学文网【摘要】 目的 探讨人源树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用。方法 培养体系中加入rhGM CSFrhIL 4rhTNF α等细胞因子诱导人骨髓来源树突状细胞,并与原代培养的人肺癌细胞融合;以融合细胞诱导外周血产生CTL并测定其细胞毒性。 结果 骨髓单个核细胞在rhGM CSFrhIL 4rhTNF α等细胞因子存在下培养10～12 d,出现典型的成熟树突状细胞。体外诱导的人骨髓来源树突状细胞(DC)表达较高水平HLA DR、CD86。对照DC和肿瘤细胞表达相应检测的单种抗原,而融合细胞两种抗原的表达水平均较高。 DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用。结论 通过本课题的研究证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤***苗代表一类更为有效的抗肿瘤免***策略。
【关键词】 树突状细胞;细胞融合;肺癌;***苗
树突状细胞(DC)是目前鉴定的最有效的抗原递呈细胞(APC),自1973年首次识别DC以来,对DC的研究不断深入。DC独特的形态、高表达抗原递呈分子及介导T细胞连接、共刺激的辅助分子等生物学特性决定其在免***学中的重要作用[1]。人类肿瘤表达大量能被T细胞识别的蛋白质抗原,为癌症免******提供靶位,但大多数人类肿瘤为弱免***源性,能逃避宿主免***系统。抗原递呈途径的改变为肿瘤特异性抗原不能向宿主递呈的原因之一。为此改变、促进机体免***系统对肿瘤抗原的递呈是肿瘤免******中具有实用价值的研究方向。鉴于DC在抗原递呈中的重要作用,以其为基础设计的肿瘤***苗日益受到重视。本研究在诱导人骨髓来源树突状细胞的基础上,探讨了树突状细胞/肿瘤细胞融合特异性抗肺癌免***研究。
1 材料和方法
1.1 骨髓 共6例,取自中日联谊医院胸外科肺癌患者手术中切下的肋骨,骨髓病理检查证实均无癌骨髓转移灶,为正常骨髓象。肺癌标本:共6例,取自上述患者手术标本,均经病理检查确诊。外周血:上述6例患者外周血。
1.2 主要试剂 IMEM培养基、胎牛血清、FITC标记抗CD86、HLA DR McAb、 PE标记抗CA 199 McAb、淋巴细胞分离液、rhGM CSF、rhIL 4、rhTNF α、 PEG 4000、3H TdR等。
1.3 人骨髓树突状细胞的诱导及鉴定 体外诱导:无菌取手术患者术中切下的肋骨,除去上面附着的软组织,用PBS冲洗,再用骨钳切为约3～4 cm长,从一端插入事先吸入培养液的注射器,冲洗骨髓腔,冲洗数次,用200目铜网过滤,淋巴细胞分离液(70%)分离单个核细胞,PBS洗两次,用15%DMEM配制成2×105/ml单细胞悬液,培养于37°,培养体系中加入人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM CSF)和白介素 4(rhIL 4)诱导骨髓单个核细胞在体外产生树突状细胞。
1.4 DC表型分析 收集培养10 d的DC与抗体CD86、HLA DR作免***荧光染色及FACS分析。
1.5 人肺癌细胞的原代培养 选取6例中日联谊医院住院手术肺癌患者的手术标本,均经病理确诊。无菌取下肿瘤组织后,机械剪碎,用0.25%胰蛋白酶消化后5 h,收集单个细胞,DMEM洗2次,培养于15%DMEM中;经组织学染色观察肿瘤细胞形态学特征。
1.6 人骨髓DC与人肺癌细胞融合及鉴定 用50%聚乙二醇(PEC)4000 融合DC与原代培养的肺癌细胞,DC与肿瘤细胞的比例为6:1,PBS洗涤后,融合细胞培养在含15%FCS的DMEM培养液中,培养体系中含GM CSF(4ng/ml)。通过以FICT 抗HLA DR、CD86抗体标记DC,测定HLA DR、CD86表达水平。选取一株CA199阳性表达的细胞DC/肿瘤细胞融合细胞,以PE 抗CA199和FICT 抗CD86进行双标记,同时以DC和肿瘤细胞作对照,检测DC与肿瘤细胞的融合效力。
1.7 CTL的产生及细胞毒性的测定 以20,000rad剂量照射DC单独(1.7×106/鼠)、肿瘤细胞单独(B16或3LL)(3×105/鼠)、DC单独、DC与肿瘤细胞同时加入、抗原肽刺激DC、DC/肿瘤细胞融合瘤苗后,上述细胞再与同源PBMC共同培养3 d,而后与原代培养细胞共同培养5 d,掺入3H TdR18 h后,收集细胞,测定放射性核素闪烁记数值。
2 实验结果
2.1 树突状细胞的诱导 在培养的前7 d,无明显细胞集聚体出现,加入GM CSF、TNF α继续培养3～5 d,出现典型的成熟树突状细胞,见***1。
***1 人骨髓来源的树突状细胞的形态学观察(200×)
2.2 肺癌细胞的原代培养 如***2所示,6例原代培养肺癌细胞均呈上皮型,细胞形态多样,多呈多角型,核:浆比例增加,核深染。
***2原代培养肺癌细胞(瑞氏染色)
2.3 人骨髓DC/肺癌细胞融合诱导的CTL的细胞毒性 见表1。结果表明DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用;以抗原肽刺激DC或DC/肺癌细胞同时加入诱导CTL的培养体系,亦诱导出一定的CTL活性,但其对靶细胞的杀伤效力显著低于融合瘤苗诱导的CTL。
表1
人DC融合***苗的体外诱导杀伤作用
体外诱导CTL条件杀伤率(%)(x±s,D)
E:TE:TP值
10:120:1
DMEM1.1±0.70.5±0.4
DC单独2.3±1.2 2.7±1.3
肺癌细胞单独 3.0±0.8 0.9±0.8
DC/肺癌细胞同时加入14.1±6.7** 20.8±6.9**
以抗原肽刺激DC33.1±8.3**41.6±9.7**
DC/肺癌细胞融合66.8±7.9***83.1±5.5***
*
注:**第四组、第五组分别与前三组比较;***第六组与前三组比较;*第六组与第四、第五组比较
3 讨论
DC在抗原递呈中发挥重要作用,以其为基础设计的肿瘤***苗日益受到重视。以肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞RNA等体外冲击或将TAA基因转染到DC内,均被认为是颇有前途的***苗制备方案[2]。但这些体外冲击手段均具有半衰期短等缺点。DC与肿瘤细胞融合具有以下优点:融合细胞使天然抗原性肿瘤蛋白递呈到细胞表面的MHC 肽复合物中、在体内可产生相对稳定、持续的抗原加工和递呈、完整的肿瘤细胞与DC的融合使多种未知、未鉴定的肿瘤抗原共同参与免***宿主。
国内外有关DC/肿瘤细胞融合***苗的构建的相关研究主要局限在动物实验水平,如DC与肥大细胞瘤细胞[3]、肾细胞癌融合等,但在2004年后半年以来,国外此方面的报道增多,如美国的最新一篇报道中介绍了人源DC/***癌、卵巢癌细胞融合***苗的实验研究[4 6]。但到目前为止尚未见有关人源DC/自体肺癌细胞融合***苗的报道。国内人源DC/肿瘤细胞融合***苗的研究只是局限于正常人外周血来源DC,所应用的肿瘤细胞均为细胞系,未能为发展个体化瘤苗提供一定理论依据[7 9]。
本研究结果表明DC/肺癌细胞融合在体外对靶细胞产生较强的细胞毒作用,其CTL活性显著高于以抗原肽刺激DC或DC/肺癌细胞同时加入培养体系诱导CTL。本研究结果作为DC融合瘤苗的个体化***的初步探索性工作,将为其进一步广泛应用奠定实验基础。
本研究进一步证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤***苗代表一类更为有效的抗肿瘤免***策略。我们推测DC融合瘤苗在荷瘤个体肿瘤的综合***、预防肿瘤术后复发、转移等领域具有广阔的应用前景。
尽管有关DC融合瘤苗的研究取得一定进展,但几乎所有研究均集中在DC融合瘤苗的抗肿瘤作用及其机制等研究方面,由于DC与肿瘤抗原融合后递呈的抗原成分极其复杂,应用于机体也可能引起免***系统其他复杂变化,因此在今后的研究中需对DC融合瘤苗的可能副作用进行深入、广泛的探讨。
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