紫外线C对A549细胞HSPs表达的影响

摘要： ［目的］ 研究紫外线C（UVC）对热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）27、70及90的影响。 ［方法］ 用紫外线不同照射剂量（0、10、20、40、80 J/m2）来照射A549细胞株，用Western-blot检测HSP27、HSP70、HSP90的表达水平。 ［结果］ 随着UVC剂量的升高，HSP70和HSP27的表达水平先升高，达到一个高峰后又降低。HSP27表达在20 J/m2时达到高峰，HSP70表达在40 J/m2时达到高峰，HSP90各剂量的UVC照射下，未见显著性变化。与对照组（0 J/m2）相比，在10 J/m2时，HSP27和HSP70表达增加（P

关键词：HSP70；HSP27；HSP90；紫外线C；A549细胞

文章编号:1006-3617(2007)01-0028-04

中***分类号:R114

文献标识码:A

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一组进化上高度保守的蛋白质，在多种应激状态（如高温、缺氧、毒物等）、病理状态（病毒、细菌或寄生虫感染、炎症反应等）或生理刺激（生长因子、细胞分化和激素刺激等）下均可被诱导表达［1］。它能保护细胞、组织和机体免受或少受损伤。根据热应激蛋白分子量大小将HSPs分为如下几个家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs（22 000~33 000）及泛素（7 000~8 000）［2］。紫外线是一种存在于生产生活环境中的常见环境应激因素，根据波长可以分为紫外线（ultraviolet，UV）A、B和C不同的波段，其中以“C”波段作用能力最强［3，4］。关于紫外线刺激细胞后的HSPs的表达规律未见报道。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

VD21320型超净台（哈尔滨东联电子公司），CO2培养箱（Thermo Forma 公司），CK40型倒置显微镜（Olympus 公司），低温高速离心机（Sigma公司），电泳槽和垂直电泳仪（Bio-Rad公司），恒温水浴箱（江苏太仓医疗仪器厂）。紫外照射灯UV254 nm（15 W，上海特种荧光灯管厂），紫外辐照计（北京师大光照仪器厂），6孔细胞培养板（Corning公司）。DMEM培养基（GIBCO公司），新生牛血清（GIBCO公司），DC Protein Assay Kit（Bio-Rad公司），丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺（上海化学试剂公司，进口分装），十二烷基磺酸钠（SDS）、甘氨酸（华美生物工程有限公司），兔抗人HSP70，HSP27和HSP90（加拿大Laval大学Robert M，Tanguay教授惠赠），小鼠抗人GAPDH（上海康成生物公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG（华美生物工程有限公司），HRP标记羊抗鼠IgG（KPL公司），ECL发光试剂盒（Amersham公司）。

1.2 细胞培养及紫外照射

人肺腺癌细胞A549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。紫外照射前一天，取对数生长期细胞，按细胞密度为（5~7）×105个/孔接种于6孔培养板，5%小牛血清的DMEM培养基培养过夜。紫外照射前用温D-hank's液洗细胞2次，吸去液体进行紫外照射。紫外照射处理：调整光源与受照细胞间距离，利用紫外辐照计测定照射强度，使细胞表面所受照射强度为200 μW/cm2，分别用剂量为10、20、40和80 J/m2去照射细胞，相应的照射时间分别为5、10、20和40 s。按照预定UVC剂量处理不同组别的细胞，对照组细胞平行处理时不用紫外灯照射。设3个平行样。照射结束后，加入1 ml培养基放入细胞培养箱继续培养30 min后，用0.25%胰酶消化收获细胞。

1.3 HSP70、HSP27和HSP90的检测

收集恢复培养后的细胞，用冰裂解液［0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris/HCl，pH 7.6，1 mmol/L EDTA，pH 8.0，100 μg/ml苯甲基磺酰氟（PMSF），2 μg/ml亮抑酶肽（Leupeptin）］裂解细胞，以DC Protein Assay Kit进行总蛋白定量，调蛋白浓度一致。按文献报道［5，6］的Western blot方法检测HSP70及磷酸甘油醛葡萄糖脱氢酶（GAPDH）表达水平。兔抗人HSP70、HSP27和HSP90用含2%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（PBS）分别按1:10 000、1:5 000和1:5 000稀释，小鼠抗人GAPDH用含2%脱脂奶粉的PBS按1:5 000稀释，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3次，每次10 min；HRP标记羊抗兔免***球蛋白G（IgG）以含2%脱脂奶粉的PBS按1:10 000稀释，HRP标记羊抗鼠IgG以含2%脱脂奶粉PBS按1:5 000稀释，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min。用增强型化学发光法（ECL）检测蛋白质表达，胶片扫描保存。用Gel-Pro Analyzer（Ver 3.0）软件对胶片上蛋白质条带进行灰度值测定。用HSP70/GAPDH、HSP27/GAPDH和HSP90/GAPDH的灰度值比作为HSP70、HSP27和HSP90表达的相对含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件包进行单因素方差分析（ANOVA）。

2 结果

从***1和***2可以看出，细胞在不同剂量UVC作用下，HSP27、HSP70和HSP90的表达水平的变化及其相互关系：随着UVC剂量的升高，HSP70和HSP27的表达水平先升高，达到一个高峰后又降低。HSP27表达在20 J/m2时达到高峰的时候，HSP70表达还在升高阶段，当HSP70表达在40 J/m2时达到高峰的时候，HSP27表达开始下降。HSP90在10、20、40和80 J/m2的UVC照射下，未见显著性变化。

与对照组相比，在10 J/m2时，HSP27和HSP70表达增加（P

3 讨论

HSPs是一种广泛存在于微生物和动植物体内的一种应激蛋白。当生物体受到环境中的物理、化学以及生物性因素作用发生细胞氧化损伤后，可以合成大量的HSPs。热休克反应诱导产生的HSPs作为分子伴侣，可以和变性蛋白的疏水部分结合防止其聚集，使之重新折叠或降解，从而抵抗应激因素所造成的损害［7~10］。但是紫外线照射后的HSPs的表达规律却未见报道。

HSP70、HSP27和HSP90是热休克蛋白家族中重要的成员，它们在保护机体免受各种损伤中发挥着重要的作用。

HSP27重要的生物学功能是保护细胞免受各种应激因素的损伤。此外，HSP27也可参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导调节等。HSP27保护细胞的作用机制可能有以下几种：可以与真核生物蛋白合成所必需的起始帽复合物eLF4F的结构成分eLF4G 相结合，阻止mRNA的翻译，使真核细胞中未折叠的蛋白的量减少，从而减弱对细胞的破坏作用［11］；可以通过防止肌动蛋白（Actin）的破坏来维护细胞骨架的稳定［12］；在热休克后刺激RNA 及蛋白质的合成，协助细胞在死亡之前修复热休克造成的损伤，使细胞尽快恢复正常生理功能；维持谷胱甘肽水平，可以减少细胞间的活性氧，维持线粒体膜电位稳定，阻止细胞色素C的释放，从而阻止细胞色素C依赖的细胞凋亡途径［13］。

HSP70的主要功能有：①赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力和保护其免受应激因素的损害；②保护细胞DNA，在生物生长发育中有重要作用；③与体内重要生物活性物质有关；④作为分子伴侣发挥作用，参与新合成蛋白质的折叠、装配和运输，防止蛋白质变性和聚集，帮助损伤蛋白质的再折叠或降解等等［14，15］。

HSP90在细胞内具有重要的生理功能［16］。近年来的研究表明HSP90在肿瘤免***中具有重要作用，它作为抗原肽的载体参与了组织相容性复合物Ⅰ（MHC-Ⅰ）类抗原的提呈［17］；大量表达在肿瘤细胞膜上的HSP90可能具有NK细胞识别的靶结构［18］。

UVC照射A549细胞后，生成一些变性蛋白，细胞内已经存在的分子伴侣，如HSP70以及Hdj-1就会与其结合［19］。与此同时，释放了HSP70以及Hdj-1，HSF1从无活性的单体形式转化成三聚体形式，并转移到核内，磷酸化后获得转录活性启动了HSP27、HSP70的表达［20］。当生成的HSPs超过了发挥作用所需要的HSPs时，可以检测到的游离HSPs的量就开始增加，这时热休克因子结合蛋白1与游离HSP70以及三聚体状态的HSF1结合，使HSF1失活［19］，出现反馈抑制。这样游离的HSP27、HSP70开始下降，表达水平的峰值在此出现。本实验结果显示UVC照射时，HSP27在20 J/m2时出现反馈抑制，而HSP70在40 J/m2时才出现。这样的现象提示HSP27、HSP70在细胞应激后的过程中也许发挥了不同的作用。

有研究者认为HSP27在热应激初期，迅速磷酸化启动即刻反馈保护机制，抑制可能造成损伤的级联反应的发生［21］，而HSP70在后续的核内蛋白质的修复过程中发挥作用［22］。本研究也发现UVC处理A549细胞后，HSP27的表达水平在20 J/m2就达到了高峰，而HSP70的表达峰值迟于HSP27在40 J/m2才出现，提示两者发挥作用时在时间上可能存在互补关系。有研究者发现应激时HSP70部分入核，而HSP27全部进入核内，仅提高细胞内HSP70的表达水平足已恢复胞质变性了的蛋白质，但对核内变性蛋白质的修复能力有限［23］，而转染了HSP27基因的细胞，核内聚集的变性蛋白质解聚速度加快，并且解聚速度和HSP27的水平平行［24］。这些都提示HSP27和HSP70发挥作用时在空间上可能存在互补关系。

有研究表明磷酸化的环腺苷酸应答元件结合蛋白（CREB）通过与HSP90 β基因上游的环腺苷酸应答元件结合促进HSP90的热诱导表达，并可能与PKA传导途径有关［25］。本研究未观察到HSP90被紫外线所诱导，这可能与紫外线诱导的时间及紫外线所引起的的生物学效应有关。

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