学文网摘要：伴随化学科学的不断发展，我国在叶绿素含量研究方面取得了显著的进展，本文通过使用韭菜叶作为实验样品，用石油醚和无水乙醇（3：2）的混合试剂和薄层层析法从中分离提取叶绿素，用SPECORD® 50 PLUS型双光束分光光度计测定样品中叶绿素a、b含量并进行相关计算。
关键词：叶绿素a叶绿素b含量测定试验
中***分类号：TE08文献标识码： A
一、叶绿素的概念
叶绿素是一类与光合作用有关的最重要的色素。光合作用是通过合成一些有机化合物将光能转变为化学能的过程。叶绿素实际上存在于所有能营造光合作用的生物体，包括绿色植物、原核的蓝绿藻（蓝菌）和真核的藻类。叶绿素从光中吸收能量，然后能量被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。
二、实验材料和方法
1、实验材料
使用韭菜叶片作为实验材料，测定其叶绿素含量，样品购自菜市场，仪器使用SPECORD® 50 PLUS型双光束分光光度计、高速电动匀浆机和电子天平。
药品：无水乙醇、石油醚、聚四氯乙烯、蒸馏水、丙酮（80%）、叶绿素a和叶绿素b标准品；用具：锥形瓶、超声波水浴锅。
2、实验方法
（1）叶绿素提取
提取前先进行提取试剂的优化选择，使用乙醇、丙酮和石油醚、异辛烷、正庚烷配制成2∶3的混合溶液。从中选择出提取叶绿素含量最高的配比溶剂进行最终提取。叶绿素含量根据朗伯.比尔定律进行计算，叶绿素含量测定结果用mg/kg表示，使用如下公式：w=(k x A校正 x V)/ m x l,其中A校正=A665-(A705+A625)/2，w为样品中叶绿素含量单位为mg/kg；A665为最大吸收665nm的吸收值；A705为70 5 nm附近峰谷的吸收值；A625为625nm附近峰谷的吸收值；k为吸光常数取值13；l为光程，指石英杯的厚度，单位为cm；m为试样质量数值，单位为g；V是提取试剂的体积，单位是ml。
称量定量切碎韭菜样品放入锥形瓶内，加入乙醇和石油醚混合浸提液（2：3，以上结果证明该配比提取含量最高），使用聚四氟乙烯密封带将瓶口密封，避免混合液挥发。将锥形瓶置于超声水浴中超声10min，收集浸提液。将浸提液加入等体积的蒸馏水后静置分层后取石油醚溶液置于阴暗处保存。使用薄层层析法分离叶绿素a和叶绿素b。
（2）叶绿素含量测定使用丙酮（80%）提取层析后分离的叶绿素a、b，用分光光度法进行测定。使用同样的方法处理叶绿素标准品。计算样品和标准品叶绿素a、叶绿素b的相对比值，测定操作重复3次。
二、结果
1、提取试剂优化选择结果
我们的实验结果显示叶绿素提取含量从高到低依次为：石油醚+无水乙醇>正庚烷+无水乙醇>异辛烷+无水乙醇>丙酮+无水乙醇>丙酮>无水乙醇，可见石油醚+无水乙醇的组合提取效果最好，见表1。
2、波长偏移对叶绿素含量和比值的影响用丙酮叶绿素提取物作为样品，使用双光束分光光度计测定其含量，结果发现当波长偏差
Chl a/ Chl b的比值明显受到波长偏移的影响，偏移量为8.6%～14.8%，波长偏移2nm时，红移引起的比值变化（13.5%）明显比蓝移引起的比值变化（14.8%）大，见表3。
三、讨论
叶绿素位于植物的类囊体膜中，可以吸收大部分的红光和紫光并反射绿光，因而呈现绿色。叶绿素属于镁卟啉化合物，根据其化学结构可以分为叶绿素a、b、c、d、原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素是一类不稳定的化合物，在光、氧气、氧化剂、酸碱存在的情况下会发生分解。比如，在酸性环境中，叶绿素分子容易失去卟啉环中的镁原子变为去镁叶绿素。叶绿素在人体中具有造血、解毒、提供维生素等多种功效。叶绿素的可见光吸收光谱显示在蓝光和红光处均有明显的吸收峰。该吸收峰的位置和消光值在不同的叶绿素中存在差异。一般而言，叶绿素a的最大吸收光波长介于420～663nm，叶绿素b 的最大吸收波长介于460～645nm。叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。
它们含量之比约为3∶1。叶绿素分子主要由卟啉环和叶醇构成，卟啉环包含4个吡咯环，4个甲烯基和1个镁原子。镁原子位于卟啉环的中心，叶醇含有1个羰基和羧基属于副环，通过酯键和吡咯环侧键上的丙酸相结合。
叶绿素a和叶绿素b在结构上的差别仅在于第二个吡咯环上的一个甲基被一个醛基所取代。叶绿素分子的卟啉环由4个吡咯环通过甲烯基连接成为一个大环，环中心的镁离子呈正电荷，而周围的氮原子呈负电荷，因此具有较强的极性和亲水性。而叶醇基由4个异戊二烯基组成，属于长链状的碳氢化合物，具有较强的亲脂性。
如果叶绿素分子位于叶绿体膜时，会与膜蛋白相作用而使吸收波长发生变化。经过贮藏和加工，叶绿素会产生几种重要的衍生物，如脱镁叶绿素就是叶绿素中心的镁离子被2个质子取代而成，呈橄榄绿，属于脂溶化合物。焦脱镁叶绿素是脱镁叶绿素脱去甲酯基而形成，同时环上的酮基转化为烯醇，颜色较暗。脱镁脱植叶绿素是不包含镁离子和植醇的叶绿素，溶于水，呈橄榄绿色。焦脱镁脱植叶绿素比焦脱镁叶绿素颜色更为暗淡，溶于水。叶绿素中的镁离子被铁、钴、铜等离子取代时会产生叶绿素衍生物，叶绿素衍生物对酸、光、热的稳定性明显提高，因而性质较为稳定。
从植物中提取叶绿素有多种方法，比较常见的包括一下几种。第一，溶剂研磨法，这种方法的特点是操作简单、提取效果较好。将待检样品浸泡在提取溶剂中，再放入研磨器上研磨，叶绿素溶出后使用滤纸过滤萃取液即可。第二，溶剂浸泡法，这种方法将待检样品浸泡在提取溶剂中过夜，优点是提取效果较好，但是耗时较长，而且提取物杂质较多。第三，溶剂抽滤法，将待测品放入抽滤装置内，加入提取溶液后抽滤，此法提取效果良好，耗时较长。第四，超声波提
取，频率一定的超声波可以产生纵向振动，进而对物质产生高速冲击，可以有效破坏物质的细胞结构，使溶剂可以渗入细胞内部。
此法可以明显提高有效物质的溶出率并且不改变有效物质的结构，提取时间较短，提取率较高。在本次研究中我们就采用这种方法，效果良好。此外微波辅助提取技术和固相微萃取技术也是常见的叶绿素提取方法。对于提取溶剂的选择，一般认为混合溶剂的提取效果较好，研究报道叶绿素提取液中水分含量会对叶绿素含量测定和稳定性产生较大影响。水分较多时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b的比值会明显下降，说明溶剂中水分含量过多对叶绿素的提取不利。
叶绿素含量测定方法主要包括紫外分光光度法、荧光分析法、高效液相色谱法、活体叶绿素仪法等。目前较为常用的方法是分光光度法。该法将包含叶绿素的提取液和空白混合液对照，进行光密度测定，一般在300～700nm的波长范围内扫描吸收广谱。通过吸光度值的计算对叶绿素进行定性和定量分析。这种方法的优点是操作简单，耗时短。
叶绿素的含量变化和植物生长环境和发育情况密切相关，其含量和比值也会随实验仪器、试剂等不同而产生较大差异。我们的实验发现使用双光束分光光度计测定韭菜叶绿素的Chl a/Chl b比值，结果和理论值比较接近，且叶绿素定量结果间的重复性较好。我们还发现叶绿素b受波长偏移的影响较大，在波长偏移
量较大时，红移引发的Chl a/Chl b比值变化明显大于蓝移引发的比值变化。由此可见，在进行叶绿素含量测定时选用波长精度、重现性较好且具有波长校准和定位功能的分光光度计可以获得比较精确的结果。
参考文献：
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