容量瓶中，稀释成1/250浓度，进行下列测定（每份样品均同）。 样品总蛋白量=下述各方法所得蛋白量×稀释倍数（250）
1.3.1BCA法 取4个Eppendorf管，1个为空白对照加入25ul去离子水，另外3个分别加入15ul样品和10ul去离子水。混匀后各加入500ul工作液。室温放置30min，以空白作对照，526nm比色检测。回归曲线：Y=7.619×10-4X。
1.3.2 Bradford法 取4个Eppendorf管，1个为空白对照加入100ul去离子水，另外3个分别加入40ul样品和60ul去离子水。混匀后各加入1ml Bradford染液，室温放置数分钟后，以空白作对照，595nm比色检测。回归曲线：Y=1.707×10-3X。
1.3.3 Lowry法 取4个Eppendorf管，1个为空白对照加入200ul去离子水，另外3个分别加入20ul样品和175ul去离子水。混匀后各加入200ul工作液。室温放置30min，以空白作对照，750nm比色检测。回归曲线：Y=2.2256×10-2X。
1.3.4 统计学处理 采用配对t检验和方差分析。
2 结果
对5份样品采用不同方法测定总蛋白量和血红蛋白量的结果见表1。HiCN法测定数据与机测数据经配对t检验，P＞0.05，无显著性差异；BCA法、Bradford法与Lowry法经方差分析和两两比较，结果差异均有显著性。BAC法与Lowry法测得值均较低。
3 讨论
实验室常用的蛋白质含量测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外检测法、BCA法、Bradford法与Lowry法等。其中凯氏定氮法虽有测定准确的优点，但因耗时太长，在本实验中未使用。Lowry法原理与双缩脲法相同，且加入了酚试剂可提高灵敏度。紫外检测法虽然简单快速，但有定量不准确的缺点。因此，本实验选用BCA法、Bradford法与Lowry法。
本实验对自制粗纯化的血红蛋白溶液进行测定，从结果来看，BAC法与Lowry法中总蛋白量的测定值都远远低于Bradford法的测定值，甚至低于测得的血红蛋白量。造成这种结果的原因可能是：游离血红蛋白溶液中的血红蛋白分子易氧化，生成高铁血红蛋白，使二价铁离子氧化成三价铁离子，从而影响BCA测试试剂中的Cu2+的价态及Lowry测试试剂中酚试剂的氧化，阻碍了有色复合物的生成，造成显色量的减少和测定值的偏低。另外，血红蛋白中酪氨酸残基量非常低，进一步影响了显色。而Bradford法通过染料结合的量来测定蛋白量，避免了因氧化还原产生的显色影响和不同蛋白质氨基酸组成的差异。因此，对于含有大量血红蛋白的溶液而言，Bradford法是一种可行且重复性较好的方法。
参考文献:
［1］ Amberson WR， Flexn J，Steggerda FR，et al. On the use of Ringer-Locke solution containing hemoglobin as a substitute for normal blood in mammals［J］. J Cell Comp Physiol，1971，77（3）：281-300.
［2］ Williams RC，Tsay KY. A convenient chrormatographic method for the preparation of human hemoglobin［J］. Analytical Biochermistry，1973，54（1）：137-145.
［3］ Winslow RM，Chapman KW. Pilot-scale preparation of hemoglobin solution［J］. Methods Enzymol，1994，231（1）：3-16.
［4］ Chad R，Haney BS，Paul W，et al. Purification and chemical modificationsofhemoglobinindevelopinghemoglobinbasedoxygen carriers［J］. AdvancedDrugDelivery Reviews，2000，40（3）：153-169.
［5］ 李影林. 临床医学检验手册［M］.吉林：吉林科学技术出版社，1987，70：88-89.
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