学文网摘 要：目的：建立枇杷叶中可溶性多糖的含量测定方法。方法：采用蒽酮―硫酸比色法。结果：显示624nm处有最大吸收峰，线性关系较好(r=0.9999)，平均回收率为99.58%(n=5，RSD=2.85%)，枇杷叶可溶性多糖的含量为8%以上。结论：该方法快速准确、重现性好，可为枇杷叶中水溶液多糖的检测提供参考方法。
关键词：枇杷叶多糖；蒽酮―硫酸比色法；含量测定
中***分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)08-000-00
枇杷叶为蔷薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥叶，在我国已有2200多年的栽培历史。目前已报道枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量测定方法，但是采用蒽酮比色法测定枇杷叶中水溶性多糖含量方法的研究报道较少[1]。本试验探讨了枇杷叶中水溶性多糖的含量测定方法，旨在为今后产业化利用枇杷资源的含量检测提供参考。
1 材料
试验用枇杷叶采自成都中医药大学峨嵋学院植物种植园，由王书林教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥叶。
1.1 试药
无水葡萄糖(AR)、枇杷叶、蒽酮(AR)、硫酸(AR)、无水乙醇。
1.2 主要仪器设备
UV2450紫外-可见分光光度计、R-201旋转蒸发仪、101-2A电热恒温鼓风干燥箱、W201C数控恒温水浴锅、SHB-Ⅲ循环水真空泵、2G 10-2.4A离心机。
2 方法
2.1 样品溶液的制备
将枇杷叶洗涤后于60℃干燥，粉碎备用。精密称取约10g，加水150mL，在80℃回流提取3h[1]，趁热过滤，重复提取一次，合并上述滤液，离心，上清液减压浓缩至约25mL，精密吸取浓缩液10mL，加乙醇调含醇量至含乙醇量为85%，密闭置4℃冰箱中静置过夜。回收乙醇，沉淀用水适量超声溶解，摇匀定容至50mL，精密吸取上述定容液0.5mL用水定容至100mL作为待测液。
2.2 标准液的配制
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.00mg，加蒸馏水100mL，配置成浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液备用。
2.3 蒽酮试液的配制[3]
100mg蒽酮用76%稀硫酸(76mL浓硫酸加入30mL水中)定容到100mL，临用新配。
2.3.1 测定波长的选择
取对照品溶液0.0mL、0.5mL置具塞试管内，分别加水1.0mL、0.5mL，加入新鲜配制的蒽酮试剂5.0mL，立即放入冰水浴中摇匀，置沸水浴中煮10min，取出冷水冲洗2min冷却，静置10min后以首管为空白，在500～700nm处扫描，结果在624±1nm处有最大吸收，因此选择测定波长为624nm。
2.3.2 蒽酮试剂用量的选择
精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0mL，再吸取不同量的蒽酮试剂，立即放入冰水浴中摇匀，置沸水浴中煮10min，取出自来水冲洗2min冷却，静置10min后于624nm处测定，于最大吸收波长处测定吸收度，同法作空白，结果列表1。
2.3.3 水浴温度的选择
精密吸取对照品溶液1mL，蒽酮试剂5.0mL，立即放入冰水浴中摇匀，置不同温度中煮10min，取出自来水冲洗2min冷却，静置10min后于624nm处测定，同法作空白，于最大吸收波长处测定吸收度，结果列表2。
2.3.4 水浴反应时间的选择
精密吸取葡萄糖标准溶液1.0mL，蒽酮试剂5.0mL，立即放入冰水浴中摇匀，置沸水浴中煮不同时间，取出自来水冲洗2min冷却，静置10min后于624nm处测定，取出，同法作空白，于最大吸收波长处测定吸收度，结果列表3。
2.3.5 静置时间的选择
精密吸取葡萄糖标准溶液1.0mL，蒽酮试剂5.0mL，立即放入冰水浴中摇匀，置沸水浴中煮10min，取出自来水冲洗2min冷却，静置不同时间后于624nm处测定，取出，同法作空白，于最大吸收波长处测定吸收度，结果列表4。
由吸收值可知，当静置时间为10min后，吸收值趋于稳定，故选择静置时间为10min。
综上结果可知，最佳的试验条件为：蒽酮试剂的用量为5.0mL、反应温度为100℃、水浴时间为10min、静置时间为10min。
2.4 标准曲线的绘制
精密吸取标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于25mL容量瓶中，加蒸馏水定溶摇匀，再分别吸取各浓度葡萄糖溶液1mL，加入5mL蒽酮试液，立即放入冰水浴中摇匀后，置沸水浴中煮10min，取出自来水冲洗2min冷却，静置10min后于624nm处开始测定，以蒸馏水1.0mL同上法作空白对照。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，做回归处理，得回归方程为y=5.8839x+0.0015，相关系数R2=0.999，葡萄糖在0.02～0.12mg范围内，与吸收度呈良好的线性关系。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度实验
精确量取样品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮试液，按标准曲线项下操作，同法作空白对照，分别测定其吸光度值(A)，结果显示：RSD=2.88%
2.5.2 稳定性实验
精确量取样品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮试液，按标准曲线项下操作，同法作空白对照，分别测定其吸光度值(A)，结果显示：RSD=1.12%
2.5.3 重现性实验
精确量取样品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮试液，按标准曲线项下操作，同法作空白对照，分别测定其吸光度值(A)，结果显示：RSD=2.91%
2.5.4 回收率实验
分别精确量取1mL已知多糖含量样品液(4份)，每份加0.3mL葡萄糖储备液(1mg/mL)，摇匀，移至I0mL容量瓶中定溶作待测液，分别精确量取1mL待测液，按标准曲线项下操作，分别测定其吸光度值(A)，结果显示：本方法的加样平均回收率为99.58%，RSD=2.85%
2.6 样品液的测定
精确量取样品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮试液，按标准曲线项下操作，同法作空白对照，测定其吸光度值，代入曲线方程，计算出供试品中可溶性多糖的含量，结果为8.56%。
3 讨论
葸酮一硫酸法，其原理是糖类遇硫酸后脱水生成糖醛或其衍生物，再与蒽酮试剂发生缩合反应生成有绿色的络合物，颜色的深浅与糖的含量有关[2]。葸酮一硫酸法在显色30min后，吸收值趋于稳定，时间约2h，该法稳定、可靠。但蒽酮试剂要新鲜配制，时间过长，显色后颜色加深，测定结果增大。采用过夜的蒽酮试剂，葡萄糖在500nm处也出现最大吸收，但在低浓度时，最大吸收峰不明显，重现性差。
从测定结果发现，枇杷叶中可溶性多糖的含量较高，可回收提取利用，这有利于中药资源的综合利用，蒽酮-硫酸比色法可供枇杷叶中水溶液多糖的检测提供参考方法。
参考文献：
[1] 江帆.枇杷叶中水溶性多糖的提取工艺研究[J].福建果树，2005(4)：135.
[2] 张纯.改良蒽酮比色法测定牛膝多糖的含量[J].中华临床医药，2003，4(19)：17.
[3] 张志良.植物生理学试验指导[M].北京：高等教育出版社，1997：127.
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