学文网摘 要：为了解决许多大豆蛋白酶解工艺中，需加碱维持体系的pH值以得到高的水解度，最终会生成大量的盐，而脱盐又是一个高能耗的步骤，对酶解进行研究，提出了用碱性蛋白酶Alcalase和黑曲霉酸性蛋白酶协同水解大豆蛋白的方法。
关键词：大豆蛋白 Alcalase 酶解
一、实验原理
水解蛋白质的反应式。大豆蛋白原料组成：蛋白质含量为91%；水分含量的测定采用常压直接干燥法，测得水分含量为7.35％。
二、Alcalase水解大豆蛋白
1.酶解反应
步骤如下：(1)将大豆蛋白在105℃下干燥至恒重，称取一定量上述原料加入反应釜，按照设计的底物浓度向反应釜中补充适量水。(2)连接反应釜和超级恒温水浴，然后启动磁力搅拌器和超级恒温水浴，使温度为控制温度下。(3)在反应釜上安装pH计电极，在搅拌下以一定方式加入蛋白酶进行水解。(4)在反应过程中不断进行搅拌，并滴加2mol/LNaOH维持pH值不变。(5)水解结束后，水解液经过高温灭活(95℃下加热5min)，在4000r/min的条件下离心10min，取适量上清液供分析用。
酶解效果评价：采用大豆蛋白的水解度指标评价酶水解效果，大豆蛋白水解度（HD）的测定是描述蛋白质水解程度的一个非常重要的量。测得的蛋白质相应含量就可以计算出1克水解大豆蛋白样相应的HD值：
HD=[0.01×V/（3×0.1）-0.33]/7.8
2.pH值定测
利用仪器校正后测量，将每组测取三个数据取平均值。
三、结果与讨论
1.大豆蛋白的酶解
酶解蛋白质通常是在维持体系pH值不变条件下进行的。蛋白质在酶解的过程中pH值一般呈明显的下降趋势，其根本原因是肽键打开后羧基的酸性造成的，可通过向水解液中加NaOH溶液维持pH值不变。
2.单因素水解条件的考察
2.1pH值对水解度的影响
水解条件：酶与底物比45
；底物浓度60g/L；水解时间2h；温度60℃。实验结果如***3-1所示。由***3-1可以看出，水解度随着pH值的增大先升后降，即存在着最佳的pH值， pH值为8.0时水解度最高。
2.2温度对大豆蛋白水解度的影响
水解条件：酶与底物比75
；底物浓度60g/L；水解时间2h；pH值8.0。在pH值为8.0的条件下水解大豆蛋白时，水解度随着温度值的增大先升后降，即存在着最佳的温度，温度为70℃时水解度最高。
2.3酶与底物比对大豆蛋白水解度的影响
水解条件：水解温度60℃；底物浓度60g/L；水解时间2h；pH值8.0。随着酶与底物比的增加，水解度呈上升趋势，但是当酶与底物比达到40 以后，再增加酶与底物比水解度的增加不是非常显著，这可能是因为酶与底物比高于40
以后酶在底物表面的吸附作用己达到饱和。故我们选择酶与底物比为40
。
底物浓度对大豆蛋白水解率的影响。水解条件：水解温度60℃；酶与底物比60 ，pH值8.0；水解时间2h。由***3-4可以看出，在较低的底物浓度时，随着底物浓度增加，蛋白质水解度逐渐增大，但底物浓度增加到一定程度后再继续增加，水解度下降，故Alcalase水解大豆蛋白的最适反应物浓度为50g/L。
3.正交试验确定大豆蛋白的最佳水解条件
考虑到各因素的相互依赖和相互制约，导致对酶解效果的影响，进行正交试验以确定各参数的最佳组合。按正交表L9(34)设计试验，以水解度测定指标，来考查4个因素对水解效果的影响，水解时间为2h。
从正交试验得到的最佳水解条件为：底物浓度50g/L，水解温度70℃，酶与底物比60
，pH值8.0。
在4个因素的极差值中，对于水解度与底物比最大，底物浓度其次，pH值最小，4个因素对水解度影响的大小顺序为：C>D>A>B，即酶加入量>底物浓度>温度>pH；
4.水解时间考查
影响酶解蛋白水解程度的另一重要因素为反应时间，在以上最佳水解条件下，考察了大豆蛋白水解度随时间的变化情况。随着水解时间的延长，水解度不断增加，但当水解时间为4h后，再延长水解时间，水解度增加较慢，所以水解时间可取为4h，此时水解度达到24.6%。
四、结论
本实验是以大豆分离蛋白为原料，以Alcalase水解大豆分离蛋白，研究了水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽时影响水解效果的各种因素：蛋白液的浓度、水解的温度、水解时间、酶的加入量及pH值。在此基础上通过正交试验确定了最佳水解条件：温度70℃，底物浓度50g/L，酶与底物比为60μL/g，pH8.0，水解时间为4h。在此水解条件下，水解液水解度达到了24.6%。
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