学文网[摘要] 目的 研究醋酸棉酚（GAA）对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的影响和对人类错配修复基因1（hMLH1）甲基化水平的影响，初步探讨其抗肿瘤机理。方法 应用MTT法检测GAA对Tca8113细胞生长的影响；应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nMSP）检测Tca8113细胞在GAA作用48、72 h后hMLH1基因甲基化状态的改变情况。结果 MTT检测显示，作用24～72 h，GAA对Tca8113细胞生长具有抑制作用；nMSP检测显示，以终浓度30、15 μmol·L-1的GAA作用于Tca8113细胞48、72 h后，hMLH1基因甲基化条带的平均光度值降低，与未经药物处理组比较差异有统计学意义（P
[关键词] Tca8113细胞； 棉酚； 抑癌基因； 甲基化
[中***分类号] R 739.8 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.021
Effects of gossypol acetic acid on the proliferation and methylation level of the human MutL homologue 1 gene in human tongue carcinoma cell line Tca8113 Fu Shuai， Wu Yong， Peng Qingfang， Chen Wenfei. （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650031， China）
[Abstract] Objective This paper aims to study the effects of gossypol acetic acid （GAA） on proliferation and methylation level of human MutL homologue 1 （hMLH1） gene in human tongue cancer cell line Tca8113. Methods The MTT assay was used to determine the effects of the acid on the proliferation inhibition in Tca8113 cells treated with different GAA concen-trations. Nested methylation-specific polymerase chain reaction （nMSP） was used to detect the change in the methylation level of hMLH1 after 48 and 72 h with 30 and 15 μmol·L-1 GAA treatment. Results MTT assay results showed the growth and proliferation inhibition of Tca8113 cells in the experimental GAA group after 24 h to 72 h of GAA treatment. The nMSP results indicated that the average optical density of hMLH1 in the Tca8113 cells significantly changed after the GAA treat-ment （30 μmol·L?1 GAA for 48 h and 15 μmol·L?1 for 72 h） （P
[Key words] Tca8113 cell； gossypol； tumor suppressor gene； methylation
棉酚是从棉籽油里提取的一种成分，曾作为一种男性***药应用于临床。研究[1-2]表明，棉酚还具有抑制肿瘤生长的作用，但其作用机制尚不明确。本实验应用棉酚最常用的药用形式——醋酸棉酚（gossypol acetic acid，GAA）作为研究对象，观察GAA对人舌鳞癌Tca8113细胞的作用，并检测GAA对Tca8113细胞人类错配修复基因1（human MutL ho-mologue 1，hMLH1）甲基化水平的影响，初步探讨其抑制人舌鳞癌细胞的作用机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人舌鳞癌Tca8113细胞株[3]（由昆明医科大学何永文教授课题组惠赠）；GAA、MTT试剂（Sigma公司，美国），RPMI 1640培养液及灭活胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司），细胞基因组提取试剂盒、甲基化修饰试剂盒（北京康为世纪生物有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 Tca8113细胞培养于含10%灭活胎牛血清RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、饱和湿度为5%的CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 GAA对细胞生长作用的影响 调整细胞密度为每毫升5×104～8×104个，置于96孔板中，加入终浓度分别为10、20、40、80 μmol·L-1的GAA后共培养24、48、72 h，每组分别设3个平行复孔，每个时间点实验重复3次，使用常规MTT法进行实验；以常规培养不加GAA的细胞作为对照。倒置显微镜下观察细胞形态变化，并计算GAA作用24、48、72 h的细胞抑制率及IC50值。细胞抑制率（%）=（对照组平均OD值-实验组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。
1.2.3 hMLH1基因甲基化水平检测 应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nested methylation specific polymerase chain reaction，nMSP）检测Tca8113细胞在GAA作用48、72 h后hMLH1基因甲基化水平的改变。收集细胞，提取基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰，纯化DNA。以修饰后的DNA作为模板进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），30 μL反应体系：样品DNA 2 μL，PCR mix 15 μL，上下游引物各1 μL，双蒸水11 μL。引物由北京康为世纪生物有限公司设计合成：5’-TTTTAGGAGTGAAG-GAGGTTA-3’（正向），5’-CCAAAAAAAACAAA-ATAAAAATC-3’（反向），扩增片段为115 bp。
以第1轮PCR产物为模板进行甲基化特异性检测，根据参考文献[4]设计nMSP引物序列。甲基化引物：5’-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3’（正向），5’-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3’（反向），扩增片段为115 bp；非甲基化引物：5’-TTT-TGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3’（正向），
5’-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3’（反向），扩增片段为124 bp。20 μL反应体系：第1轮PCR产物1 μL，PCR mix 10 μL，甲基化、非甲基化引物各1 μL，双蒸水7 μL。
第1次PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，42 ℃退火2 min，65 ℃延伸2 min，反复30个循环，72 ℃延伸5 min，扩增产物4 ℃保存。第2次PCR反应条件为55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，余同第1次。PCR扩增时以等量灭菌ddH2O代替模板DNA作阴性对照。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件包分析数据，并通过HPIAS-1000软件检测基因甲基化条带的平均光度值。各时间点比较采用One-way ANOVA分析，利用Games-Howell法行两两比较，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 GAA对Tca8113细胞增殖的影响
2.1.1 形态学变化 加入不同浓度的GAA后，在倒置显微镜下观察Tca8113细胞，可见细胞体积缩小，细胞质密度增加，细胞膜虽然完整，但与周围的细胞脱离。MTT检测活细胞数减少。且随GAA浓度增高、时间延长，上述现象更加明显（***1）。
2.1.2 GAA对Tca8113细胞抑制率的比较 不同浓度的GAA作用24、48、72 h后Tca8113细胞的抑制率见表1。经One-way ANOVA分析和Games-Howell法两两比较，不同浓度GAA作用24、48、72 h后Tca8113细胞抑制率的差异有统计学意义（P
2.2 GAA对Tca8113细胞IC50值的影响
利用SPSS 13.0统计学软件，运行“Analyze”—“Regression”—“Probit”程序，计算GAA作用于Tca8113细胞不同时间的IC50值：24、48、72 h的IC50值分别为51.06、31.90、14.36 μmol·L-1。从药物浓度配置角度考虑，本实验选择30、15 μmol·L-1作为实验浓度，即30 μmol·L-1GAA处理细胞48 h和15 μmol·L-1 GAA处理细胞72 h。
2.3 GAA对Tca8113细胞hMLH1基因甲基化水平的
影响
将所得的nMSP***像（***2）进行反相处理，通过HPIAS-1000软件检测hMLH1基因甲基化条带的平均光度值，其结果见表2。与未经药物处理组相比，30 μmol·L-1 GAA作用48 h、15 μmol·L-1GAA作用72 h组甲基化条带的平均光度值降低，差异有统计学意义（P
3 讨论
现代肿瘤学理论[5]认为，在肿瘤形成过程中包含两大类机制：一为遗传学机制即DNA结构改变，包括基因缺失、突变等引起基因不表达或表达异常的基因产物；另一个是表观遗传学（epigenetics）机制，即DNA核苷酸序列不变，通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，其中DNA甲基化是最常见的一种DNA修饰，也是研究最多的一种机制。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体将胞嘧啶变为5-甲基胞嘧啶的一种反应，此变化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构。
肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）是生物体内细胞增殖、分化和凋亡过程中的负性调节信号之一，当其作用失活后，细胞的生长分化失控，增加了细胞恶性转化的可能性。正常组织的抑癌基因不发生甲基化，当抑癌基因发生甲基化后，就不能正常转录、翻译合成抑癌蛋白及发挥抑癌作用，细胞就可能发生单克隆增生形成肿瘤。研究[6]表明，抑癌基因启动子区因高甲基化导致其表达沉默在肿瘤的发展进程中起着非常重要的作用，参与许多恶性肿瘤的发生发展。一般认为，DNA甲基化使抑癌基因沉默，而去甲基化使基因活化。与DNA所发生的遗传学变化不同，启动子区的甲基化不涉及DNA序列本身的改变，DNA甲基化具有可逆性，可以被某些去甲基化药物逆转[7]。通过某些药物使启动子区发生高甲基化的抑癌基因去甲基化并恢复表达已成为预防和***肿瘤的新策略[8-9]。迄今为止，研究最多的去甲基化药物是5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）[10]，但由于它毒副作用明显，比如细胞毒性，明显的骨髓抑制和可能导致基因突变等[11]，在临床肿瘤***中的应用受到限制。
棉酚是从棉籽油里提取的一种成分，是一种黄色多元醇类化合物。棉酚具有抑制发生和活动的作用，曾作为男性***药应用于临床。与5-Aza-CdR相比，GAA的毒副作用较小。在用于节育用途而长期服用时，其副作用主要表现为低钾血症，个别***人群生精上皮损伤等，但发生率仅为1%左右[12]；而且长期口服***剂量的棉酚不会引起骨髓抑制[13]。另有报道[14]，棉酚可引起谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高，但对肾脏、心脏、血细胞无明显影响。
已有研究[15]证实，棉酚可通过直接损伤线粒体抑制细胞能量代谢，下调细胞周期调节蛋白的表达，抑制蛋白激酶C的活性，抑制端粒酶的活性，干预信号传导通路以及抑制Bcl-2蛋白的过度表达等途径来抑制肿瘤细胞的生长和诱导肿瘤细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的效果。GAA是棉酚的药用形式，比棉酚稳定。目前在实验和临床研究中广泛应用的GAA的主要成分是左旋棉酚。研究[16]表明，左旋棉酚与其他药物联合使用可增强疗效，如将左旋棉酚与环磷酰胺-多柔比星-长春新碱-泼尼松龙联合应用于***淋巴瘤，其抑制效果好于单独用药。左旋棉酚对其他抗肿瘤药的增强效应，在其他肿瘤实验及临床应用中亦得到证实[17]。Wolter等[18]将头颈部鳞癌细胞接种于裸鼠，观察左旋棉酚的***效果，结果发现：左旋棉酚处理组肿瘤的生长明显受到抑制，病理切片显示肿瘤细胞的有丝***率明显低于对照组，凋亡率高于对照组，这种现象在左旋棉酚停用2周后仍然存在。Hu等[1]报道，棉酚衍生物ApoG2在体外能诱导多种高表达Bcl-2/Bcl-xL的肿瘤细胞的凋亡，还能抑制肝癌、鼻咽癌裸鼠异种移植瘤的生长。
本实验结果表明，加入不同浓度的GAA后，在倒置显微镜下可见Tca8113细胞的形态发生变化，如体积缩小、细胞质密度增加等，且随浓度增高和时间延长，其变化更加明显；MTT法检测可见细胞生长抑制率随GAA浓度及作用时间增加而增加，且在一定剂量范围内具有浓度及时间依赖性。
相关研究[19]表明，以基因启动子甲基化为特征的多种头颈部鳞癌抑制基因表观遗传学改变具有极高的发生率。这些基因包括hMLH1、E-cadherin、细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p16，O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6 methylguanine-DNA methyl-transferase，MGMT）、死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）、视黄酸受体应答子等。本实验选择在头颈部鳞癌中甲基化率较高的hMLH1基因进行研究。
hMLH1基因是一种DNA错配修复基因，其编码的蛋白质是细胞内错配修复系统的重要组成部分，能够纠正DNA复制过程中出现的异常碱基插入、缺失及错配，增强DNA复制准确性，维持基因组稳定性，降低自发性突变的功能。已有研究[20]证实：hMLH1基因的高甲基化在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。本实验通过nMSP检测发现，GAA作用于Tca8113细胞48、72 h后，hMLH1基因的高甲基化状态均出现部分逆转现象，且作用72 h时逆转作用更强，表明GAA能使高甲基化的hMLH1甲基化水平降低。该结果提示：使高甲基化的相关抑癌基因发生去甲基化可能是GAA的抗肿瘤机制之一。本课题组将继续对GAA作用于其他相关基因甲基化水平的改变进行研究。
DNA甲基化以及去甲基化转归的研究为进一步了解肿瘤的各种特性，优化肿瘤的早期诊断，丰富肿瘤的***方式，改善肿瘤的预后提供了新的策略。醋酸棉酚可能成为一种新型抗肿瘤药物，其作用机制仍需要进一步研究。
[参考文献]
[1] Hu ZY， Zhu XF， Zhong ZD， et al. ApoG2， a novel inhibitor of antiapoptotic Bcl-2 family proteins， induces apoptosis and suppresses tumor growth in nasopharyngeal carcinoma xenografts[J]. Int J Cancer， 2008， 123（10）：2418-2429.
[2] Oliver CL， Bauer JA， Wolter KG， et al. In vitro effects of the BH3 mimetic， （-）-gossypol， on head and neck squamous cell carcinoma cells[J]. Clin Cancer Res， 2004， 10（22）：7757-
7763.
[3] 何荣根， 徐秀祺， 张秀丽， 等. 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性[J]. 肿瘤， 1983， 3（3）：97-100.
[4] 任芳， 任凤岩， 波. 在位子宫内膜组织中 hMLH1 基因异常甲基化与卵巢子宫内膜异位症恶变的相关性[J]. 中华妇产科杂志， 2010， 45（4）：302-304.
[5] Chim CS， Liang R， Leung MH， et al. Aberrant gene methy-lation implicated in the progression of monoclonal gammo-pathy of undetermined significance to multiple myeloma
[J]. J Clin Pathol， 2007， 60（1）：104-106.
[6] Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor sup-pressor genes： a booming present， a brighter future[J]. On-cogene， 2002， 21（35）：5427-5440.
[7] Karpf AR， Jones DA. Reactivating the expression of methy-lation silenced genes in human cancer[J]. Oncogene， 2002， 21（35）：5496-5503.
[8] Christman JK. 5-Azacytidine and 5-aza-2’-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation： mechanistic studies and their implications for cancer therapy[J]. Oncogene， 2002， 21（35）：5483-5495.
[9] Egger G， Liang G， Aparicio A， et al. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy[J]. Nature， 2004， 429（6990）：457-463.
[10] Kobatake T， Yano M， Toyooka S， et al. Aberrant methyla-tion of p57KIP2 gene in lung and breast cancers and malig-nant mesotheliomas[J]. Oncol Rep， 2004， 12（5）：1087-1092.
[11] Yang B， Guo M， Herman JG， et al. Aberrant promoter me-thylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellu-lar carcinoma[J]. Am J Pathol， 2003， 163（3）：1101-1107.
[12] Shelley MD， Hartley L， Fish RG， et al. Stereo-specific cyto-toxic effects of gossypol enantiomers and gossypolone in tumour cell lines[J]. Cancer Lett， 1999， 135（2）：171-180.
[13] Oliver CL， Miranda MB， Shangary S， et al. （-）-Gossypol acts directly on the mitochondria to overcome Bcl-2- and Bcl-X（L）-mediated apoptosis resistance[J]. Mol Cancer Ther， 2005， 4（1）：23-31.
[14] Kitada S， Kress CL， Krajewska M， et al. Bcl-2 antagonist apogossypol （NSC736630） displays single-agent activity in Bcl-2-transgenic mice and has superior efficacy with less toxicity compared with gossypol （NSC19048）[J]. Blood， 2008， 111（6）：3211-3219.
[15] Ko CH， Shen SC， Yang LY， et al. Gossypol reduction of tumor growth through ROS-dependent mitochondria path-way in human colorectal carcinoma cells[J]. Int J Cancer， 2007， 121（8）：1670-1679.
[16] Mohammad RM， Wang S， Aboukameel A， et al. Preclinical studies of a nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2 and Bcl-X（L） [（-）-gossypol] against diffuse large cell lym-phoma[J]. Mol Cancer Ther， 2005， 4（1）：13-21.
[17] 巩平， 王于理， 姜玲， 等. 棉酚联合放疗诱导宫颈癌HeLa 细胞凋亡的研究[J]. 肿瘤， 2009， 29（9）：838-841.
[18] Wolter KG， Wang SJ， Henson BS， et al. （-）-Gossypol inhi-bits growth and promotes apoptosis of human head and neck squamous cell carcinoma in vivo[J]. Neoplasia， 2006， 8（3）：
163-172.
[19] Viswanathan M， Tsuchida N， Shanmugam G. Promoter hy-permethylation profile of tumor-associated genes p16， p15，
hMLH1， MGMT and E-cadherin in oral squamous cell car-cinoma[J]. Int J Cancer， 2003， 105（1）：41-46.
[20] Deng G， Peng E， Gum J， et al. Methylation of hMLH1 promo-ter correlates with the gene silencing with a region-specific manner in colorectal cancer[J]. Br J Cancer， 2002， 86（4）：