淋巴细胞10篇

淋巴细胞篇1

【关键词】小鼠GVHD模型;T淋巴细胞；增强型绿色荧光蛋白；巨噬细胞炎症蛋白

MigrationandDistributionofAllogeneicTLymphocytesinOrgansofGraft-Versus-HostDiseaseMouseModel

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatethemigrationanddistributionprocessesofallogeneicdonorTlymphocytesintheorgansofrecipientmice.GVHDmodelwasestablishedbytransfusionofthesplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6micetogetherwithbornmarrowcellsharvestedfromC57BL/6miceintoBALB/cmiceunderwent8.0Gytotalbodyirradiation.ThemigrationandhomingofeGFPcellsweretrackedbystereo-fluorescentmicroscopyorinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.Theenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedonsupernatantsfromthetissuehomogenatestodetecttheamountofMIP-1α.TheresultsindicatedthatGVHDclinicalmanifestationandpathologicalchangesoforgansappearedonday8posttransplantation.eGFP-positivedonorTcellsinrecipientorganswereobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeinfrozensection,orbystereo-fluorescencemicroscopyinlivingorgans,suchasliver,spleen,skin,lungs,bowels,andtongue.ThehighestexpressionofMIP-1αwasonday7posttransplantationintheliver(491.3±32.1pg/ml),andday***osttransplantationinthespleen(881.5±45.2pg/ml)，respectively(P<0.05).ItisconcludedthatGVHDwasinducedbysplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6mice.eGFPcellsintheorganscanbeobservedbyfluorescentmicroscopy.InthisGVHDmodel,donorTcellsproliferateandinfiltrateinliver,skin,bowels,aswellaslungsandtongue.MIP-1αmaybeinrelationwiththeinfiltrationofTlymphocytesinliverandspleen.

KeywordsmurinGVHDmodel;Tlymphocytes;splenocytes;enhancedgreenfluorescenceprotein;macrophageinflammatoryprotein-1（MIP-1α）

移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的主要并发症之一。目前公认GVHD是由供体T淋巴细胞在宿主体内被激活,并攻击靶组织所引起，但对异基因T淋巴细胞在受体体内的迁移、组织分布及激活过程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范围也存在一定争议。我们建立了增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,eGFP)标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型，观察了GVHD模型中eGFPT淋巴细胞的分布与激活，为GVHD防治研究提供基础资料。

材料和方法

实验动物

BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均为6-8周龄，购自上海生命科学院实验动物中心。eGFP-Tg-C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周龄，由第二***医大学细胞生物学教研室提供。

实验材料

PElabeledanti-mouseCD4，PE-cy5labeledanti-mouseCD8为Biolegend公司产品。小鼠MIP-1αELISA检测试剂盒为R&D公司产品。

供体小鼠骨髓、脾细胞悬液的制备与检测

颈椎脱位法处死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，无菌取其双侧的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI1640培养液制备骨髓细胞悬液及脾细胞悬液。以PBS重悬细胞，调整浓度至107/ml。0.4%台盼蓝染色提示骨髓细胞悬液及脾细胞悬液中活细胞在95％以上。流式细胞术检测骨髓细胞和脾细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞百分比。

GVHD模型的建立

用60Co-γ线全身照射受体BALB/c雌性小鼠(8.0Gy,剂量率为0.5Gy/min)，于6-12小时内每只鼠经尾静脉输入8×106骨髓细胞(BMC)15×106脾细胞(SC)。分组如下：A组18只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMCeGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B组5只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMC；C组BALB/c鼠5只，输eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMCC57BL/6鼠SC。

造血重建

移植后第1、3、5、11、13天，检测外周血细胞数。移植后第13天，制备骨髓细胞悬液片，在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察。骨髓细胞悬液染色体检查采用短期培养法，显微镜下计数Y染色体的***相比例，共观察10个***相。

GVHD观察

死亡时WBC<0.5×109/L为移植失败，WBC>1.0×109/L并具有以下症状者为GVHD发生:倦怠、纳差、体重减轻、弓背、乱毛、脱毛、腹泻甚至死亡。以25天为观察期限，观察小鼠的GVHD发生情况和生存时间。取肝、肠、皮肤组织,用4%中性甲醛固定,石蜡包埋，常规切片,HE染色,光学显微镜下观察。

eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布

取A组小鼠，麻醉后，去毛，切开鼠胸腹部，暴露肝、脾、肠、肺、肾，皮肤、舌、脑、骨等。用LeicaMZFLⅢ立体荧光显微镜观察，拍照，曝光时间0.4-1.9秒。取A组小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、单个肾脏、肠、皮肤、肺、脑实质、舌、肾脏等，冰冻切片（厚10μm），在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。以未输入eGFP细胞小鼠的各组织及冰冻切片分别作对照，排除背景荧光。

MIP-1α水平和T细胞亚群检测

取肝、脾、单个肾脏，置于200目不锈钢网中轻轻碾碎，以1mlPBS分别收集细胞，500×g离心6分种，取上清，行MIP-1αELISA检测，按试剂盒说明书操作，测450nmOD值。采用CurveExpert1.3软件作标准曲线，计算样本OD值对应的浓度值。流式细胞术检测肝、脾、肾细胞悬液中eGFP细胞百分数及以eGFP细胞设门的CD4、CD8细胞百分数。

统计处理

数据用SPSS10.0统计软件处理,生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；样本均数间比较采用***样本t检验。

结果

小鼠骨髓细胞和脾细胞中CD4、CD8细胞百分比

检测结果见表1。由表1可见，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾细胞（SC）悬液中CD4T或CD8T淋巴细胞含量与C57BL/6小鼠相似，CD4T均在20％左右，CD8T均在13％左右。据此推测两种小鼠在引发GVHD方面没有区别。这两种小鼠骨髓细胞中T淋巴细胞含量均极少，约为2％。因此，单输骨髓细胞可能不足以引发GVHD。

移植后造血重建

移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢复至大于1.0×109，第13天WBC恢复至3.0×109以上。移植后第13天后C组鼠的骨髓细胞大多为eGFP细胞(***1)，说明其来源于供体eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色体检查显示受者雌性小鼠骨髓细胞10个***相中，8/10-10/10可见Y染色体。Table1.PercentagesofCD4,CD8cellsinbonemarrowcells(BMC)andsplenocytes(SC)ofthemice（略）

eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布

立体荧光显微镜、荧光倒置显微镜观察显示，A组小鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP细胞浸润(***2)；肾、脑、骨、心肌、骨骼肌等组织中均未见eGFP细胞浸润。可见肝、皮肤、肠、肺、舌等组织第13天eGFP细胞多于第3天。而脾组织第13天eGFP细胞少于第3天(***3)。

GVHD表现及转归

A组小鼠移植后第8天开始出现GVHD表现,主要为消瘦、弓背、脱毛、乱毛、体重减轻和腹泻,最后全部在25天内死亡。出现GVHD表现小鼠的肝、肠符合急性GVHD的病理改变:肝组织显著水肿，细胞浊肿、变性,可见灶性坏死，汇管区淋巴细胞浸润；肠组织学表现黏膜脱落，腺体及绒毛水肿、坏死、糜烂，可见淋巴样圆形细胞浸润（***4）。单输骨髓细胞的B组小鼠无GVHD表现，肝、肠结构基本正常。A组、B组小鼠生存曲线比较表明，A组小鼠生存率明显小于B组小鼠(***5)(P<0.05)。

第3、7、13天，eGFP细胞比例，在肝细胞悬液中逐渐增多，从18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾细胞悬液中逐渐减低，从60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞比例均逐渐升高（表2）。Table2.PercentagesofeGFPcellsinthecellsuspensionsandpercentagesofCD4,CD8cellsineGFPcells(略)

肝、肾及脾脏中MIP-1α的表达

与肾脏中MIP-1α水平相比，肝、脾中MIP-1α水平显著升高（P<0.05）;移植后第3天脾MIP-1α水平最高，为881.5±45.2pg/ml，肝中MIP-1α高峰水平出现在第7天，达491.3±32.1pg/ml(***6)。

讨论

本研究将C57BL/6鼠骨髓细胞与转eGFP基因的C57BL/6鼠脾细胞一起植入经8.0Gy照射的BALB/c鼠体内，成功建立了GVHD模型。eGFP可作为标记，用荧光显微镜或流式细胞仪可以直接检测供体T淋巴细胞在受体鼠体内的浸润、扩增情况。本实验系统可用于观察供体细胞的分布及动态变化，为GVHD的发生机理及防治研究提供了方法平台。目前认为，激活的CD4T淋巴细胞分泌免***应答发生必需的细胞因子，激活CD8T淋巴细胞，使其成为细胞毒性T淋巴细胞，从而攻击受者细胞引发GVHD［1，2］。在本实验模型中，由于供者小鼠骨髓中T淋巴细胞含量极少，单纯输注供者骨髓细胞，虽然也能实现植入和供者型造血重建，但无GVHD发生。同时输注异基因脾细胞可使受者小鼠发生GVHD，在GVHD靶器官中出现受者T淋巴细胞的浸润和增殖。我们观察到受者脾与肝中eGFP细胞呈现不同的动态变化：肝中eGFP细胞逐渐增多，而脾中eGFP细胞逐渐减少。这一结果提示，供体T淋巴细胞在移植初期可能先进入脾等淋巴器官，在异基因抗原作用下，激活、扩增后，离开脾，进入肝、肠等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮肤、肠等GHVD靶器官中存在供体T淋巴细胞的激活与扩增。例如最近有学者研究表明，供体T淋巴细胞可在肝、脾、肺中直接与抗原呈递细胞相互作用而激活、扩增［3］。经典GVHD靶器官主要是肝、肠和皮肤组织，GVHD的临床分级也主要根据这3个组织的损伤程度。临床资料表明，GVHD与移植后的许多并发症均有联系，如间质性肺炎、黏膜炎症或溃疡、出血性膀胱炎、味觉丧失等。有研究显示，脑、肾、牙龈、结缔组织、舌、鼻腔等组织中均可见供体淋巴细胞浸润，并将它们称之为非经典GVHD靶器官［4-6］。本研究采用荧光显微镜观测eGFP细胞的分布，在肝、肠、皮肤、肺、舌中发现eGFP细胞浸润，这提示除肝、肠和皮肤等传统GVHD靶器外，肺、舌也是潜在GVHD靶器官。我们在肾、脑、肌肉等组织中未观察到明显的eGFP细胞浸润，可能与肾、脑中供体淋巴细胞浸润较少或实验观测方法的敏感性有关。MIP-1α是一种重要的趋化因子，活化后的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和肥大细胞均可产生MIP-1α。T淋巴细胞有MIP-1α的受体CCR5、CCR7等的表达，MIP-1α对T淋巴细胞有趋化作用［7］。有研究表明，异基因造血干细胞移植的动物的肝、脾组织中MIP-1α,MIP-2和MIG水平升高；皮肤组织中可见MIP-1α,MIP-2,MCP-1和MCP-3水平升高［8，9］。本研究发现，GVHD模型中肝、脾组织的MIP-1α水平升高，表达高峰分别出现在第7天和第3天。国外有研究也显示，移植后第3天淋巴组织中趋化因子MIP-1α表达上调，在脾中MIP-1α由激活的T淋巴细胞产生。肝中MIP-1α表达晚于淋巴组织，由激活的T淋巴细胞产生，并与供者T淋巴细胞浸润一致，用MIP-1α单克隆抗体或输入MIP-1α-/-供体T淋巴细胞的方法,均可减少受体肝中CD8T淋巴细胞浸润，而且血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平和肝GVHD特异性病理表现均较轻［9-12］。这说明可能存在一个反馈机制，肝浸润T淋巴细胞产生MIP-1α，吸引CD8T细胞毒性T细胞进入肝脏。

【参考文献】

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9SerodyJS,BurkettSE,Panoskaltsis-MortariA,etal.T-lymphocyteproductionofmacrophageinflammatoryprotein-1alphaiscriticaltotherecruitmentofCD8Tcellstotheliver,lung,andspleenduringgraft-versus-hostdisease.Blood,2000;96:2973-2980

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淋巴细胞篇2

作者：张红梅，张利旺，刘文超，盛蓉，范黎，任***，潘伯荣

【关键词】 右胫

【关键词】 母细胞性；NK细胞；淋巴瘤

1病例报告

男，34岁，发现右下肢皮肤包块1 mo入院. 200403无诱因右下肢膝下约10 cm前外侧出现包块，进行性增大，局部皮肤略红，皮温正常，无疼痛，体温正常. 入院查血、尿、粪常规正常，肝、肾功能、血清电解质、***酸脱氢酶均正常；X线：右侧胫、腓骨未见异常；B超： 右小腿实性包块，2.9 cm×3 cm×1.8 cm，血流丰富，浅表淋巴结未探及肿大，肝、脾无异常；MRI： 包块局限于皮肤、浅筋膜层；行包块局部活检，病理：细胞形态为恶性淋巴瘤，免***组化显示部分瘤细胞CD3胞浆（+），CD45RO（-），CD20（-），CD292（-），CD68（-），CD56（+/-），TIA（-），LMP-1（-）；基因重排结果： T细胞受体基因及免***球蛋白基因均未见克隆性重排；诊断为“母细胞性NK细胞淋巴瘤”. 根据病理诊断进一步行骨髓穿刺、头颅CT、纤维喉镜等辅助检查，均未发现异常. 遂给予CHOP方案化疗，两周期后下肢包块完全消失，疗效完全缓解（complete remission，CR）；进一步给予自体外周血干细胞支持下大剂量化疗及椎管内化疗，现维持CR已达6 mo.

2讨论

近年来，国内外关于原发结外的淋巴瘤报道增多，好发部位主要是消化道［1-2］，其次为头颈部、皮肤和骨；病理类型B细胞淋巴瘤比例高于T细胞淋巴瘤，霍奇金病少见. 而NK细胞淋巴瘤发病率则更低，多起源于结外部位，淋巴结内发生罕见［3］. 最常见的类型是鼻和鼻型NK细胞淋巴瘤，其表型及基因型特征为表达NK细胞相关抗原CD56及一些T细胞标志物，如CD2， CD7， CD43或CD45RO，活化的NK细胞可表达CD3ε分子，但不表达CD4， CD5， CD8和表面CD3分子；临床上具有侵袭性和播散性，对***反应性差，预后差. 根据2001年WHO淋巴瘤新分类［4］，本例母细胞性NK细胞淋巴瘤属于T/NK细胞淋巴瘤的第2类，为前驱性T细胞淋巴瘤［3］. 该病多发生于成人，无明显性别差异，且多为结外病变，尤其好发于皮肤（本例以右下肢皮肤包块为首发症状），与EB病毒无相关性，临床进程呈侵袭性，恶性程度高，目前尚无疗效明确的***方案.

参考文献

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淋巴细胞篇3

淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞增生和扩张形成的一种良性肿瘤，好发于舌、唇、颊及颈部。淋巴管瘤通过压迫和浸润周围组织引起组织器官功能破坏，目前***以手术为主，但存在术后容易复发等问题。有学者采用局部注射博莱霉素，或者高渗盐水等，但可能引起周围组织的免***反应或瘢痕回缩，导致原始病症扩大。因此，人们期待新的***方法，从而克服上述***方法的缺陷。迄今为止，淋巴管瘤病因仍不清楚。本研究体外分离培养淋巴管瘤相关淋巴管内皮细胞，为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用提供体外细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 M199培养基、DMEM 培养基和胎牛血清均购于Gibco公司;胶原酶和collagen typeⅠ均购于sigma公司;鼠抗人FLT-4单克隆抗体购于Santa Cruz;兔抗人LYVE-1多克隆抗体购自RD公司;HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠二抗均购于北京金桥公司;Cultrex BME 购于Trevigen公司;VEGF-C购于BD公司。舌淋巴管瘤标本来源于武汉大学附属口腔医院，本研究获得武汉大学附属口腔医院伦理委员会的批准。

1.2 淋巴管内皮细胞分离培养 舌淋巴管瘤标本分成两块，其中一块用4%多聚甲醛固定做蜡块，另一块置于冰M199培养基中(其中含10mg/L两性霉素、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于分离细胞。组织取回后，在超净台内用Hanks液洗数次，用剪刀取出肿瘤周围的组织，将瘤块剪成约0.5mm0.5mm0.5mm 大小，用0.25%(w/v，胶原酶/无血清DMEDM)胶原酶在37℃条件下消化45～60min;消化产物通过30mm孔径大小的过滤网过滤，过滤液1200r/min10min离心，然后用HankS液洗3次再次离心，用EGM 完全培养基重悬细胞，移至T25培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 免***组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，切片置枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，用微波中高火加热5min，室温冷却，PBS缓冲液漂洗，5min加50L过氧化物酶阻断溶液，室温孵育15min，PBS缓冲液漂洗，5min吸干PBS缓冲液，加50L正常羊血清37℃ 封闭10min后吸去不洗;加适当稀释度的一抗4℃孵育过夜;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30min;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加新鲜配制DAB溶液染色，显微镜下观察出现阳性棕黄色着色时终止(5min);自来水冲洗，苏木素复染5min，1%盐酸酒精作用10s;自来水冲洗，1氨水浸泡30s;梯度酒精脱水(70%，80%，95%和100%各2min)，二甲苯透明5min，中性树胶封片。

1.4 电镜标本的制备 淋巴管内皮细胞接种后24h换液。72h用2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.2)固定1h，然后用橡皮铲刮下贴壁生长的淋巴管内皮细胞，连同固定液移入离心管，离心(2000r/min)10min。沉淀物用1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅及醋酸铀染色，日立H-600透射电镜下观察。

1.5 细胞增殖实验 将淋巴管内皮细胞制成细胞悬液，进行细胞记数。1104 个细胞接种于96孔板，加入含10%胎牛血清DMEM 200L，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，1g/L MTT溶液加入每孔，培养4h，弃去MTT溶液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)中止，振荡15min，酶标仪测定560nm波长的A 值，绘制曲线。实验重复3次。

1.6 细胞体外成管试验 取200LⅠ型胶原(2g/L)加入24孔板中，37℃作用30min，使胶凝固;每孔加入约1104 个淋巴管内皮细胞于胶表面。置37℃、5%CO2培养箱中孵育培养7d，期间倒置显微镜观察并拍照记录，胶原胶固定于2.5%戊二醛，透射电镜观察形成管腔的超微结构。

2 结果

2.1 舌淋巴管瘤标本HE染色及免***组织化学染色 HE染色结果显示舌淋巴管瘤组织中有大量扩张和增生的淋巴管，管腔中未见血细胞，而见少量淡染的液体，为管腔内残留的淋巴液。免***组织化学染色结果显示，管腔中内皮细胞均高表达目前公认的淋巴管内皮细胞特异性标志物FLT-4、和LYVE-1，与文献报道一致。因此，可以认为淋巴管瘤为分离淋巴管内皮细胞提供了可靠的标本来源。

2.2 淋巴管内皮细胞的形态和超微结构 原代培养淋巴管内皮细胞生长较为缓慢，单层贴壁生长，显微镜下见细胞呈扁平的梭形或多边形，大小均匀，胞核呈卵圆形，有核的区域较无核的区域突出，培养14d左右生长至约90%融合。原代细胞生长至90%融合度时开始传代，淋巴管内皮细胞多在接种1h后开始贴壁，多个细胞组成的细胞团更易贴壁和***增殖，贴壁后的细胞呈梭形、三角形或多边形，形态与原代细胞相似，但生长速度较快，约7d融合，从传代第2天开始迅速增殖，至第6天开始生长缓慢，体现内皮细胞生长特有的接触抑制现象;当内皮细胞长满形成单层后，呈现典型的 铺路石 样外观，其中中央细胞较小而密集，周边细胞大而不规则，排列松散，其间可见少数几个梭形细胞。透射电子显微将观察淋巴管内皮细胞的超微结构，细胞呈鳞片状单层排列，镜下见大部分细胞呈团存在，可见细胞间的紧密或缝隙连接，可见内皮细胞特异性颗粒weibel-palade小体;可见到其它内皮细胞特征性细胞器如胞质小突和质膜小泡等。

2.3 淋巴管内皮细胞的体外增殖和成管实验 体外增殖实验显示淋巴管内皮细胞于第3天开始进入增殖活跃期，第5天进入高峰期，第6、7天进入平台期。体外成管实验显示淋巴管内皮细胞在Ⅰ型胶原培养基中可以形成管腔样的结构，并且随着培养时间的延长，从不同方向形成的管腔互相连接，形成类似于体内的复杂的三维淋巴管网络。透射电子显微镜观察管腔样结构的超微结构，可见由淋巴管内皮细胞围成的管腔，在这种细胞外基质成分存在的条件下，相邻细胞间的紧密或镶嵌重叠连接可见，模拟了体内淋巴管内皮细胞与细胞外基质相互作用的过程。

3 讨论

淋巴管瘤与淋巴管的扩张和异常增殖有关，Sironi M 等研究者在小鼠腹腔内注射弗氏不完全佐剂产生淋巴管瘤，然后再分离培养，得到鼠源性淋巴管内皮细胞，用于研究淋巴管内皮细胞的生物学特性，为研究淋巴管发生提供了细胞模型。本文中应用的舌淋巴管瘤标本，其病理特征与以往报道的淋巴管瘤病例一致。HE染色结果显示切片中有大量扩张的淋巴管，管腔中没有血细胞，而是有少量嗜伊红淡染的淋巴液;为进一步确定这些扩张管腔的性质，应用免***组化染色检测淋巴管内皮细胞标志物的表达，结果显示管腔内皮细胞均表达FLT-4和LYVE-1，证实了其淋巴管的性质。因此，舌淋巴管瘤是淋巴管内皮细胞非常有价值的标本来源。

本文应用胶原酶消化法分离淋巴管内皮细胞，处理标本时应注意避免肿瘤周围舌组织细胞的污染，尽量去除周围组织，保证分离细胞的纯度;多次用含高浓度抗生素溶液洗涤去除组织表面的细菌和真菌。胶原酶作用时间的控制是能否得到高纯度目的细胞的关键，作用时间太短，得到的细胞较少，不易培养;时间太长，容易导致一些杂细胞的污染。在发现淋巴管内皮细胞特异性标志物之前，研究者大部分应用胶原酶消化法分离细胞。近年来，由于淋巴管内皮细胞标志物的发现，学者们开始应用免***磁珠从各种不同组织中分离淋巴管内皮细胞。Simona Podgrabinska、Ernst Kriehuber和Taija Makinen等人分别应用标记有LYVE-1、Podoplanin和VEGFR-3抗体的磁珠从组织中分离相关亚型的淋巴管内皮细胞。事实上，这类方法分离得到的只是部分亚型的淋巴管内皮细胞，而且可能有其它细胞的污染如血管内皮细胞，不能较全面反映淋巴管内皮细胞的生物学特点;胶原酶消化法也有可能造成杂细胞的污染，如血管内皮细胞，间质细胞等等。为了得到较高纯度的淋巴管内皮细胞，本实验利用内皮细胞比较容易且呈团被消化的特性，使淋巴管内皮细胞与较难消化的污染细胞分开，传代时换新的培养瓶，弃去未被消化的细胞;同时，EGM培养基中添加能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖的生长因子VEGF-C，有报道VEGF-C能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖，而对血管内皮细胞没有作用;同时，有文献报道在内皮细胞培养基中加入适量的肝素能增强内皮细胞的生长能力，并能降低生长因子的用量，以便细胞长期培养，并保持细胞表型不变。因此本文在培养基中添加了肝素，在最大程度上获得高纯度淋巴管内皮细胞，并保留其在体内的分子表型和生物学特性以供研究。

淋巴细胞篇4

Ph+急性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病急淋变；细胞免***表型分析

R733.71 B 1673-9701（2014）34-0035-04

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是起源于白血病干细胞的一种疾病，儿童ALL***效果好，预后相对较好。慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）根据疾病发展过程分为慢性期、加速期及急变期，急变期是其终末阶段。Ph染色体是CML的标志性染色体，也存在某些ALL中以及少数急性髓系白血病、真性红细胞增多症、骨髓增生异常综合征中，是ALL常见的不良预后因素，Ph+ ALL占成人ALL的20%～40%，具有耐药率高、易复发和预后差等特点。20%～30%的CML急变为急淋变，而CML急淋变与Ph+ALL比较，具有不同的临床特点。本研究回顾性分析PH+ALL 患者24例和CML急淋变患者 28例的临床资料，探讨其临床特征、预后等情况。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

病例来源为2008～2012年在我院***的Ph+ ALL患者24例和CML急淋变患者28例，随访时间超过12个月。Ph+ ALL组男14例，女10例，平均年龄（45.1±12.4）岁；CML急淋变组男16例，女12例，平均年龄（42.5±14.7）岁。

1.2 研究方法

回顾性分析患者临床资料以及免***表型和随访结果，比较两组患者临床特征、免***表型特征以及随访结果。（1）免***表型分析方法：骨髓标本2～4 mL，肝素抗凝，淋巴液梯度离心单个核细胞，活细胞免***荧光法标记，淋系单抗包括T系和B系，髓系单抗，干/祖细胞抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR），CD34等。胞浆抗原、CD34≥10%，其他表型≥20%为阳性。（2）bcr/abl融合基因检测：骨髓标本肝素抗凝，提取骨髓液单个细胞，采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿提取总DNA，QT-PCR法获得bcr/abl融合基因转录本。（3）形态学分型：骨髓标本涂片，瑞吉染色以及组织化学染色，包括过氧化物酶染色、碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、糖原染色，进行形态学分型。

1.3 ***方案

1.3.1诱导方案 均给予标准VDCLP方案，第1、8、15、21天，长春新碱（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20043326）1.5 mg/m2；第1、2、3、15、16、17天柔红霉素（阿特维斯（佛山）制药有限公司，进口药品注册证号H20100552）40 mg/m2；第1、15天环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020856）800 mg/m2；第15～24天左旋门冬酰胺酶（协和发酵工业株式会社，H20030570）1万U/d；第1～28天泼尼松（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021520）40 mg/m2。

1.3.2 巩固*** 患者完全缓解后，序贯给予COAP、CHOP、EA、MAE方案***。O为长春新碱，M为米托蒽醌（江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H32020 964），A为阿糖胞苷（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20054695），E为依托泊苷（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H10940003）。第1天长春新碱1.5 mg/m2；第1～3天柔红霉素40 mg/m2；第1天环磷酰胺800 mg/m2；第1～7天阿糖胞苷150 mg/m2，第1～7天泼尼松40 mg/m2，第1～3天米托蒽醌12 mg/m2；第1～7天依托泊苷75 mg/m2。经济条件允许的患者家用伊马替尼（Novartis Pharma Schweiz AG，进口药品注册证号：H20100238）400 mg/d。

1.4 统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件，计数资料除了表3中“伴T细胞系抗原表达”项采用Fisher精确概率法检验外其他均采用χ2检验。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组患者性别比和平均年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）；CML急淋变组肝脏肿大比例和脾脏肿大比例显著高于Ph+ ALL组（P<0.05或<0.01）。见表1。24例Ph+ ALL 患者中22例患者为典型Ph染色体异常，28例CML急淋变患者26例患者为典型Ph染色体异常（***1）。

2.2 实验室结果比较

两组PLT<50×109/L、Hb<60 g/L、肝功能异常比例比较差异无统计学意义（P>0.05）。CML急淋变组WBC>10×109/L比例显著高于Ph+ ALL组（P<0.05）。见表2。

2.3两组免***表型比较

两组免***表型比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。24例Ph+ ALL患者，18例表现为单纯B淋巴细胞系抗原HAL-DR，CD10、19、79a；1例患者伴表达T淋巴细胞抗原CD2、3、7；5例患者伴表达髓系抗原CD13、33。28例CML急淋变患者中17例表达单纯B淋巴细胞系抗原HAL-DR，CD10、19、34；1例患者伴表达T淋巴细胞抗原CD2、3、7；10例患者伴表达髓系抗原CD13、33。

2.4 Bcr/abl融合基因检测结果

***前，Ph+ALL患者融合基因拷贝数平均（70.1±18.5），CML急淋变患者平均（73.8±21.7），两组比较差异无统计学意义（t=0.656，P>0.05）。16例Ph+ ALL患者***后达到缓解，Bcr/abl融合基因拷贝数平均（0.4±0.1），10例CML急淋变患者达到血液缓解，Bcr/abl融合基因拷贝数平均（50.1±15.4），两组比 较差异有高度统计学意义（t=15.788，P<0.01）。

2.5 临床疗效和不良反应

Ph+ ALL组CR发生率显著高于CML急淋变组（P<0.05），平均生存率显著长于CML急淋变组（P<0.01）。Ph+ ALL组21例患者出现不良反应，CML急淋变组24例出现不良反应，主要为恶心呕吐、腹泻、便秘、皮疹、脱发、消化道不良反应、皮疹，经对症处理后缓解。两组不良反应比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

目前依据ALL不同的生物学特性制定相应的***方案已取得较好疗效，约80%儿童和30%成人能获得长期无病生存，且有治愈可能。伴Ph染色体，即t（9，22）（q34；q11）的急性淋巴细胞白血病（ALL）为极高危组，常伴附加染色体异常，免***分型诊断以CD10+的前B细胞型为主，部分协同表达髓系抗原，CD34+患者占一半以上。Ph+ALL发生率随年龄增加显著高，在≤15岁、15～40岁、40～60岁以及≥60岁各年龄阶段发生率为2%～5%、18%、46%和35%。Ph+ALL具有发病年龄偏高（>10岁），初诊时白细胞计数高，幼稚细胞数高，血小板计数较低，FAB-L2型，肝脾大和常有CNS-L等临床特征。虽然标准诱导缓解化疗方案也可以取得完全缓解（CR），但由于疾病早期耐药，获得缓解期和生存期较短。中位生存时间为8～16个月，无病生存率不超过10%。

CML是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，其特点是产生大量不成熟白细胞，其在骨髓内聚集，抑制骨髓正常造血；且能通过血液全身扩散，导致患者出现贫血、出血、感染及器官浸润等。CML的病因仍未明确，约90%～95%患者出现Ph染色体。Ph染色体是CML特异性染色体改变，成人20%～40%ALL和5%儿童ALL也会出现Ph染色体。Ph染色体是22q11的bcr基因和9q34的abl基因形成融合基因bcr/abl，编码原癌蛋白，原癌蛋白激活酪氨酸激酶，在CML的发生和发展过程中发挥重要作用。因bcr基因的断裂点存在差异，因此可形成不同的融合基因，典型的CML大部分融合基因在主要断裂点簇集区内断裂而融合，编码胞浆蛋白分子量210kD，即P210融合蛋白，其他较少见的融合基因主要编码P190融合蛋白等。P210融合蛋白和P190融合蛋白均具有异常高的酪氨酸激酶活性，存在P190融合蛋白的ALL复发率、恶性程度均较存在P210融合蛋白的ALL患者。Bcr/abl是CML和Ph+ALL的启动因子，但其在分子水平以及临床特征等方面存在较大的差异。Ph+ALL拷贝数目异常以及bcr/abl下游发生突变，使Ph+ALL侵略性更强，并使其表现出很多附加的遗传学变化。在本研究中Ph+AAL组外周血白细胞计数显著低于CML急淋变组，肝肿大、脾肿大比例显著低于CML急淋变组，完全缓解率高于CML急淋变组，平均生存期显著长于CML急淋变组。两组免***表型无显著差异，主要表达B淋巴系的抗原，可伴随髓系抗原或者T细胞抗原，表明Ph+ALL预后差、复发率高，而CML急变期常规化疗效果也很差。CML急淋变的缓解率约50%，急髓变的缓解率低于20%，并且缓解期持续时间段，很快就会再次进入急变期。

Bcr/abl蛋白可异常持续激活酪氨酸激酶，后者催化磷酸基团从三磷酸腺苷转移到酪氨酸残基上，这是正常造血细胞转变为恶性造血细胞的核心。伊马替尼是2-苯胺基嘧啶衍生物的一个小分子，对bcr/abl酪氨酸激酶具有高选择性的抑制作用。造血干细胞抑制是***ALL的有效方法，但是必须待疾病缓解后才能进行。虽然异基因造血干细胞移植疗效优于常规化疗，但是目前接受异基因造血干细胞移植的患者比例较低，这与缺乏供者、耐药性疾病、移植前复发、患者年龄高等因素有关。Ph+ALL患者行伊马替尼***后，接受造血干细胞移植的比例会显著升高，且可获得长期生存。Ph染色体大多仅在造血细胞的恶性克隆中存在，并随着恶性造血细胞克隆消失而消失。本研究中Ph+ALL患者经***诱导达完全缓解后，Ph+骨髓细胞消失，而CML急淋变患者诱导缓解达完全缓解后，仍存在Ph染色体阳性的骨髓细胞，提示Ph+ALL经化疗达完全缓解后，细胞遗传学、分子生物学异常均能得到纠正，而CML急淋变患者虽然血液学达完全缓解，但是细胞遗传学并没有完全缓解，也没有纠正分子生物学异常。

总之，Ph+ALL与CML急淋变具有不同的临床特征和不同的遗传性特征，Ph+ALL诱导完全缓解后，Ph染色体呈阴性，而CML急淋变诱导缓解后Ph染色体仍存在。Ph+ALL完全缓解率高于CML急淋变患者，平均生存时间长于CML急淋变患者。

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淋巴细胞篇5

【关键词】 组织细胞性坏死性淋巴结炎;诊断

组织细胞性坏死性淋巴结炎是一组以发热、淋巴结肿大和一过性白细胞减少为特征的疾病,目前病因不明,早期极易误诊误治。现将本科收治的1例病例结合文献分析报告如下。

1临床资料

患儿，女,10岁,以“间断发热1月余”为主诉就诊于本院。患儿于入院前1月余出现发热,外院给予“头孢类,青霉素类”等抗感染***无效,行ppd强阳性,其母与祖母均患有结核,胸部ct示纵隔淋巴结肿大,给予口服抗结核药物***15天,患儿仍有发热。患儿入院后持续发热,无关节肿痛,无皮疹,为持张热,热型无规律。查体颈部可触及数个肿大淋巴结。心肺听诊无异常,肝脾无肿大。辅助检查：白细胞(2.42~4.73)×109/l，血沉50mm/h，ppd试验(++)，crp阴性。类风湿因子阴性。肝肾功正常。外周血涂片白细胞低。血培养阴性，骨穿示缺铁性贫血。腹部b超及胸片无异常。入院后继续口服异烟肼，利福平，吡嗪酰胺，并给予“青霉素”抗感染***无效。曾考虑结缔组织疾病，给予口服阿司匹林，体温正常2天后再次发热。行淋巴结活检示组织细胞性坏死性淋巴结炎。予以强的松***，体温恢复正常。

2讨论

组织细胞性坏死性淋巴结炎是一种病因不明，炎性免***反应性非肿瘤性淋巴结肿大性疾病。儿童少见，临床表现缺乏特异性，易误诊。主要临床症状有发热，乏力，浅表淋巴结肿大并伴疼痛。由于该病没有特征性的体征和症状，实验室检查缺乏特异性，诊断主要依靠淋巴结活检。根据病理特点分为3个组织学类型：(1)增生型;(2)坏死型;(3)黄色瘤样变型[5]。组织细胞性坏死性淋巴结炎是一种自限性疾病，预后良好,自然病程一般为1~4个月，只有个别死亡报道[3]。儿童组织性坏死性淋巴结炎可发展为嗜血细胞综合征或sle,此类患儿预后较差[4]。抗生素***无效，激素是目前***最有效的***药物，可缓解症状，缩短病程[2]，绝大多数对激素***敏感，发热症状可在短期内缓解和消失，预后良好。

【参考文献】

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3张鹏，李秀忠,张锦,等.组织细胞性坏死性淋巴结炎38例分析.宁夏医学杂志，2011，33(4)：336.

淋巴细胞篇6

【摘要】 套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是一类较少见的非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkin's lymphoma， NHL），形态学方法常难以将其与其他类型小细胞淋巴瘤相鉴别。为了提高对MCL的认识，报道1例误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）的MCL，总结该病例临床资料及实验室检查特点。结果显示：流式细胞术（flow cytometry，FCM）及免***组织化学染色检查符合MCL的特征，细胞遗传学检查发现了包括t(11;14)在内的多种染色体异常。结论： MCL为难以确诊的疾病，间期荧光原位杂交、多重荧光原位杂交、FCM以及免***组织化学染色等检查有助于MCL的诊断。

【关键词】 套细胞淋巴瘤

A Case Report of Misdiagnosed Mantle Cell Lymphoma

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare group of nonHodgkin's lymphoma (NHL)， which is difficult to discriminate from other subtype of small lymphocytic lymphoma in morphologic appearance. In order to enhance the understanding of MCL， a case of MCL first diagnosed as follicular lymphoma (FL) was reported. The clinical and laboratory characteristics of MCL were analyzed and summarized. The results showed that the findings of flow cytometry (FCM) and immunohistochemical staining technique were compatible with the diagnosis of MCL. Cytogenetic analysis can detect multiple types of chromosomal abnormalities， including t(11;14). In conclusion， MCL is a disease which diagnosis is difficultly confirmed. Interphase fluorescence in situ hybridization， multiplex fluorescence in situ hybridization， FCM and immunohistochemical staining technique play important roles in the diagnosis of MCL.

Key words

mantle cell lymphoma; IFISH; MFISH; FCM

套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是1994年于欧美淋巴瘤修订分类（revised European American lymphoma， REAL）中提出的一个独特的病理类型［1］，为较少见的一类非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkin's lymphoma， NHL），占NHL的2％-10％。在Kiel分类中归为生发中心细胞淋巴瘤，在工作分类中归为小细胞与大细胞混合性淋巴瘤或弥漫型小裂细胞淋巴瘤，但不明确的滤泡部分常被误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）或反应性淋巴滤泡增生。细胞遗传学特点是t(11;14)(q13;q32)，由11号染色体的Bcl1基因（11q13）易位到14号染色体免***球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain， IgH）基因启动子的下游，从而导致Bcl1基因表达的上调。Bcl1基因的易位导致细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA过度表达，最终导致细胞增殖的调控紊乱。临床过程呈进展型，侵袭性强，预后较差，中位生存期为3-5年［2］。近来我科收治1例患者，外院误诊为FL，在我院经过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）以及流式细胞术（flow cytometry， FCM）检测确诊为MCL，现报告如下。

材料和方法

病例资料

患者，男，58岁，2005年1月体检B超发现后腹膜淋巴结肿大。增强CT、MRI显示：两下肺结节影，纵隔淋巴结肿大；腹腔及后腹膜淋巴结肿大，胰腺周围及腹主动脉旁、肝门处见多个大小不等的低回声，周围清晰，最大直径5.9 cm × 5.3 cm，部分内部回声不均，脾脏肿大，膀胱直肠间类圆形软组织影。外院行腹腔淋巴结切除活检术，术后病理检查显示： FL（I级）；免***组织化学检查显示： CD79α+、CD20+、CD43+，CD3-、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+、CD5-。2005年2月以MACOP（米托蒽醌、阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松）方案化疗，2005年3月复查，CT显示两下肺结节絮状影有所进展，纵隔淋巴结仍肿大，转至其他医院病理切片会诊显示： FL（I级），免***组织化学检查显示：CD79α+、CD20+、CD43+、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+，背景细胞CD3+、CD5+。2005年3月-2006年1月采用FND（福达华、米托蒽醌和地塞米松）方案化疗，共计8疗程，期间多次复查CT显示部分病灶有所吸收，部分增大，并出现左颈根部、左腋下淋巴结肿大。2005年8月中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)套细胞淋巴瘤一例误诊分析常规骨髓检查未见异常。2006年3月患者出现四肢游走性疼痛，4月复查CT显示：左中下颈、左侧锁骨上及左侧腋窝淋巴结较前增大、增多，两肺浸润灶较前有所缩小，脾肿大。骨ECT显示：两肱骨中段、两股骨中段、左侧坐骨肿瘤骨转移。患者疾病进展，于2006年4月26日转至我院。我院病理报告显示： FL（I-Ⅱ级），入院体检为：轻度贫血貌，皮肤黏膜无瘀点瘀斑，浅表淋巴结未扪及，胸骨无压痛，心肺无异常，腹平软，肝未及，脾肋下2 cm。骨髓细胞形态学：有核细胞增生明显活跃，原始淋巴细胞22.8%，幼稚淋巴细胞10.0%，成熟淋巴细胞4.0%；原幼细胞过氧化物酶（POX）和糖原染色（PAS）染色阴性。外周血白细胞16×109/L，原始淋巴细胞11%，幼稚淋巴细胞11%，成熟淋巴细胞38%，血红蛋白 85 g/L，血小板 160×109/L。

常规细胞遗传学（conventional cytogenetics， CC）分析

取骨髓5 ml肝素抗凝，有核细胞计数后按(1-2)×106/ml进行直接法和（或）短期培养法制备染色体并采用R显带技术进行核型分析。染色体核型按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN 2005）》描述。

间期FISH检测t(11;14)

探针来源 间期FISH探针购自美国Vysis公司。该探针是分别用荧光素SpectrumGreenTM标记的IgH和用SpectrumOrangeTM标记的CCND1探针的混合物。

方法 参照文献步骤［2］。

结果分析 应用Leica DMRA2型荧光显微镜在DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号：无t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现两个红色信号和两个绿色信号（2R2G）。有t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现绿色和红色相互靠近或叠加产生的黄色融合信号（F）。每个病例计数200个间期细胞。

MFISH分析

探针来源 MFISH探针购自美国Vysis公司。此探针是经流式细胞仪分选、显微切割后经DOPPCR扩增的全染色体涂抹探针，应用5种荧光素的不同组合经缺口平移法标记，5种荧光素包括SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM。

步骤 标本处理、***像采集及分析方法参照文献步骤［3］。

FCM免***表型分析

取肝素抗凝的新鲜（6小时内）抽取的骨髓，调整细胞数至（0.5-1.0）×106/ml，取100 μl经直接免***荧光标记法标记，避光15分钟后上溶血剂溶解红细胞。流式细胞仪（BeckmanCoulter公司产品，Epics XL型，USA，488nm激发波长，采用Expo32 ADC分析软件）检测至少10 000个细胞，FS/SS双参数设门，分析淋巴细胞群不同抗原的表达情况，膜单克隆抗体包括有CD5、CD19、CD20、CD23（购自法国Immunotech公司）。结果判断以抗原表达≥20％为阳性。

结

果

FCM检测结果

原幼淋巴细胞占39.9%，其表达为CD19+ 90%，二次设门（CD19+细胞表达）CD5+ 89.5%，CD20+ 100%，CD23-。

CC检查结果

92，XXYY，7q+×2，9q+×2，t(11;14)×2，13q+×2，15q+×2［2］/46，XY［8］。

间期FISH检查结果

t(11;14)阳性细胞占24%，其中3R3G3F 16%，4R3G2F 4%，2R2G3F 4%（***1）。

Figure 1. t (11; 14) positive cells shown by FISH.

MFISH检查结果

综合上述FCM、CC、IFISH和MFISH结果，结合外院淋巴结免***组织化学CCND1+、CD43+、CD10-，诊断此患者为MCL（IV期A组）。于2006年5月初开始HyperCVAD A方案（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、地塞米松）及B方案（阿糖胞苷和甲氨蝶呤）交替化疗，每周期2次腰穿鞘注甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松***，共计进行4疗程化疗。5月26日复查骨髓：原幼淋占0.8%。FCM未见微小病灶残留（minimal residual disease， MRD）。FISH 结果：t(11;14)阳性细胞：0/200。2006年8月复查CT显示：左腋窝淋巴结、纵隔淋巴结、腹膜后淋巴结均明显缩小，脾脏亦有所缩小，但仍超过正常大小，肺部病灶明显吸收。

讨

论

MCL因其独特的细胞来源、病理形态、免***表型和分子生物学特征而成为WHO NHL分类中***的一种类型。MCL起源于滤泡套内层中未受抗原刺激的CD5+CD23-周围性B细胞，拥有B细胞的免***标记： CD19+、CD20+、CD22+、CD43+、CD79α+、sIgM+，并过度表达CD5+、FMC7+、Bcl2+，但CD3-、CD10-、CD23-、Bcl6-，CD5+有助于MCL与FL区别。CCND1+几乎存在于每例MCL中，而在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）及其它NHL很少见［5］。通过遗传学和免***学方法检测t(11;14)(q13;q32)和CCND1表达可作为区别MCL和其他小B细胞性淋巴瘤的重要手段［6］。

在MCL、FL、CLL/SLL和边缘区B细胞淋巴瘤等小B细胞淋巴瘤中，组织病理学形态有时有重叠，而套细胞淋巴瘤对***反应性差，5年生存率仅为11%［7］，因此必须与其他小B细胞淋巴瘤作鉴别。有时MCL的结节性病灶极类似于FL的肿瘤性滤泡，单从形态上很难鉴别，因此鉴别两者需把组织学、免***组织化学和分子遗传学综合考虑。由于免***组织化学检测易受到多种技术性与人为因素以及抗体特异性与敏感性不足的影响，因此其结果始终是HE组织学改变的辅助与补充，不能脱离组织学改变去评价免***组织化学检测结果，我们认为免***组织化学结果与组织学特点相一致才可以肯定。尤其是淋巴瘤的诊断，最基本的是确切、充分的组织学依据，免***组织化学检测只能作为分型与鉴别诊断的辅助手段。此病例虽然免***组织化学检测结果CCN1+，但先后两次CD5结果不一致，而淋巴结病理形态与FL高度符合，鉴于上述原因，三家医院病理科诊断为FL。先后以MACOP方案1次及FND方案8次化疗，均无明显疗效，病情进展，转至我院后FCM显示CD5+、CD19+、CD20+、CD23-、CC、间期FISH和MFISH检测均有t(11;14)异常，尽管病理学诊断为FL，但结合病史特点以及免***表型特征和分遗传学结果确诊为MCL。

t(11;14)易位导致了CCND1的表达异常。Monteil等［8］在1996年首次采用间期FISH检测MCL中t(11;14)(q13;q32)。现FISH已经作为国外日常病理辅助诊断MCL的首选方法［9］。PCR只能检测出11q13上主要易位簇（major translocation cluster， MTC）内有限区域上（大约几百个bp）的断裂点，落在距离主要易位簇以外大约100 kb的次要易位簇（minor translocation cluster， mTC）内的断裂点，由于PCR技术上的局限性而不能完整的扩增出如此长的片段。FISH敏感性高的原因是其所用的CCND1探针杂交的目的片段包括了11q13上MTC、CCND1等大约350 kb大小的区域，明显提高了易位检出率［10］。本研究中，骨髓细胞采用FISH检测到t(11;14)(q13;q32)。

间期FISH只能用特异性的探针检测已知的染色体异常，且通常一次杂交只能检测一种至数种染色体异常。MFISH不仅可以确定CC发现的核型异常，包括染色体易位、大片段缺失、不明来源的额外物质的增加、衍生染色体和标记染色体，而且还可以发现CC分析未发现的异常，纠正CC分析中的错误，对检测未知核型异常很有帮助。本例患者CC与MFISH检查示近四倍体，染色体条数稍有差别可能和不同的***像有关，CC仅见t(11;14)伴7q+，9q+，13q+，15q+，而MFISH发现了6、7、9、13、14、22号衍生染色体，t(7;9)，t(9;15)，t(3;13)，t(11;14)，t(4;22)易位及11号染色体片段缺失等多种染色体异常，11号染色体片段缺失可能与易位的14号片段丢失或其片段很小有关。

近来人们利用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术显示MCL的基因突变。deLeenw等［11］用基因芯片技术分析8例MCL细胞系（G519、HBL2、NCEB1、Rec1、SP49、UPN1、Z138C和JVM2），结果发现平均每个细胞有35种基因改变，其中14种为基因缺失、21种为基因扩增，18q21/Bcl2和13q31/GPC5异常扩增和9p21缺失多见，重要的是发现了位于2p11和22q11上的免***球蛋白轻链基因等新的位点的缺失，这些新位点的变化对研究MCL很有意义。Jarosova等［12］利用CGH分析30例确诊的MCL，80%的患者有不稳定的异常染色体变化。常见的缺失有1p、8p、9q、11q、13q和17p，约1/4的病例3号染色体有附加异常。

Ott等［13］用FISH及CC方法研究发现，大约30％的MCL可检测到染色体四倍体克隆，且在母细胞样型MCL出现率明显增高（80％）。由于四倍体染色体异常在其它B细胞NHL现象少见，可作为MCL遗传学特征之一。本研究结果提示，对少见复杂表现的小细胞淋巴瘤可以先借助组织学和免***组织化学染色来诊断大部分的病例。不能鉴别时，采用FCM检测、间期FISH、MFISH等方法尤为重要。

Khouri等［14］报道45例MCL患者予HyperCVAD方案化疗4周期化疗后总体有效率93.5％，其中完全缓解(CR) 38％，部分缓解(PR)55.5％。所有随后进行移植的患者均达CR。25例初治的患者3年总体生存率(OS)和无事件生存率(EFS)分别为92％和72％，而曾经接受过***的患者其OS和EFS则分别为25％和17％。与经典的CHOP类似方案相比， HyperCVAD方案的3年EFS及OS亦显著增高。认为HyperCVAD方案后进行干细胞移植是***初诊MCL患者的有效方案。而Hagemeister［15］认为在年龄小于65岁的患者中，美罗华联合HyperCVAD方案与HyperCVAD后进行干细胞移植在***有效率、疾病无复发以及总体生存率方面类似。本例患者初诊时误诊为FL，外院采用MACOP及FND方案化疗，疗效不佳，且病情进展，侵犯骨髓，我们应用HyperCVAD方案取得了较好的近期疗效，目前患者仍在随访中。

参考文献

1Harris NL， Jaffe ES， Stein H， et al. A revised EuropeanAmerican classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood， 1994;84:1361-1392

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4肖冰，李建勇，潘金兰等. 多重荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征患者复杂核型异常. 中华血液学杂志，2005;26:513-516

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10Aguilera NS， Bijwaard KE， Duncan B， et al. Differential expression of cyclin D1 in mantle cell lymphoma and other nonHodgkin's lymphomas. Am J Pathol， 1998;153:1969-1976

11deLeeuw RJ， Davies ***， Rosenwald A， et al. Comprehensive whole genome array CGH profiling of mantle cell lymphoma model genomes. Hum Mol Genet， 2004;13:1827-1837

12Jarosova M， Papajik T， Holzerova M， et al. High incidence of unbalanced chromosomal changes in mantle cell lymphoma detected by comparative genomic hybridization. Leuk Lymphoma， 2004;45:1835-1846

13Ott G， Kalla J， Ott MM， et al. Blastoid variants of mantle cell lymphoma: frequent bcl1 rearrangements at the major translocation cluster region and tetraploid chromosome clones. Blood， 1997;89:1421-1429

14Khouri IF， Romaguera J， Kantarjian H， et al. HyperCVAD and highdose methotrexate/cytarabine followed by stemcell transplantation: an active regimen for aggressive mantlecell lymphoma. J Clin Oncol， 1998;16:3803-3809

淋巴细胞篇7

【关键词】隐丹参酮；淋巴细胞；胶原性关节炎；大鼠

隐丹参酮(cryptotanshinone，CT)是从中药丹参中提取的单体化合物，有明确的化学结构（C19H20O3，Mw296.35）。

丹参作为一种传统中药在我国沿用已久，具有祛瘀止痛、活血通经、清经除烦的功效，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调等症。研究表明，隐丹参酮对角叉菜胶引起的大鼠足跖肿胀、对蛋清引起的大鼠急性关节肿等均有明显的抑制作用。本文主要观察了CT对正常SD大鼠和胶原性关节炎(collageninducedarthritis，CIA)大鼠胸腺T淋巴细胞、脾脏B淋巴细胞增殖反应的影响。

一、材料与仪器

1.1动物雄性SpragueDawley(SD)大鼠，体质量（160±20）g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第01号。

1.2药物与试剂隐丹参酮(CT)，批号：050428，由中山大学药学院提供；卡介苗，每支50mg，上海生物制品所生产；鸡II型胶原(CII)，上海本草生物医学研究所产品；DMEM培养粉，美国Gibco公司产品；刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)：美国Sigma公司产品；二甲亚砜（DMSO，分析纯），天津市光复精细化工研究所产品；溴化3（4，5?捕?甲基噻唑2）2，5?捕?甲苯基四氮唑（四甲基偶氮唑蓝，MTT），美国Sigma公司产品。

1.3仪器Napco6100型CO2培养箱（美国杜邦公司产品）；GL20A全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；EL301stripreader（美国BioTeK公司）。

二、方法

2.1药物的配制CT先用无水乙醇溶解，再用无血清的DMEM培养液配制所需的5个浓度。刀豆素A（ConA），脂多糖（LPS）分别用无血清的DMEM培养液配制。

2.2大鼠CIA模型的建立将CⅡ溶于0.1mol?L1醋酸中，在4℃下搅拌使之充分溶解，质量浓度为2g?L-1，置4℃冰箱过夜，再将灭活的卡介苗置于液体石蜡中，配成0.5g?L-1的完全弗氏佐剂，将二者等体积混合、***化，制成CⅡ***剂。将该***剂于大鼠的右后足趾皮内注射0.1ml致炎，第7天尾根部近1/3处和背部3～5点皮内注射该***剂0.1ml作为激发注射。

2.3胸腺T淋巴细胞，脾脏B淋巴细胞增殖功能测定（MTT法）分别取正常大鼠和致炎后35dCIA大鼠，无菌取胸腺和脾制成淋巴细胞悬液，调整细胞至终浓度为1×107/ml，DMEM培养液培养细胞，在96孔培养板上每孔加入100μl细胞悬液，50μlConA（终浓度5μg/ml）或LPS（终浓度6μg/ml），50μl不同浓度的CT（0.1，1，10，100，1000μg/ml）培养48h，终止培养前4h加入20μlMTT(5mg/ml)，继续培养4h后加入150μlDMSO终止反应，酶标仪检测（490nm）吸光度(absorbance，A)值，结果以3个复孔A值的均值表示。

2.4统计学处理实验结果以±s表示，组间差异性比较采用SPSS10.0统计软件计算。

三、结果

3.1CT对正常大鼠脾细胞和胸腺细胞增殖影响

由表1可知，LPS诱导的脾脏B淋巴细胞和ConA刺激的胸腺T淋巴细胞增殖较正常对照显著增强，差别有显著意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，低浓度时进一步促进其增殖，1μg/ml时对B、T淋巴细胞增殖反应的促进作用均有统计学意义（P<0.05）。随着浓度的增高，出现抑制作用，100，1000μg/ml剂量组对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，1000μg/ml剂量组对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，分别与刺激剂诱导的正常组比较，差异有显著意义（P<0.01）。表1CT体外对正常大鼠ConA诱导的胸腺细胞和LPS诱导的脾细胞增殖反应的影响（略）

3.2CT对CIA大鼠脾细胞和胸腺细胞增殖反应的改善作用

由表2中可知，在CIA大鼠中LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖反应较正常对照显著增强；ConA诱导的胸腺T淋巴细胞增殖反应却较正常对照组明显降低，差别均有显著意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，0.1μg/ml时对CIA大鼠低下的胸腺T淋巴细胞增殖具有明显的改善作用（P<0.05），而高浓度时（100，1000μg/ml）对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.01）。表2CT体外对CIA大鼠ConA诱导的胸腺细胞和LPS诱导的脾细胞增殖反应的影响（略）

四、讨论

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性、系统性自身免***病。RA以关节滑膜炎为主要特征，表现在多种炎性因子的刺激下，关节滑膜细胞类肿瘤样无限增生，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和功能障碍。wWw.gWyoO

到目前为止，RA的致病原因和发病机制尚不清楚。近年的研究发现RA的免***应答是一个免***调节网络，当抗原被提呈后，T细胞激活发生增殖和分化，不同的T细胞亚群及单核细胞分泌不同的细胞因子。这些细胞因子环境、抗原接触情况和人类白细胞抗原基因表型共同调节T细胞的分化、B细胞的成熟和抗体合成、抗原抗体反应以及细胞免***的独特应答。这些细胞分泌的正性调节细胞因子、炎性介质以及自身抗体使自身组织受到攻击，产生自身免***。本研究通过体外实验观察到CT低浓度时对正常SD大鼠的淋巴细胞增殖反应具有促进作用，随着浓度的升高开始出现抑制作用，表明CT对正常大鼠的免***功能具有浓度和机能依赖性的双向免***调节作用。本研究表明，CT对CIA大鼠异常的免***功能具有一定的改善作用，低浓度时（0.1μg/ml）对CIA大鼠ConA诱导的胸腺细胞低下的免***功能具有增强作用，高浓度时（100，1000μg/ml）对LPS诱导的脾细胞亢进的免***功能具有抑制作用。提示CT可能通过改善CIA大鼠异常的免***功能而***RA，其进一步的作用和机制有待深入研究。

【参考文献】

［1］朱蕾，魏伟，郑咏秋.白芍总苷对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞的作用及机制［J］.药学学报，2006，41(2):166.

淋巴细胞篇8

目的:回顾性分析30例早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤的生物学行为特点，为临床放疗靶区的设计提供参考。方法:收集2005年3月至2013年9月间收治的30例经病理证实为早期原发于鼻腔的NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，根据AnnArbor分期标准，所有患者均为IE/IIE期且都有影像检查资料可查，并以影像学为标准分析邻近受侵器官和结构的数目，同时分析颈部淋巴结的转移情况。结果:鼻腔周围结构受侵患者占所有患者的比例为76．7%(23/30)，其具体受侵如下:上颌窦为36．6%、筛窦与鼻咽同为30%、鼻翼为20%、翼突与蝶窦同为10%，翼腭窝及额窦、硬腭、眼眶、口咽同为3．3%;头颈部淋巴结转移的患者占所有患者的比例为46．7%(14/30)，其具体转移如下:I区与II区同为26．7%，III区为10%，VIIa为6．7%，IV区与IX同为3．3%。结论:在早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤放射***时，其靶区的勾画应该考虑受侵和转移几率均较高的结构和区域。

【关键词】

鼻腔;NK/T细胞淋巴瘤;生物学特性

原发于鼻腔、鼻窦的非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一种特殊类型的淋巴瘤，发病率占全部恶性淋巴瘤的2%～10%。亚洲地区发病人群中，以NK/T细胞来源多见，而B细胞来源则较少见［1－2］。放化疗对只伴有局部侵犯的早期病例疗效较好，而局部广泛、区域淋巴结浸润及远处播散病例疗效较差。本研究收集了30例病理证实为原发于鼻腔的早期NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，并以影像学为标准分析其邻近受侵器官和结构的数目，并同时对颈部淋巴结的转移情况进行分析，以研究早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤的生物学特性，为临床放疗靶区的设计提供参考。

1资料和方法

1．1临床资料收集2005年3月至2013年9月间在本院接受***的30例经病理证实为早期原发于鼻腔的NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，男性患者20例，女性患者10例，性别比例为2∶1。患者的中位年龄为45岁，所有患者均根据AnnArbor标准分期为IE及IIE期，其中IE期患者为13例，IIE期患者为17例(见表1)，30例患者都有MRI影像检查资料可查。

1．2***方法因所收集的病例时间跨度较大，30例患者接受的***方式有所差别。其中单纯化疗者9例，单纯放疗者11者，化放疗结合的10例。放疗多采用高能光子线及电子线，照射范围和放疗剂量遵循以下原则:肿瘤局限于一侧鼻腔，未侵犯临近器官或组织的患者照射靶区包括双侧鼻腔、双侧前组筛窦和同侧上颌窦;肿瘤超出鼻腔时，靶区扩大至受累的临近器官或结构，如果前组筛窦受侵，应包括同侧后组筛窦。如果肿瘤临近后鼻孔或侵犯鼻咽，照射野应包括鼻咽。对于淋巴结的处理原则为IE期患者不必做颈部淋巴引流区预防照射，IIE期在原发病灶和受侵器官/结构照射时，需同时做双颈照射。每天按1．8～2Gy常规分割照射，中位剂量为55Gy。早年的化疗以CHOP、ECHOP方案为主，后期以GDP、DICE方案为主。Ⅰ期病例化疗4疗程，Ⅱ期化疗6疗程，如2疗程化疗后评价为无效者改用放疗或更改方案。

1．3影像学受侵的标准30例患者均有原始的MRI影像资料可以查询，且都行MRI的增强扫描。为了避免因不同人员阅读MRI影像资料而造成的观察者间变异，所有影像资料的阅读均由一名经验丰富的影像科主治医师完成。并对影像上临近器官或结构、颈部及咽后淋巴结受侵的判断定义如下:影像上明显的器官和结构受侵犯，T1WI肿瘤呈等信号，信号强度类似或稍低于肌肉;T2WI呈不均匀稍高信号，信号强度高于肌肉但低于鼻黏膜，增强后轻到中度不均匀强化。头颈部淋巴结的判定与上述影像表现一致，或伴有淋巴结融合成团、坏死等征象，如没有上述影像表现则要求淋巴结最大层面的最小直径需大于等于10mm。头颈部淋巴结受侵的分区根据GrégoireV等［3］的最新标准划分。

1．4受侵区域的划分将鼻腔的临近器官或结构划分为上颌窦、筛窦、鼻咽、鼻翼、翼突、蝶窦、翼腭窝、额窦、硬腭、眼眶、口咽。颈部淋巴结的划分则根据受侵的区域分为I区、II区、III区、IV区和IX区(面动脉淋巴结区)。

2结果

鼻腔周围结构受侵患者占所有患者的比例为76．7%(23/30)，不同结构受侵概率如下:上颌窦为36．6%、筛窦与鼻咽同为30%、鼻翼为20%、翼突与蝶窦同为10%，翼腭窝及额窦、硬腭、眼眶、口咽同为3．3%(见表2)。颈部淋巴结区域转移的患者占所有患者的比例为46．7%(14/30)，其具体转移如下:I区与II区同为26．7%，III区为10%，VIIa为6．7%，IV区与IX区同为3．3%(见表3)。

3讨论

鼻型NK/T细胞淋巴瘤绝大部分原发于鼻腔及临近器官，目前文献把原发于鼻腔的结外NK/T细胞淋巴瘤定义为原型，而发生于鼻腔以外的具有相同病理学特征的命名为鼻型，统称鼻型NK/T细胞淋巴瘤。本病早期临床表现不典型，常见症状为单侧鼻腔鼻塞、流涕，伴血涕或鼻出血，头痛或B症状(发热、消瘦、盗汗)。进行性发展可有鼻窦、眼眶、面颊部、颅骨侵犯，表现为鼻腔占位性病变、临近软组织广泛侵犯、溃疡及骨破坏。其中线部位的破坏较为突出，表现为鼻中隔穿孔、外鼻畸形，鼻梁洞穿性损伤或硬腭穿孔，甚至累及面部皮肤。颈部淋巴结播散，甚至向远处肝脾、肺脏、骨髓、肾上腺、等转移播散。晚期多因大出血、全身衰竭死亡。I、II期患者主要采用放疗、单纯放疗或化放疗综合***的5年OS(总生存)率仅30%～40%，单纯化疗则极易产生耐药性，化疗后部分患者虽可获得暂时的缓解，但仍极易复发。目前这种淋巴瘤尚无统一标准的***方案，因此近年来关于临床***的研究较多。和其他淋巴瘤一样，AnnArbor的分期标准仍然在NK/T细胞淋巴瘤分期中应用得最为广泛，但是对AnnArbor的分期标准是否适用于NK/T细胞淋巴瘤仍然存在着争议，目前对于广泛或弥漫性累及的III/IV期分期取得了较一致的认同，但对于较为早期的I/II期，局部侵犯是一个重要的决定因素。像其他结外淋巴瘤一样，AnnArbor分期系统没有考虑肿瘤的大小，I期既包括局限于鼻腔的小肿瘤，也包括广泛累及临近鼻窦和鼻咽结构的巨大肿瘤［4］。按照AnnArbor的分期系统，其中鼻腔NK/T细胞淋巴瘤I－II期发病率可占73%～84%，而NK/T细胞淋巴瘤患者者III－IV期可占68%［5］。因本研究的主要目的是分析早期患者鼻腔周围临近结构受侵犯的规律及头颈部淋巴结的转移规律，而III－IV期患者多为全身广泛转移，因此研究中排除了晚期的患者。

LeeJ等［6］报导本病以男性青壮年多见，本研究患者中男女比例为2∶1，中位年龄为45岁，与报道相似。研究共计30例患者，其中伴有鼻腔周围结构受侵的患者占到76．7%(23/30)的比例，而在这23例出现鼻腔周围结构受侵的患者中，进一步的分析所受侵结构在这23例患者中所占的比例得到以下的数据:上颌窦为47．8%(11/23)、筛窦与鼻咽同为39．1%(9/23)、鼻翼为26%(6/23)、翼突与蝶窦同为13%(3/23)，翼腭窝及额窦、硬腭、眼眶、口咽同为4．3%(1/23);同理，头颈部淋巴结区域转移的患者占所有患者的比例为46．7%(14/30)，进一步分析转移淋巴结在这14例患者中所占的比例得到以下的数据:I区与II区同为57．1%(8/14)，III区为21．4%(3/14)，VIIa为14．2%(2/14)，IV区与IX区同为7．1%(1/14)。由以上的数据可以得出以下的结论:①在鼻腔周围的结构中上颌窦、筛窦与鼻咽为受侵几率较高的部位。②颈部淋巴结中I区与II区的转移几率较高，但也观察到在其他区域也有较小的淋巴结出现，均未达到影像学的诊断标准，不过也不能排除其为阳性淋巴结的可能。③同时发现在鼻翼及面部皮肤受侵的患者中，2013年头颈部淋巴结最新分区中的IX区较易出现淋巴结转移，有关其受侵的数据及转移的几率将做更进一步的统计和分析。④另外也发现一个现象即当鼻咽部受侵时，颈部出现II区淋巴结转移的几率较高，在本次的30例患者中，有9例患者出现鼻咽部受侵，而这9例患者中又有5例伴有II区的淋巴结转移，达到55．5%(5/9)的比例，对于这样的现象本研究也将做进一步分析。由此通过本研究建议在早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤放疗靶区的勾画中，结合个体化***的需求，应该适当考虑以下的因素:①鼻咽部受侵犯的几率较高，鼻咽部是否应当作为一个常规预防照射的区域;②在出现鼻翼部及面部皮肤广泛受侵时，是否应当将IX区作为预防照射的区;③当肿瘤临近后鼻孔或鼻咽部出现明显侵犯时，是否应当将颈部II区作为常规预防照射的区域。

而对于鼻腔NK/T细胞淋巴瘤的预后则有以下的研究，ThieblemontC等［7］认为年龄超过60岁是淋巴瘤的一个不利预后因素。MaHH等［8］认为局部侵犯范围对远期生存有显著影响。LiCC等［9］报道首程***后的CR率是影响预后的重要因素。研究人员对262例结外NK/T细胞淋巴瘤进行预后相关因素分析，多因素分析显示临床分期、区域淋巴结受累、B症状为其预后因素［10］。KimGE等［11］报导在143例I/II期头颈部血管中心性淋巴瘤中，单纯放疗组和综合***组的5年生存率分别为38%和35%，综合***组未提高生存率，主要的***失败是局部的***失败，而传统的全身性化疗未减少局部失控率和全身性转移。JaccardA等［12］认为对于初治的鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者应该争取及早获得完全缓解，近年来探索的含门冬酰胺酶的化疗方案，不论是作为一线方案还是二线方案均取得了较好的效果。

淋巴细胞篇9

1资料与方法

1.1一般资料选择2012-11—2014-11收治的NHLL患者34例，随机分为观察组和对照组各17例。所有患者均行病理检查、免***组化诊断，参照潘瑞彭等人《血液学及血液学检验》[2]的诊断标准确诊为NHLL。34例患者中男性21例，女性13例；年龄12～70岁，平均年龄(38.8±5.3)岁。其中19例有程度不等的发热，体温37.2～39.0℃，热型不规则，给予抗生素***均无效果；有不同程度贫血者14例；有骨痛者5例，其中胸骨疼痛、压痛者3例；有浅表无痛性淋巴结肿大者30例，影像学检查证实肺门淋巴结肿大者10例，腹腔淋巴结肿大者7例，16例患者肝脾肿大。患者一般资料对比差异无统计学意义，具有可比性(P＞0.05)。

1.2方法对照组仅给予化疗方案***，采用的化疗方案包括CHOP(环磷酰胺+阿霉素＋泼尼松＋长春新碱)、LCDVP(L－左旋门冬酰胺酶＋环磷酰胺＋柔红霉素＋长春新碱＋强的松)、BCHOP(环磷酰胺＋平阳霉素＋阿霉素＋泼尼松＋长春新碱)、CAM(环磷酰胺＋阿糖胞苷＋6－MP)、BACOD(环磷酰胺＋平阳霉素＋阿霉素＋地塞米松＋长春新碱)等。观察组在化疗基础上采取联合***方案，10例中枢神经侵犯者，联合采用鞘内注入甲氨蝶呤(MTX)，10mg/次，根据患者病情适当减量，4～8次/d，必要时给予静脉输成分血；当中性粒细胞(ANC)的绝对值＜0.5×109/L，注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF)5μg/(kg•d)，使ANC≥1.5×109/L，5例患者淋巴结肿大者给予加强支持***。

1.3疗效评价完全缓解：患者所有临床症状消失；部分缓解：患者病情症状得以缓解；无效：患者病情症状无明显变化甚至加重[3]。总有效率＝[(完全缓解＋部分缓解)/总例数]×100%。

1.4统计学方法使用SPSS17.0统计学软件，两组患者总有效率的比较采用两样本率的确切概率法进行比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

对照组完全缓解1例、部分缓解6例、无效10例，总有效率41.2％；观察组完全缓解5例、部分缓解10例、无效2例，总有效率88.2％；观察组总有效率明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3讨论

一般来说非霍奇金淋巴瘤从形成到侵犯骨髓发生NHLL的时间都在3年以内，NHLL的病情发展不确定性强[4]，对患者的生命安全造成严重威胁。NHLL的大体临床表现类似于ALL，具有十分复杂的临床病症特点，两者最主要的区别在于NHLL患者往往先有淋巴瘤的表现，恶性细胞在骨髓中出现的时间早于外周血，骨髓中的淋巴瘤细胞胞体大小不等、形态各异，需重视并综合分析NHLL疑似患者的各项检查指标，特别是骨髓检查和血象，一般当恶性淋巴瘤患者出现发热、贫血、骨痛、肝脾肿大、浅表无痛性淋巴结肿大等症状体征，并伴有明显白细胞计数异常、血小板下降时，需高度警惕NHLL的可能性。骨髓活检的准确率较高，可作为辅助检点项目。

淋巴细胞篇10

关键字：类风湿性关节炎；T淋巴细胞；细胞募集。

ABSTRACT:Lots of T l cells infiltrate into the inflamed synovium and play an important role in the starting and sustaining pathological changes。But the T cell must migrate into the synovium from the peripheral blood，so the mechannism of which is very critical。Here we summarize the process of T cell recruited into the synovium，according to the recent studies。

KEY WORDS: rheumatoid arthritis;T lymphocites; recruitment;

类风湿性关节炎(RA )是以关节及关节软骨损伤为特征的慢性自身免***性疾病。其基本病理改变为滑膜炎，在病变部位大量的炎性细胞形成异位的淋巴样微结构，例如生发中心，其中的各种炎性细胞及其所产生的炎症因子构成局部病变微环境，在这一微环境中，各种因素相互影响，从而维持着基本的病理改变。其中作为主要的细胞成分之一，T细胞在病灶中大量浸润，然而其在RA病理生理过程中的作用一度被质疑，[1]因滑膜中的大量炎症因子非源于T细胞；但随着研究的进一步进展，其在RA中的作用正逐渐被认识，如在早期RA病人滑膜组织中的炎性细胞因子来源于T细胞[2]，而T细胞也与病变部位的其他细胞（如单核-巨噬细胞）相互接触的方式调节其他细胞生成炎性细胞因子而促进炎症[3]。由上我们可以发现T细胞通过浸入滑膜组织而发挥其病理生理作用。为了维持病变滑膜组织的细胞结构，从而维持基本的病理改变，进而维持关节及关节软骨持续损害，病变滑膜组织通过分泌一系列的细胞因子以募集T细胞进入滑膜组织。多种因素参与了此过程，因此广泛深入地理解这些因素及其相互作用，对于更好地防治RA有着极其重要的意义。为此我们整理相关文献对这一机制进行描述。

一、滑膜组织募集T淋巴细胞的过程

病变滑膜组织中的细胞产生大量的趋化性细胞因子表达于病变滑膜组织的高内皮静脉内皮细胞上，当外周血自身免***性T淋巴细胞经过高内皮静脉(High endothelial venules ，HEVs)处，其表面标志与内皮细胞上相互分子相互作用，并发生一系列信号转导，致T细胞形态和功能发生改变，穿越血管壁进入血管下层，并在组织中继续迁移，直至达到相应的位置。其中最为重要的过程是其跨越血管内皮（TEM）的过程，其由以下四步组成：滚动（Tetherring/rolling），活化(activation)，稳固粘附(Firm adhesion)，跨越(Transmigration)。大量的分子物质参与滑膜组织募集T细胞，其按其作用可分为参与滑膜募集T细胞的因素和调节参与滑膜募集T细胞的因素。

二、参与滑膜募集T细胞的主要因素

1、毛细血管后微静脉

淋巴结深皮质区的毛细血管后小静脉由高立方形内皮细胞组成 ，来自血液的淋巴细胞可以由此进入淋巴组织 ，参与淋巴细胞的再循环 ，这种小静脉称为高内皮小静脉（high endothelial venules，HEVs）。高内皮静脉生理状态下存在于淋巴组织参与淋巴细胞归巢，正常情况下滑膜组织中缺乏 HEVs，但慢性炎症可使活化的内皮细胞发展为 HEVs。内皮细胞激活的机制是局部产生的细胞因子（如 IFN 、IL-1、TNF等）上调E及P选择素，VCAM-1及ICAM-1和其他粘附分子。其内皮细胞管内侧高表达粘附分子及趋化性细胞因子，对选择性粘附T淋巴细胞起重要作用。

2、粘附分子

2.1 选择素

选择素包含E，P及L选择素。其作用可归纳为（1）降低T细胞在血管壁滚动速度，从而使T细胞表面分子物质与内皮细胞上对应分子物质有足够的时间相接触;（2）当选择素与其配体相结合后，可诱导T细胞内的趋化性细胞因子受体表达于细胞表面（如CXCR4[4]）。但选择素所介导的粘附是一种不稳定的粘附，如果没有继发的整合素的介导的稳固粘附，那么淋巴细胞将继续沿着管壁滚动不能最终完成跨越血管壁。有人在对基因敲除E，P及L选择素小鼠的研究中发现，其并不能阻止慢性关节炎的发生及病变的严重性，只起到延缓白细胞在组织中的聚集。PSGL-1为三种选择素主要受体。Kazuyuki Atarashi等[5]研究发现PSGL-1介导的滚动，能诱导T细胞内信号传导诱导LFA-1活化。

2.2

整合素及免***球蛋白基因超家族

选择素家族参与T细胞粘附于内皮的起始阶段，而整合素和免***球蛋白超家族则是稳定T细胞和内皮细胞之间的相互作用的重要因素，整合素分子还参与滑膜中淋巴细胞与细胞外基质的相互作用，使炎症细胞在RA的滑膜中聚集。其作用通过两个信号途径实现的[6]：一方面，在趋化性细胞因子的诱导下，细胞内信号通过整合素传导，使其活化，从而调节整合素与细胞外配体的亲和力，整合素发生簇集，从而形成稳定粘附，这是由内向外的信号传导过程(inside-out signaling);另一方面，整合素与配体结合后把胞外信号传人细胞内，导致细胞骨架重组，对细胞迁移进行调控，这是由外向内的信号传导过程(outside-in signaling)。目前对整合素所介导的信号传导进行了深入的研究，发现多种信号转导蛋白参与其信号传导过程。参与的整合素主要有LFA-1，VLA-1及VLA-4，它们在血管内皮上的配体是免***球蛋白超家族成员(ICAM-1，ICAM-2，VCAM-1)。α4整合素也能介导淋巴细胞在血管壁滚动。有人[7]在应用LFA-1基因敲除小鼠诱导关节炎的研究中，发现LFA-1基因的缺失彻底地抑制了胶原诱导关节炎发生。近年[6]α4整合素拮抗剂（Natalizumab）在多发性硬化及炎性肠病应用取得了良好的临床疗效，但未有其在RA应用的研究报道。

3、趋化性细胞因子及其受体

趋化性细胞因子及其受体是目前研究的热点，趋化性细胞因子控制着渗出T细胞的选择性以及被选择T细胞的稳固粘附。同时趋化性细胞因子在细胞迁移中提供化学趋化梯度，从而确定了细胞迁移的方向。趋化性细胞因子由滑膜组织中细胞产生，T细胞则表达趋化性细胞因子受体。大量的趋化性细胞因子参与了T细胞的募集，其中主要有MCP-1/CCL2，MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5， CCL18、IP-10/CXCL10、ITAC、SDF-1 /CXCL12、CXCL16、MIG/CXCL19及fractalkine / CX3CL1等。而病变滑膜中的T细胞主要表达受体有：CXCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CX3CR1、CXCR4及CCR7等[8、9]。Toshihiro Nanki等[10]用单个细胞RT-PCR法检测滑膜细胞趋化性细胞因子受体mRNA发现CXCR4基因表达高于其他趋化性细胞因子，流式细胞仪检测T细胞表面趋化性细胞因子受体也有相同的结果.一种趋化性细胞因子可以有多种趋化性细胞因子受体，而一种趋化性细胞因子受体也可有多种趋化性细胞因子，但CXCL12目前只发现一种受体CXCR4。T细胞可以同时表达多种趋化性细胞因子受体。值得指出的是研究[11]发现滑膜中的T细胞表达CCR7，CCR7正常情况下表达于中央记忆T细胞（central memory T cell），参与T细胞归巢淋巴组织，从而分化成记忆性T细胞，在健康人群CCR7不表达于效应记忆T细胞（effector memory T cell），而在RA病人中存在大量表达CD4+CD28-T细胞，研究发现RA中部分CD4+CD28-T细胞共同表达CCR7及CCR5，因而同时具有向滑膜组织及淋巴组织迁移的能力，而IL-12能通过上调CCR5表达，调节CD4+CD28-T细胞向滑膜组织迁移。面对众多的趋化性细胞因子，在体外单个趋化性细胞因子TRANSWELL试验中，上述趋化性细胞因子均能趋化T细胞；但有学者[12] 在同时检测多个趋化性细胞因子对T细趋化作用研究中发现CCL5， CCL2 和 CXCL12趋化T细胞中的能力最强，其中CCL2为最强。CCL18则趋化naiveT细胞。T细胞表面趋化性细胞因子受体与细胞极化后的类型相关[13]，如CXCR3和CCR5表达在Th1细胞上，而CCR4及CCR3则表达在Th2细胞上，而滑膜组织内聚集的T细胞主要为表达CXCR3及CCR5的Th1细胞。近年来很多学者[14]研究趋化性细胞因子及其受体在RA中的病理作用，采用单个趋化性细胞因子(受体)基因敲除小鼠和应用趋化性细胞因子(受体)拮抗剂发现多种趋化性细胞因子及其受体的单一阻断均能减轻关节病变，但同时有学者[15]认为这些结果是存在局限，指出这些数据并不能代表长期效应，因为众多的趋化性细胞因子及其受体有可能在一定时间后代偿其他趋化性细胞因子及其受体被拮抗后的效应。

三、细胞因子网络对滑膜组织募集T细胞的调节

众多的细胞因子参与了滑膜组织募集T细胞的调节，他们通过对粘附分子，趋化性细胞因子及其受体表达的调节，从而影响滑膜组织对T细胞的募集，其中按其作用可分为正调节细胞因子及负调节细胞因子。

1、正调节细胞因子

参与的细胞因子主要有TNF、IL-1及IL-15，其机制为：随着近年来肿瘤坏死因子抑制剂在RA病人中的应用，人们对TNF在滑膜组织募集T细胞作用的认识也越来越深入，其的主要作用[16-20]:（1）诱导内皮细胞表达粘附分子（E选择素，ICAM-1及VCAM-1），促进T细胞与血管内皮粘附、渗透; (2) 促进某些趋化性细胞因子的合成与分泌，如在应用抗TNF-α抗体后，滑膜组织的IL-8和MCP-1表达显著减少，而滑膜RANTES、MIP-1α及MIP-1β表达却未能显著的减少，提示TNF-α选择性调节一些chemokine表达。而与之对应的是应用TNF-α抑制剂后，观察到外周血中的CXCR3+T细胞的持续聚集。（3）TNF-α还可促进滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生IL-1及TNF-α本身。IL-15[21-23]也是目前研究较深入的细胞因子，可由巨噬细胞及内皮细胞合成并分泌，其对T细胞同时具有趋化与活化两种作用。 SCID小鼠模拟人RA模型的实验证实，内皮细胞产生IL-15能增进T细胞穿过血管内皮移向滑膜炎症部位。IL-15能诱导T细胞表达LFA-1；IL-15能促进T细胞表达CCR1、 CCR4、 CCR5、 CCR2a、CCR2b、CXCR3、CXCR4及CXCR6；IL-15能促进T细胞合成RANTES， MIP-1α， and MIP-1β，IL-8及IP-10；它还能刺激TNF-α、IL-6和IL-17等细胞因子的产生。IL-1能促进内皮细胞表达细胞粘附分子（ICAM-1，VCAM-1，E-slectin），刺激滑膜组织细胞合成和分泌趋化性细胞因子，同时IL-1能刺激巨噬细胞合成TNF。[24]

转贴于 2、负调节细胞因子

参与的细胞因子主要有IL-10及IFN-β，其作用为IL-10能抑制单核-巨噬细胞合成TNF-α， IL-1， IL-6， IL-8的合成；抑制MIP-1α及MIP-1β合成；促进可溶性TNF受体释放；抑制内皮细胞表达ICAM-1和VCAM-1[25、26]。IFN-β能下调促炎细胞因子IL-1β及TNFα表达，上调IL-10及IL-1Ra表达，下调粘附分子的表达，抑制T细胞迁移。[27]

四、总结

滑膜组织募集T细胞是由滑膜组织各种细胞及其所分泌的各种炎症因子相互调节下完成的，滑膜细胞产生多种细胞因子（如TNF，IFN及IL等），细胞因子又促使滑膜组织合成和分泌趋化性细胞因子以及诱内皮细胞表达粘附因子，从而募集外周血T细胞进入滑膜组织，而进入滑膜的T细胞又可以通过分泌炎症因子和以与其他细胞相接触的方式调节其他细胞合成和分泌炎症因子，从而形成循环，形成持续的T淋巴细胞及其他炎症细胞进入滑膜，从而维持关节局部的炎症。由于众多的炎症因子参与了此过程，形成了多个促炎途径，因此其单一阻断某种炎症因子，很难阻断滑膜组织对T淋巴细胞的募集。近年来TNF拮抗剂临床应用后，观察到大量原本应当浸润在滑膜组织中的T细胞聚集在外周血中，说明了TNF抑制剂药理作用之一为阻断了滑膜组织募集T细胞，然而[28]临床上只有60-70% RA 病人对TNF抑制剂起反应，而且按照ACR20标准大多数病人只表现出部分反应。又如Ernestam S等[29]研究发现滑膜中1L-15的表达不受TNF拮抗剂的影响。因此有学者[30]联合应用TNF拮抗剂，IL-1拮抗剂及OPG***小鼠TNF诱导关节炎后发现，抗炎作用明显高于单个药物应用。因此也许多种炎症因子拮抗剂联合应用将成为类风湿性关节炎***的新方向。

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