学文网摘要：RNAi能够抑制基因特异序列的表达，为昆虫学的研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害虫种群以及减少疾病病原体的感染。昆虫RNAi的相关文献发现不同的种群、RNAi的摄入方式、靶标基因都会影响RNAi的效率，这也是转录本抑制程度存在差异的原因所在。对于那些不能稳定转基因的物种，如昆虫，利用dsRNA介导的RNAi技术是快速分析基因功能的重要手段。
关键词：RNAi；害虫控制；dsRNA
中***分类号：S476.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1006-03
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.06.002
Abstract： RNA interference（RNAi）， the sequence-specific suppression of gene expression， offers great opportunities for insect science， especially to analyze gene function， manage pest populations， and reduce disease pathogens. The accumulating body of literature on insect RNAi has revealed that the efficiency of RNAi varies between different species， the mode of RNAi delivery， and the genes being targeted. There is also variation in the duration of transcript suppression. Double-stranded RNA（dsRNA） mediated RNAi has emerged as one of the most powerful strategies for the rapid analysis of gene function，particularly in organisms for which stable transgenesis is not available，such as insects.
Key words： RNAi； insect pest control； dsRNA
RNA干扰（RNA interference，RNAi）已经彻底改变了昆虫学研究的范围，因为它使研究者能够抑制目的基因的表达，从而将改变的表型和基因功能联系起来。对于基础研究而言，RNAi为所有的昆虫基因组学研究提供了一条路径，同时对应用昆虫学也有巨大的潜在作用。例如，RNAi能够通过抑制关键基因提高死亡率来控制害虫。此外，利用无害的病毒序列来启动抗病毒RNAi反应，能够有效防止益虫（如蜜蜂和家蚕）感染高致病性病毒。
1 RNAi的机制
RNAi是利用非编码的小RNA分子切割靶标mRNA来抑制基因的表达。主要分为以下3个阶段。
1）起始阶段。核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以ATP依赖的方式，逐步切割加工导入生物体的外源或内源性转录生成的dsRNA，生成21～23 nt的siRNA（small interfering RNA），其与靶标mRNA具有高度特异性，为成功降解提供保证。
2）效应阶段。siRNA双链结合其他蛋白复合物形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex RISC），p链siRNA解链，RISC介导单链反义siRNA通过碱基配对原则从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，进一步降解mRNA，同时还可以引发宿主细胞的一系列反应。
3）放大效应阶段。siRNA在引导RISC切割靶RNA的同时，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA为模板合成新的dsRNA。紧接着进入第一阶段循环过程生成大量次级的siRNA，经过逐级放大效应，使mRNA彻底降解。
2 利用RNAi控制害虫群体
利用RNAi技术控制害虫和保护驯化的益虫（例如蜜蜂）已经得到广泛应用。一般情况下，RNAi序列适用于任何形式，从单个基因型到家系甚至昆虫所属的目。
2.1 利用RNAi控制害虫
利用RNAi控制害虫最早应用于玉米根虫[1]和棉铃虫[2]。研究者喂养玉米根虫含有290条dsRNAs的人工饲料，其中发现14个基因会使成虫的生理活动下降，并且对液泡ATP酶亚基A基因（V-ATPase）进行了详细的分析。人工饲料中只含有低浓度的V-ATPase的dsRNAs，经玉米根虫取食后，相应的mRNA也会受到抑制。更重要的是，研究者将玉米根虫喂养在表达V-ATPase dsRNAs的转基因玉米上后，发现根虫的V-ATPase基因表达量下降，玉米根部受损程度降低。研究者发现棉铃虫有一个靶标基因细胞色素P450（CYP6AE1），该基因在幼虫中肠中表达，对棉花的二级次生代谢产物棉子酚具有解毒功能。当将棉铃虫喂养在表达CYP6AE14-dsRNA的转基因拟南芥和烟草上时，该基因在虫体中肠里的表达量下降，幼虫生长发育减速[3]。同时玉米根虫和棉铃虫也都有了新的研究发现。其中Snf7基因主要参与膜受体的运输，在玉米根虫中的效果非常显著[4]。同时在棉花中表达半胱氨酸蛋白酶后，棉铃虫取食转基因植株后，虫体围食膜的功能减弱，变得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同时表达dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比单一表达其中一个基因的抗性要强[5]。
上述研究阐明了利用RNAi控制害虫有两个关键因素：①用于RNAi靶标基因序列的选择。②传递dsRNA的方式。其中靶标基因必须是昆虫的关键基因，同时在昆虫的整个生活史中要持续表达。随着技术从理论证明到应用的转变，严苛设计靶标序列是必须的。先决条件就是从dsRNA中获得的21～25 bp siRNAs必须与序列保证完全的一致性，同时还要与昆虫的mRNA具有同源性。并且还要与非靶标物种的所有siRNAs和编码蛋白基因具有序列差异性。这些比对都可以在网上进行，将候选的dsRNA同时与靶标物种的目的基因及所有公共基因组中预测的编码蛋白的基因进行比对。要杜绝不能与靶标序列完全匹配的siRNAs以及与非靶标物种序列匹配的siRNAs。
RNAi成功的第二个关键就是在有效剂量下传递放大RNAi的信号，最好还能节约成本。目前dsRNA的合成方法已有重大突破，一次能够合成1 kg左右，因此合成成本的持续下降将有利于将dsRNA产品应用于鱼饵、生物农药喷雾以及灌溉系统中[6]。利用植物介导的RNAi已经广泛应用于咀嚼式昆虫（例如玉米根虫和棉铃虫）和刺吸式昆虫中。BT抗虫转基因作物控制刺吸式昆虫的作用甚微，因为BT类毒素尚未对这些昆虫产生作用[7]。由于生态释放导致广谱杀虫剂的使用逐渐减少，BT作物上的害虫却逐年增加。因此利用植物介导的RNAi解决了这个难题，例如在褐飞虱[8]和蚜虫[9]中都得到了应用。这种方法可以代替传统杀虫剂。例如可以作为城市害虫（如蚂蚁、蟑螂、白蚁）的杀虫饵剂[10]。这一方法的商业潜力主要取决于dsRNA传递给靶标昆虫的效率，dsRNA是否在昆虫体内能稳定存在，作为杀虫饵剂的浓度，上诉因素都会影响dsRNA的生产成本。因此加强昆虫细胞吸收dsRNA和保证dsRNA在昆虫体内不被dsRNases降解掉至关重要。
2.2 利用RNAi保护益虫
许多真核寄生虫对RNAi敏感，可以利用这一点来增强益虫的健康。当然这个策略不适用于细菌性病原体或某些真核生物（如锥和疟原虫物种），它们缺乏RNAi的能力。最典的例子就是蜜蜂的寄生虫疾病，疾病会导致蜜蜂高发病率和高死亡率。蜜蜂的寄生虫具备应用RNAi的两个要点：①它具有RNAi的分子机制；②中肠作为摄取dsRNA的场所，寄生虫能够在蜜蜂中肠上繁殖。蜜蜂寄生虫的ADP/ATP转运子对于它的能量代谢是至关重要的，当感染疾病的蜜蜂取食了含有寄生虫的ADP/ATP转运子的dsRNA后，寄生虫的靶标基因表达量下降，蜜蜂的死亡率会随之下降[11]。
真核寄生虫除了能够利用肠道作为传递RNAi的场所，还可以利用昆虫器官来传递系统性RNAi信号。这已经在以蜜蜂血液为食的寄生虫瓦螨中得到证实[12]。当蜜蜂取食了瓦螨特定基因的dsRNA之后，寄居在蜜蜂上的螨虫群体明显减少，同时对蜜蜂也没有明显的有害影响。随后，研究者利用荧光蛋白的dsRNA（dsRNA-GFP）来检测蜜蜂体内是否能够进行系统性RNAi。因为蜜蜂和寄生虫体内都没有绿色荧光蛋白基因，所以可以利用GFP-RNA来检测干扰的效果。当感染寄生虫的蜜蜂取食含有dsRNA-GFP的蔗糖溶液后，寄生虫全身覆盖GFP-RNA。除此以外，将这些寄生虫转移到没有取食dsRNA-GFP的蜜蜂上，蜜蜂体内会含有GFP-RNA。这些试验说明RNAi信号不仅可以在昆虫个体水平进行传播和放大，同时还可以在蜜蜂繁殖群体水平进行传播。下一步需要研究如何使RNAi的效率和剂量都能持续保护益虫群体，同时用这种方法控制寄生虫的成本是否合理，以及对蜜蜂群体的健康是否有害都需要加以考虑。
利用RNAi抗病毒保护昆虫，同时也可以利用RNAi进行抗病毒***。利用RNAi介导来抑制昆虫感染病毒，同时还可以预防一些人类、牲畜和农作物的严重病毒性疾病。外源提供和摄取的dsRNA可以提高宿主本身RNAi运转效率，保护宿主包括预防和直接***。RNAi介导的抗病毒免***有利于抑制蚊子的登革热病毒、辛德毕斯病毒和西尼罗河病毒等。此外，加强RNAi通路能够促进病毒抑制，例如通过基因工程使昆虫体内表达特定病毒序列的反向重复RNA，从而促发dsRNA的生成。
蜜蜂是另一个遭病毒侵袭急需被保护的昆虫，其中色列急性***病毒（IAPV）可能导致蜜蜂种群持续下降和群落消失的危险[13]。科学家通过体外合成IAPV基因组的dsRNA，感染IAPV的蜜蜂取食外源合成的dsRNA后，蜜蜂体内的RNAi工厂机制可以消除IAPV[14]。实验室和蜂场试验表明，在接种IAPV以前饲喂特异RNA的IAPV，与只接种IAPV比较，其幼虫孵化率和产蜜量均明显高于只接种IAPV的蜂群。此结果已经在美国进行了大量的田间试验。2007年夏季，Beeologics公司成立了一个研究小组，开始研制一种***这种病毒的制剂，研发出杀死IAPV的药物名为Remebee，是采用核糖核酸干扰机制（RANi又称基因沉默）阻止目的基因表达。Remebee是以RANi为基础，理论上RANi这种生物制剂能促使RANi发生。
RNAi抗病毒效应也成功应用于节肢动物对虾中，用于控制疾病。由病毒引起的疾病会导致虾产业经济产生毁灭性的损失，每年因传染性疾病导致养殖虾产业损失上亿美元。破坏性最强的病毒为白斑综合征病毒WSSV和传染性肌坏死病毒IMNV，病毒包括单链和双链RNA病毒以及DNA病毒[15]。对虾IMNV***苗具有长期和高特异保护的抗病毒能力。例如，针对IMNV的基因组开放阅读框的5’端设计dsRNA***苗可以保护对虾52 d不受病毒感染。现在最关键的问题是如何给池塘里成千上万的对虾注射dsRNA***苗，这是研究者后续需要解决的问题。
3 展望
近十年对昆虫RNAi的研究展示了科学发现的伟大力量和控制昆虫种群的潜力。随着科学技术的不断发展，RNAi也已经不再是灵丹妙药，但却提出了一系列新的概念，给昆虫学家提出了新的技术挑战，因为没有一种技术是适用于所有物种的。同时RNAi信号是如何在单个细胞里放大和在昆虫细胞间传播的也始终困扰着科学家。因此，昆虫RNAi是如何运转的仍然需要坚持不懈的研究。
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