学文网摘要：目的 通过建立23-plex Y-SNPs遗传标记复合扩增检测体系，研究该检测体系在法医学中的应用价值。方法 选择Y染色体单体群命名上的23个Y-SNPs位点，建立23-plex Y-SNPs复合PCR扩增体系，利用荧光标记单碱基延伸技术和毛细管电泳检测技术对单核苷酸多态性进行检测，调查290名重庆地区汉族无亲缘关系的男性个体。结果 23个Y-SNPs位点均具有遗传多态性，每个位点基因的多样性范围为0.0137～0.4912。检测的290名男性个体中有11种单体群、143种单倍型，其单倍型多样性为0.9907。结论 23-plex Y-SNPs遗传标记复合扩增检测体系能灵敏快速准确地检测样本，在法医学研究中有较高的应用价值。
关键词：Y染色体；单核苷酸多态性；复合PCR扩增检测体系；法医学应用
Y染色体具有男性伴性遗传特性，呈单倍型向下遗传，在减数***中不发生重组，一般由父亲直接传给儿子。在个人识别方面，由于Y染色体SNPs非随机分布于人群中，其种群的地域性特异明显，所以可以用于案件中生物学所属群体的推断。尤其在案、案中分析男女DNA混合物时，Y染色体遗传标记扩增分型技术对单倍型检测结果的获得不受女性成分影响，具有其他遗传标记所没有的明显优势。因此，23-plex Y-SNPs遗传标记复合扩增检测体系在法医学上具有潜在的特殊价值。
1 材料与方法
1.1主要实验仪器 ①PCR扩增仪：480型、9600型、9700型（Applied Biosystem，美国）；②定量PCR仪：ABI PRI***7500（Applied Biosystem，美国）；③电脉仪：Bio-RAD公司（美国）；④DNA全自动遗传分析仪：Prism 310、Prism 3130-XL（Applied Biosystem，美国）；⑤高速台式离心机：ZKl5、ZK3（Sigma，美国）；⑥超纯水仪：Millipore（法国）。
1.2主要实验试剂 ①SNaPshot试剂盒（Applied Biosystem，美国）；②ExoSAP-IT（USB公司，美国）；③虾碱性磷酸酶SAP（Amersham公司，美国）；④dNTPs混合物（Fermentas，MBI公司，立陶宛）；⑤Amp FL STR Profiler YfilerTM试剂盒（Applied Biosystem，美国）；⑥Quantifiler human DNA quantification试剂盒（Applied Biosystem，美国）。
1.3实验样本及其DNA的提取和定量 在***物证鉴定中心随机抽取290名广东地区汉族无亲缘关系的男性个体，使用采血卡或中性滤纸收集他们的指尖血，编号1-290，采用DNAIQTM（Promega公司，美国）试剂盒进行DNA提取，并且采用Quantifiler TM试剂盒（Applied Biosystem，美国）在ABI PRI***7500定量PCR仪上进行定量，4℃妥善保存，以备Y-SNPs扩增体系的建立和PCR反应条件的优化。
1.4 Y-SNPs遗传标记复合扩增体系的建立
1.4.1 Y-SNPs位点的选择 根据Y染色体命名协会的***补充材料，参考Y-SNPs信息的***网站和dbSNP数据库信息，在亚洲人群中筛选出多态性较高的单体群以及对应的23个Y-SNPs位点：P164、P203、P148、P145、M89、P151、M216、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M1ll、M9、P132、P200、P197、M119、P136和M134。其中，Ml1l是2 bp缺失，M134是l bp缺失突变，M199是1 bp插入，剩下20个位点均为碱基的转换或颠换。
1.4.2 Y-SNPs位点PCR引物设计与验证 以NCBI dbSNP数据库和Genbank中的Y染色体序列筛选的位点及其邻近序列为模板，参照引物设计的一般原则，使用Primer Premier 5.0软件自行设计并使用Oligo 6.0软件进行分析优化。引物合成后，采用基于局部比对搜索工具（BLAST）快速地对比分析它的高特异性。
1.4.3单个Y-SNPs位点PCR扩增体系的建立 单位点PCR扩增体系的建立。1个男性DNA样本定量后，分别对23个Y-SNPs位点引物进行单独扩增，建立每个SNP位点均适用的PCR扩增体系。PCR反应体系为25μL，PCR反应条件为：95℃11min，95℃30s、55℃30s、72℃30s，循环35次，最后延伸为72℃10min。
1.4.4 23个Y-SNPs位点复合PCR扩增体系的建立 通过正交实验的方法，调整PCR反应参数、PCR反应体系中各离子的浓度以及各引物对的浓度，建立23-plex Y-SNPs复合PCR扩增体系。PCR反应体系为25μL，包括：0.4～1ng DNA模板、2.5 U AmpliTaqGold DNA聚合酶、1×PCR buffer、PCR引物浓度在0.006 8～0.0676μmol/L、每种dNTP各600μmol/L、8 mmol/L MgCl2。PCR反应条件为：95℃11min，95℃30s、55℃40s、65℃45 s，循环35次，最后延伸为65℃10min[1]。
1.4.5 PCR反应产物的检测与纯化 首先取15μL 10×上样缓冲液与2μL PCR产物混匀后上样至6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（C=6%，T=3.3%），450 V电泳2～3h，银染显色。然后，使用8μL或7μL酶纯化体系进行PCR产物纯化。
1.4.6单碱基延伸反应体系的建立及其产物的纯化 采用SNaPshot试剂盒（Applied Biosystem，美国）推荐的反应体系：纯化后的PCR产物、微测序引物混合物以及去离子水分别2μL，SNaPshot mix 4μL。循环参数为：96℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，循环25次。单碱基延伸反应结束后，向反应产物加入1μL SAP（1 U/μL），37℃孵育1h，80℃15 min进行纯化处理，并去除多余的引物和ddNTPs。
1.4.7荧光标记和毛细管电泳检测 ①4种不同荧光物质标记ddNTPs，故ddNTP所发射的荧光量亦有差异，蓝色（FAM）、绿色（HEX）、黄色（TAMRA）、红色（ROX）荧光物质发射的荧光比约为4：2：1：1，判读结果时必须对不同荧光标记的RFU值进行标准化[2]；②采用3130-XL遗传分析仪对纯化后的单碱基延伸反应产物进行电泳检测。取1μL纯化产物加入10μL Hi-Di甲酰胺中，再加入0.3μL GeneScanTM Size Standards LIZ-120作为内标。进样时间10s，电压15kV，POP-4凝胶，36cm毛细管，电泳30min。毛细管电泳结束后，使用Genemapper ID V3.2软件对结果进行分析。
2 结果
2.1检测结果 23-plex Y-SNPs电泳检测显示：23个位点均为单倍型，各个位点PCR扩增均衡，多次重复试验结果一致。基因多样性与单倍型多样性的计算公式为：h=n（1-∑X2i）/（n-1）。经法医学参数计算，23个Y-SNPs位点均具有遗传多态性，每个位点基因的多样性范围为0.0137～0.4912。检测的290名男性个体中有11种单体群、143种单倍型，其单倍型多样性为0.9907。
2.2法医学应用 ①灵敏度：倍比稀释浓度为200ng/μL的参照DNA，分别进行复合PCR反应和复合单碱基延伸反应，25μL复合体系中DNA含量为0.1～50ng时均可得到较好的分型结果；②种属特异性：利用磁珠法提取雄性猴、狗、猪、鸡、黄牛、山羊、家兔、大白鼠等动物的DNA.建立复合PCR扩增体系，结果显示动物标本中均未检测到任何Y-SNPs位点；③组织同一性：任何男性个体自身的骨骼、肋软骨、肌肉组织、皮肤、肝脏、血痕、指甲等进行23-plex Y-SNPs复合检测，分型一致。
3 讨论
本研究建立的23-plex Y-SNPs复合检测体系具有良好的男性特异性和种属特异性，检测灵敏度高、重复性好。23-plex Y-SNPs复合检测体系在法医学上的应用是可行的，尤其是对父系家族的亲权鉴定、无名男尸的个人识别、混合斑男性成分的检验等具有积极意义[3～6]。常规DNA指纹、ABO血型、酶型、RFLP、STR等传统的法医学物证检验在法医学实践中均存在一定的局限性。在刑事案件中，尤其是涉及追溯父子关系和性犯罪的案件，譬如：内裤上精斑等犯罪案件的检验样本，采用直接检测Y-SNPs的方法可有效避免传统检测的繁琐步骤，从而快速获得准确的检测效果。在23-plex Y-SNPs系统的基础上，联合使用STR系统和常染色体SNP检测系统，其结果清晰、灵敏度高、重复性好、稳定性强，在法医学领域有广阔的应用前景。
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