学文网细胞膜篇1
具体步骤：1、倒入水中，让细胞吸水胀破；
2、放入旋转离心机中离心；
3、取上层清液过滤，就能得到细胞膜。
原因:哺***动物成熟的红细胞内只有血红蛋白，无核无细胞器，细胞膜主要成分是磷脂，质量分数比蛋白质小，离心后会分层，细胞膜处于上层清液中。鸡鸭血中的细胞器也会胀破，离心后同样能分离。
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细胞膜篇2
细胞分组及处理同，用Trizol提取细胞总RNA，cDNA合成体系20μl，小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶200U，二硫苏糖醇(DTT)0.2μmol/L，RNA酶抑制剂(RNase抑制剂，RNasin)20U，四种脱氧核苷酸混合物(dNTP)20nmol/L，随机引物100ng，RNA模板1μg，25℃10min，42℃60min，95℃1min灭活逆转录酶，冰浴1min。PCR反应引物为，DCN上游引物:5'ACCGAAATCAAAGATGGAGACT3'下游引物:5'ATCAGCAATGCGGATGTAGGAG3'扩增产物为348bp，反应体系25μl，94℃预变性5min，94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，最后72℃5min结束反应。β-actin上游引物:5，ACGGATTTGGTCGTATTGGG3，下游引物为:5，TGATTTTGGAGGGATCTCGC3，扩增产物为230bp。取10μl扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外灯下观察并照相，凝胶***像分析仪分析，根据DCN与β-actin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。
2、结果
2.1两株子宫内膜癌细胞内PCNA的表达
显微镜下可见，PCNA阴性细胞核无着色，胞质呈淡黄色。阳性细胞整个核内分布着大小均匀的浅黄色、黄色或棕黄色细小颗粒。细胞计数结果显示，未经处理的两株子宫内膜癌细胞内PCNA阳性细胞数目相当，经RG和RA两种信号通路抑制剂作用后，Ishikawa细胞变化明显，PCNA阳性率明显低于相同处理的HEC-1A细胞组(P=0.022、0.043)，二药合用后两株细胞PCNA阳性率差异更为显著(P=0.007)。在Ishikawa细胞内，与未加药的空白组比较，两种抑制剂单用均可降低PCNA阳性表达率(P=0.036、0.027)，合用效果更为显著(P=0.001)，而在HEC-1A细胞内，无论抑制剂单独或合用PCNA阳性率与空白组比较变化均不大，作用效果不明显(P=0.061、0.064和0.059)，见表1。
2.2抑制剂对两株细胞DCN蛋白表达的影响
从***1中可见，两株子宫内膜癌细胞中均存在DCN蛋白的表达，经10μmol/LRG及10μmol/LRG联合10μmol/LRA作用24h后，Ishikawa细胞内DCN蛋白表达量呈不同程度的增多，尤其以两种抑制剂合用增加效果更为显著。定量分析结果显示，未经处理的Ishikawa细胞内DCN的灰度值为0.191±0.0258，经RG及RG联合RA作用后，灰度值则分别上升至0.288±0.0899(P=0.031)和0.437±0.0165(P=0.002)。相比之下，HEC-1A细胞内DCN蛋白的表达量则受抑制剂影响较小，A、B、C组DCN蛋白灰度值分别为0.494±0.0216、0.477±0.0159和0.459±0.0821(P=0.072和0.068)。
2.3抑制剂对两株细胞DCNmRNA表达的影响
从***2中可见，两株子宫内膜癌细胞内均有DCNmRNA的表达，10μmol/LRG及10μmol/LRG联合10μmol/LRA作用24h均可明显上调Ishikawa细胞内DCNmRNA的表达水平，尤其以二药合用效果更为显著。半定量分析结果显示，A组Ishikawa细胞内DCNmRNA的比值为0.258±0.0334，经RG及RG联合RA作用24h后，比值分别上升至0.595±0.0642(P=0.017)和0.858±0.0706(P=0.01)。而HEC-1A细胞内DCNmRNA的表达则受抑制剂作用影响较小，对照组及RG或RG联合RA组内DCNmRNA的灰度比值分别为0.775±0.0173、0.751±0.0353和0.777±0.0324(P=0.064，P=0.057)。
3、讨论
细胞膜篇3
单层膜的细胞器有：液泡、溶酶体、内质网、高尔基体。细胞器是细胞质中具有特定形态结构和功能的微器官，也称为拟器官或亚结构。其中质体与液泡在光镜下即可分辨，其他细胞器一般需借助电子显微镜方可观察。细胞中的细胞器主要有：线粒体、内质网、中心体、叶绿体，高尔基体、核糖体等。它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常的工作运转。其中，叶绿体只存在于植物细胞，液泡只存在于植物细胞和低等动物，中心体只存在于低等植物细胞和动物细胞。
（来源：文章屋网 .wzu）
细胞膜篇4
肾纤维化是大多数免***和非免***性肾脏疾病的共同病理特征，是多种肾脏疾病进行性肾功能丧失的最后通路。当肾纤维化已经启动后，若不给予适当的***，那么即使在起始致病因素去除后纤维化仍会进行，这说明继发性机制在后续肾损伤中起着重要的作用［1，2］。近年来由于细胞分子生物学技术的发展，推动了对肾脏细胞生物学研究的深入，从而证实肾脏细胞的活化增殖对进展性肾病的发生、发展有着重要的影响。而在慢性进展性肾小球疾病中，肾小球固有细胞不但是受害的靶细胞，而且通过细胞活化产生多种细胞因子、生长因子等活跃的调节分子参与疾病的发展过程。它们可以直接合成ECM，也能够产生蛋白酶调节ECM的代谢。
1 肾小球系膜细胞
系膜细胞是维持正常肾小球结构和功能需要的三种肾小球细胞之一，目前已知系膜细胞至少有2种，一种是平滑肌样细胞，占绝大多数，为肾小球固有细胞；另一种是Ia-阳性的吞噬细胞，为骨髓源性细胞。肾小球系膜细胞是多种细胞因子的分泌源，同时又是多种细胞因子作用的主要靶细胞，具有许多重要的生理功能，如分泌细胞基质，产生细胞因子，通过收缩与扩张作用，参与肾小球血流动力学的调节，其所具有的吞噬功能又使它在肾小球系膜区大分子物质的清除中扮演重要角色，此外它还参与免***调节功能，是肾小球中功能最为活跃的一类固有细胞。正常情况下，肾小球系膜细胞仅行使收缩、吞噬及维持基质的正常代谢等功能。在病理情况下，系膜细胞可通过自分泌或旁分泌形式释放多种细胞因子，使细胞外基质产生增加，而某些高浓度的细胞因子又反过来促进系膜细胞的增殖，进而加重肾小球的损害。系膜细胞是分泌产生细胞外基质的主要细胞之一，而系膜基质聚集则是肾小球硬化机制的关键。
系膜细胞损伤后，细胞及基质发生一系列的改变,参与肾小球纤维化的形成，包括表型转化、系膜细胞的过度增生、系膜基质产生过多和降解减少、系膜细胞异常凋亡等。（1）表型转化：在病理情况下，损伤后的系膜细胞由静止状态转而表现为细胞增殖活跃，表达a-平滑肌肌动蛋白和胎儿型肌球蛋白，具有了肌纤维细胞样特性，增强合成ECM蛋白，引起细胞外基质增多。（2）系膜细胞的过度增生：表型转化后的系膜细胞，可导致各种细胞因子释放增加，一方面导致系膜细胞过度增生以及基质合成显著增加以及降解减少；同时导致其他各种固有细胞损伤，肾小球损伤进行性发展。（3）系膜基质产生过多和降解减少：肾小球固有细胞产生或者调节的TGF-β、结缔组织生长因子、降解酶以及其抑制系统等共同作用导致：①ECM合成增加；②降解减少；③ECM的沉积［3］。（4）系膜细胞异常凋亡：系膜细胞过度凋亡可能是晚期肾小球纤维化肾小球细胞丢失的主要原因。慢性肾病时多种致病因素，如脂质异常、RAS作用过强和高血糖等，均可诱导系膜细胞凋亡。
Border把肾小球硬化的病理特点归纳为：（1）系膜基质的增多或系膜区增宽；（2）GBM增厚及不规则；（3）肾小球毛细血管襻的闭塞并伴滤过面积减少［4］。ECM从形态上分为肾小球基底膜及系膜基质两部分，实验研究可以看到系膜细胞及基质增多的相关性。系膜基质的生化成分包括Ⅳ型胶原、糖蛋白和蛋白多糖。体外培养证实肾小球的三种固有细胞均能产生ECM，其中以系膜细胞为最强，系膜细胞产生系膜基质，正常状态下产生和消除处在动态平衡，当系膜细胞或清除防御功能受抑制时，便可产生过多的系膜基质［5］。过量聚积的系膜基质可以导致毛细血管被挤压、闭塞、滤过面积减少，最终导致肾小球硬化的发生及肾功能衰退。系膜基质的聚积还可导致系膜清除功能障碍，使进入系膜区的致病因子不能被及时清除，而导致肾损害进一步加重。ECM通过与细胞膜上的特异受体整合素结合，对细胞的增殖、分化、物质合成等生物功能具有重要调控作用［6］。因此，ECM的异常聚积，也可导致细胞功能异常，加重肾脏损害。
肾小球系膜细胞及基质增多是多种类型肾小球疾病常见而又突出的病理形态学特征，是肾小球走向纤维化的重要因素之一，最终导致肾小球纤维化和间质纤维化。体内外多种物质包括内毒素、免***复合物、糖基化终末产物、各种炎性介质和细胞因子都可导致肾小球系膜细胞增殖，而增生的系膜细胞分泌的ECM沉积，逐渐使肾小球纤维化。另外各种原发性病理损伤也可通过不同疾病类型特异的病理过程，使部分肾小球受到损害、功能性肾单位减少，进而引起肾小球发生一系列的代偿性改变，如系膜细胞肥大、增殖及细胞间质合成代谢加强等。这种肾小球系膜的代偿性变化的结果，反过来又会造成另一部分肾小球的损害、功能性肾单位进一步减少以及剩余功能性肾小球的进一步代偿，最终导致了肾小球硬化的肾脏病理改变［7］。越来越多的研究表明，一些细胞因子在肾小球这一继发性病理发展过程中起关键作用，而给予一些细胞因子的拮抗剂，如抗体，或抑制性的细胞因子可溶性受体，可有效地抑制肾小球系膜细胞在体内或体外的增殖以及系膜细胞间质成分的合成与分泌，防止动物实验模型中肾小球的继发性病理改变，使肾功能得到明显的改善。
2 肿瘤坏死因子-α
TNF是机体炎症与免***的重要调节因子，且对人及动物肿瘤细胞有细胞毒性和细胞生长抑制作用，活化单核巨噬细胞产生的TNF称TNF-α，活化T淋巴细胞也可产生TNF称TNF-β，旧称淋巴毒素。TNF除了能引起体内某些肿瘤组织的出血坏死和体外直接杀伤某些肿瘤细胞外，还有许多生物学活性：（1）对肿瘤细胞的作用；（2）致热作用；（3）对白细胞的作用；（4）对内皮细胞作用；（5）对巨噬细胞/单核细胞的作用；（6）促进纤维母细胞增殖；（7）抑制脂蛋白脂酶活性；（8）抗感染作用；（9）抗病毒作用。近年来的研究表明，肾脏的多种细胞，包括肾小球系膜细胞近曲小管上皮细胞及肾脏中的血液细胞均可产生TNF-α［8］。Mathison等应用动物实验放射自显影方法研究显示，静脉注射已标记的LPS后，在肾脏中浓度较低。然而，静脉注射未标记的内毒素后，肾脏中TNFmRNA的表达量及时间较其他组织（包括肝脏）高且时间长［9］。Baudl等应用分子杂交Northern blot方法，进一步证实了未经刺激的系膜细胞有微弱TNF-αmRNA表达［10］。而系膜细胞给LPS激活后，TNF-α基因表达呈两条杂交带，一条粗带和一条窄带。至少1h后便才可测得TNF-α的活性，2h达高峰，以后便逐渐下降［11］。系膜细胞不仅在内毒素刺激下产生TNF-α，而且在补体片段，免***复合物、血小板源生长因子、表皮生长因子、血小板活化因子及白细胞介素-1（IL-1）等刺激下也可分泌TNF-α［12］。TNF-α对系膜细胞有多种作用，通过许多不同途径影响系膜细胞的功能和结构：（1）TNF-α单独或与IL-1协同增加系膜细胞合成PGE2、PGE2a和6-keto-PGEIa；（2）诱导IL-1的产生；（3）活性氧的释放；（4）凝血机能的改变；（5）TNF-α有促进系膜细胞增殖的作用；1985年，Kobayashi观察，TNF-α浓度与系膜增殖性肾炎病理改变程度有关，提示TNF-α是导致系膜增殖性肾炎细胞增殖、硬化、疾病恶化的重要因素之一［13］。
3 核因子-κB
NF-κB最早是从B细胞的核抽提物中发现的一种能与免***球蛋白κ链基因的增强子κB序列特异性结合的白因子，因而称为NF-κB。NF-κB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，参与基因尤其是与机体防***反应有关的基因表达调控。除免***细胞外，全身许多组织细胞，包括肾脏的组织细胞在内均存在NF-κB的转录调控。随着对NF-κB作用机制的更深入了解，更多的药物用于NF-κB的研究，将利于阐明某些疾病的分子机制。
肾小球系膜细胞增殖在各种肾小球疾病的发生发展中扮演着重要的角色，近年研究发现，NF-κB与肾小球系膜细胞增殖和分泌炎症因子密切相关。GuiJarroc等［14］发现体外培养的肾小球系膜细胞中NF-κB的活化能促进系膜细胞增殖，且对系膜细胞分泌的多种化学因子起着中心调节作用。有学者将NF-κB反义寡核苷酸经左肾动脉导入抗Thy1.1模型鼠中，发现可减少系膜细胞增生和TNF-α等细胞因子的表达［15］。近期研究证实，NF-κB能调节体外培养的系膜细胞分泌粘附分子，体内实验发现在脂多糖（LPS）诱导的小鼠中，抗氧化剂乙酰半胱氨酸在阻抑小鼠肾小球系膜细胞NF-κB活化的同时亦抑制ICAM-1的表达［16］。单核细胞趋化因子-1（MCP-1）是参与肾小球炎症的重要因子，文献报道肾小球系膜细胞内NF-κB活化与MCP-1表达显著相关，把NF-κB亚基蛋白的反义寡核苷酸片段转移至培养中的人类肾小球系膜可明显降低MCP-1mRNA的表达［14］。Ruiz［17］等报道，在实验性免***复合物性肾炎，血管紧张素正是通过激活NF-κB促进MCP-1合成参与肾脏组织中单核细胞的募集反应，参与肾组织的炎症反应。上述研究提示，NF-κB与肾小球系膜细胞关系密切，通过调节NF-κB的活性可调控系膜细胞的增殖及其炎症因子的分泌。
TNF-α是NF-κB的重要诱导因子，参与构成NF-κB的正反馈环，TNF-α的表达不仅诱导NF-κB激活，而且由NF-κB活化对其进行转录调控。NF-κB活化后可增强TNF-α基因的转录，使TNF-α产生和释放增多，进而再次激活NF-κB产生级联瀑布效应加重与NF-κB相关疾病的恶化。另外TNF-α作为一种前炎症细胞因子可以自分泌和旁分泌的形式促进系膜细胞增殖，且可诱导系膜细胞分泌其他细胞因子，故两者在肾小球疾病向纤维化方向发展具有协同作用。是肾纤维化病理进程中一对重要的因子，有着十分重要的理论和现实意义。
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细胞膜篇5
【关键词】 系膜细胞；衰老；细胞表型；p21waf1/cip1/sdi1
the characteristic and significance of rat mesangial cells with advancing age
zhuo li, cai guang?yan, liu fu?you, et al.
department of nephrology, kidney institute & key lab of pla, chinese general hospital of pla, beijing 100853, china
【abstract】 objective to investigate the characteristic of rat mesangial cells with advancing age. methods male wistar rats aged of 3, 12, 24 months were used. the rat mesangial cells were processed for mtt assay and senescence associated β?galactosidase (sa?β?gal) staining. the expression and location of p21waf1/cip1/sdi1 in mesangial cells were studied by immunofluorescence. the mrna and protein levels of p21waf1/cip1/sdi1 were detected by western blot and/or rt?pcr, respectively. results the ability of proliferation was decreased in rat mesangial cells with advancing age(p＜0.05).the expression of senescence associated β?galactosidase activity was increased in mesangial cells with advancing age. percentages of sa?β?gal staining positive cells were (11.9±3.6)% versus (39.0±4.0)% versus (86.9±7.4)% (p＜0.05) in young, middle and aging glomerular mesangial cells. the p21waf1/cip1/sdi1 protein showed localization in nucleus in mesangial cells, and the staining intensity of p21waf1/cip1/sdi1 in mesangial cells in old animals was markedly increased, as compared to that in young and middle age rats (p＜0.05).the mrna levels of p21waf1/cip1/sdi1 was significantly increased in mesangial cells in old animals, as compared to that at the age of 3 and 12 months, meanwhile the p21waf1/cip1/sdi1 proteins expression were dramatically increased with advancing age (p＜0.05). conclusions the cellular phenotype and function are changed in rat mesangial cells with advancing age. the rat mesangial cells appear replicative senescence with advancing age.
【key words】 mesangial cells; senescence; phenotype；p21waf1/cip1/sdi1
多数学者认为，器官衰老是由于其固有细胞功能减退所导致，肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。为了能客观真实地反映肾小球系膜细胞随衰老的变化，排除体外培养环境对细胞表型的影响，本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外培养原代的肾小球系膜细胞，观察系膜细胞是否随机体增龄而衰老，以及老年大鼠系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1表达的变化，为进一步研究系膜细胞衰老的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 原代大鼠系膜细胞培养 不同鼠龄雄性wistar大鼠〔总医院实验动物中心提供，scxk(京)2005?0013〕15只，分3月龄组、12月龄组及24月龄组，每组各5只，无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块，放于重叠的3层不锈钢筛网上研磨，镜下观察，若见98%以上的肾小球脱去包曼氏囊，视野中基本上无肾小管存在，即可停止冲洗。收集第2层筛网上的组织移入离心管，v型胶原酶消化后，应用15％胎牛血清的rpmi 1640培养液，37℃、5％co2条件下培养原代的系膜细胞，约7 d后第1次传代，传代的细胞24 h全部贴壁，生长迅速，形态为梭形或不规则星形，3～4 d已汇合成片，纯度极高，经鉴定结蛋白(desmin)阳性、抗ⅷ因子抗体阴性，传至第3代，用于实验。
1.2 四甲基偶氮唑盐（mtt）法检测细胞增殖能力 系膜细胞生长至80％融合，0.25％胰酶消化，计数后接种于96孔板，2 000个细胞/孔，细胞贴壁后，继续培养24、48、72、96、120 h，加入mtt(5 mg/ml)10 μl 孵育4 h后，加二甲基亚矾（dmso）200 μl/孔裂解细胞，避光10 min，于492 nm波长记录吸光度值。
1.3 衰老相关半***糖苷酶活性（sa?β?gal）染色 接种于6孔板中的各组细胞，待细胞生长至80％汇合，用磷酸盐缓冲液（pbs）清洗3次，于室温固定细胞5 min，pbs液清洗3次后，加上新配制的含1mg/ml 5?溴?4?吲哚?β?d半***糖苷（x?gal）（美国progrma公司）的sa?β?gal染液，置37℃（无co2）温育12～16 h，pbs液清洗3次后，观察细胞胞浆中蓝色沉淀，用数码相机拍照。
1.4 rna提取及反转录聚合酶链反应（rt?pcr）分析 利用trizol一步法提取肾小球系膜细胞总rna，进行rt?pcr。采用的引物序列如下：p21waf1/cip1/sdi1上游引物为：5′? ctg cca gct gcc cct cta ttt tg ?3′，下游引物：5′? cat ctt ggc ctg gct cct tgt a ?3′，产物片段大小为373 bp；选用大鼠甘油醛?3?磷酸脱氢酶（gapdh）为参照，上游引物：5′? tgc acc acc aac tgc tta gc?3′，下游引物：5′?ggc atg gac tgt ggt cat gag?3′，产物片段大小为191bp(北京赛百盛公司合成)。反应条件为94℃(5 min)［变性94℃(45 s)58℃退火(45 s)延伸72℃(45 s)］×30个循环72℃(7 min)。用alphalmagertm 2200凝胶***像分析系统(美国alpha公司)，进行半定量分析。
1.5 蛋白质提取及western印迹 将收集的细胞加入200 μl预冷的蛋白抑制率(ripa)裂解液进行匀浆，4℃ 12 000／min离心25 min，吸取蛋白，经micro bca protein kit测蛋白浓度。取100 μg总蛋白，加2×十二烷基磷酸钠（sds）上样缓冲液，100℃变性 5 min。进行12%十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds?page)分离，将胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭4 h，加p21waf1/cip1/sdi1小鼠单克隆抗体(美国santa cruz公司产品)4℃过夜，二抗室温孵育1 h，tris缓冲液（tbst）洗后用化学发光显影(ecl)(美国santa cruz公司产品)显色。所得结果以β?actin (美国santa cruz公司产品)为参照，用uvp?2000 凝胶***像分析系统(美国基因公司)进行半定量分析。
1.6 大鼠原代系膜细胞间接免***荧光染色 不同组细胞贴壁后，用3％多聚甲醛＋2%蔗糖37℃固定10 min，pbs洗3 遍，冰上透化10min，pbs洗3遍，1％牛血清白蛋白（bsa）冰上封闭10 min，p21waf1/cip1/sdi1小鼠单克隆抗体，37℃孵育1 h，4℃过夜，含吐温20的tbst洗10遍，tritc标记的山羊抗小鼠igg，避光室温孵育1 h，tbst洗10遍，荧光显微镜下照相。
1.7 统计学处理 使用spss11.0软件进行统计分析，计量资料使用x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 不同月龄大鼠原代系膜细胞生长及表型特征 3、12及24月龄大鼠的原代系膜细胞均为长梭形或不规则星形，贴壁后生长迅速，约3～4 d后可传第1代。传代后，3、12月龄大鼠的系膜细胞仍保持旺盛的增殖能力，约2～3 d传1代，3月龄大鼠系膜细胞可传20代左右；而12月龄大鼠系膜细胞可传10代以上。24月龄大鼠的系膜细胞生长速度明显较3及12月龄大鼠系膜细胞减慢，约5～7 d才可传1代，群体倍增时间较前者系膜细胞延长1倍以上。而且传至第2～3代后，细胞肥大，形态变扁平、伸展，代谢减慢、生长停滞，失去增殖和传代能力。
2.2 不同月龄大鼠原代系膜细胞增殖能力 mtt法检测结果显示，24月龄大鼠系膜细胞72，96及120 h的od值（0.314±0.05，0.385±0.06及0.456±0.08）显著低于3月龄大鼠系膜细胞（0.430±0.03，0.556±0.04及0.671±0.05）及12月龄大鼠系膜细胞（0.425±0.04，0.543±0.05及0.657±0.06）相应时间点的od值（p＜0.05）；3月龄与12月龄间比较无统计学差异(p＞0.05)。
2.3 不同月龄大鼠原代系膜细胞sa?β?gal染色 结果显示，3月龄大鼠的系膜细胞染色阳性率很低，仅为(11.9±3.6)%，系膜细胞sa?β?gal染色阳性率随增龄逐渐增高，12月龄组为(39.0±4.0)%，而24月龄组细胞阳性率高达(86.9±7.4)%。3组间两两相比，差异有统计学意义（均p<0.05），表明大鼠的系膜细胞在机体内确实随年龄增长而发生衰老。
2.4 rt?pcr检测原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1 mrna的表达 rt?pcr检测结果显示，3，12，24月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1 mrna的相对值分别为1±0.03，1.14±0.05，1.34±0.05，3组间两两相比，差异有统计学意义（p<0.05），p21waf1/cip1/sdi1 mrna的表达随增龄而增加。
2.5 western印迹检测原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1蛋白质的表达 应用western印迹，进一步检测了p21waf1/cip1/sdi1的蛋白质表达水平随增龄出现的变化。结果显示与p21waf1/cip1/sdi1mrna的表达一致，3，12，24月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1蛋白质的表达随增龄增加(1±0.04 vs 1.22±0.04 vs 2.03±0.10)（p<0.05）。
2.6 不同月龄大鼠原代系膜细胞间接免***荧光染色结果 p21waf1/cip1/sdi1主要在大鼠系膜细胞胞核内表达，随着年龄增长表达的荧光强度逐渐上升，3月龄组大鼠系膜细胞荧光较弱，12月龄组稍有增强，24月龄组表达非常强，各组间比较差异有统计学意义（p<0.05）。见***1。
***1 不同月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1免***荧光染色结果(×200)（略）
3 讨论
衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命。正常细胞在体外培养时，其***次数存在“hayflick”极限，亦称最大***次数。这种正常细胞在体外***潜能受限制的现象即称为复制性衰老，而这一现象提示复制性衰老可能是生物体生命周期在细胞水平的重演。有关体内细胞是否存在复制性衰老，这一问题仍有争议，但大多数生物学家认为复制性衰老与生物体整体衰老相关，是体内衰老现象的一种体外反映。随着生物体年龄的增加，衰老细胞不断在体内积聚。体外细胞培养中的复制性衰老可以反映体内衰老发生的过程，其特征包括：不可逆地丧失增殖能力，出现细胞体积增大、胞体变平，功能上发生有选择的、特异改变，例如某些衰老基因表达的变化等。
肾脏衰老的发生机制是一个非常复杂的过程，有学者认为其固有细胞功能的减退是导致肾脏衰老的重要原因和体现；而肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中也发挥着重要的作用，故本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外分离培养原代的肾小球系膜细胞，并与3、12月龄大鼠的系膜细胞进行对比研究，观察不同月龄的肾小球系膜细胞细胞表型、功能的改变及p21waf1/cip1/sdi1的表达情况。结果显示，24月龄大鼠的系膜细胞增殖能力明显低于3月及12月龄组，且出现肥大等形态改变；此外，细胞sa?β?gal的阳性率明显高于3月龄及12月龄大鼠。
p21waf1/cip1/sdi1基因可能是人类可***细胞中控制衰老进程的主导基因之一，在衰老细胞中的表达量是增殖细胞中的10～20倍，p21waf1/cip1/sdi1mrna的增加与老化的表型及细胞增殖的丧失密切相关。当增殖细胞的生长因子去除或接触抑制时，p21waf1/cip1/sdi1基因的表达明显增加；再用血清刺激时，p21waf1/cip1/sdi1mrna水平在静止细胞中起初增加，随后在进入s期前降到较低水平。与此相比，衰老细胞中p21waf1/cip1/sdi1mrna水平并没有降低，表明该基因在维持衰老细胞表型中发挥重要作用〔2〕。众多研究皆表明，p21waf1/cip1/sdi1在衰老细胞中高表达，可作为细胞衰老的特征之一〔3，4〕。而在本研究中，亦发现p21waf1/cip1/sdi1在大鼠系膜细胞核内表达，且随着月龄的增加，其基因及蛋白质的表达也逐渐增强。故而，目前研究结果都表明伴随着增龄，大鼠系膜细胞确实逐渐出现了复制性衰老。
综上所述，大鼠系膜细胞随机体增龄出现衰老，其细胞的表型及功能都发生了相应的改变，这可能是肾脏器官衰老的重要体现和功能减退的发生原因之一。然而，细胞及器官衰老都是多因素综合作用的结果，其过程相当复杂，故有关肾脏衰老的发生机制仍需要更多及更加深入的研究。
【参考文献】
1 dimri gp，lee x，basile g，et al.a biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo 〔j〕.proc natl acad sci usa，1995；92（20）：9363?7.
2 chang bd，xuan y，broude ev，et al.role of p53 and p21waf1/cip1 in senescence?like terminal proliferation arrest induced in human tumor cells by chemotherapeutic drugs 〔j〕.oncogene，1999；18 (34)：4808?18.
细胞膜篇6
[关键词] 视网膜 微血管 内皮细胞 细胞培养
许多视网膜疾病如糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等均与视网膜血管病理性改变密切相关。随着对视网膜血管性疾病的研究深入发现视网膜血管内皮细胞是血管病变过程中的关键细胞。通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。本实验综合国内外几种方法，以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养方法。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶(Gibco公司，美国)、纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90ug/ml肝素+0.1ug/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10ug/cm2纤维连接蛋白包被。
1.2 方法
1.2.1 人视网膜微血管内皮细胞的分离与原代培养
原代细胞培养使用的眼球为角膜移植后残留的供体眼球。无菌操作，浸入酒精中消毒2遍，转入DMEM培养液中。距角膜缘后3mm穿刺，剪去眼前节，娩出玻璃体，吸取DMEM培养液将视网膜神经层吹起吸出，将视网膜置于DMEM培养液中洗涤2-3次，去除色素组织并夹出较大的血管，再将视网膜转入另一培养皿中剪碎后匀浆，将匀浆液过两层细胞标准筛（先过220um，后过86um），将第2层细胞筛翻转后用DMEM培养液充分冲洗，收集洗脱液后离心（1000r/min，10min），弃上清后加入3倍体积的0.1%胶原酶吹打均匀后移入离心管中在37℃200r/min摇床上消化60min，离心（1000r/min，10min），弃上清，用DMEM培养液悬浮细胞，将Percoll分离液加入DMEM培养液中，以20000r/min离心30min制备连续密度梯度，吸取上述细胞悬液2ml小心加入25ml离心管顶层分离介质面上，离心（1000r/min，10min），用注射器针头吸取所需的细胞层(第2层)，以添加ECGF的完全培养液悬浮细胞，接种于包被有10ug/cm2纤维连接蛋白的培养瓶内，将培养瓶置于5%CO2、37℃培养箱内培养细胞。24 h内严禁移动培养瓶。培养2d后首次换液，以后每2d换液1次，保持ECGF的浓度。换液前相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞，标记杂细胞位置，用细胞刮去除杂细胞。
1.2.2 人视网膜微血管内皮细胞的传代培养
当原代细胞融合80％以上后，开始传代培养。吸去培养液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶与0.02 EDTA混合消化液，室温下消化，在相差显微镜下观察，当铺路石样细胞开始变圆收缩，细胞间隙变大时，倒出消化液；以含15%FBS的完全培养液终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，脱壁后形成细胞悬液，按1：2的比例进行传代，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中。传代后每2～3 d换液1次。
1.2.3 人视网膜微血管内皮细胞的鉴定
(1)形态学：在相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞形态特征、生长特性及与微血管碎片的距离，并运用目镜网格器计数法观察记录培养瓶中混杂的其他细胞，每瓶选择3个视野，实验各重复3次。(2)Ⅷ因子相关抗原免***组化检查：以0.5×105/L的细胞密度接种2mL细胞悬液接种于预先置有20mm×20mm盖玻片的六孔板中，并置于37℃的培养箱中培养24h至细胞爬满玻片后取出，PBS漂洗细胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS冲洗3次，免***细胞化学染色二步法检测Ⅷ因子相关抗原。阴性对照：一抗用PBS代替。显微镜下观察、采集***像。
2 结果
2.1 视网膜血管内皮细胞形态学特点
经过分离纯化后接种于培养瓶的视网膜血管内皮中混杂有许多杂细胞，如红细胞、胶质细胞、周细胞等。24h后可见有血管内皮细胞贴壁，呈扁平梭形；5-7d细胞***、克隆样生长，形成细胞集落，呈类圆形、多边形形状；12d左右细胞融合呈铺路石样，单层生长，铺满瓶底，可见接触抑制现象。
2.2 视网膜血管内皮细胞免***组织化学鉴定
视网膜血管内皮细胞经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色，即胞浆中有棕色着色，98%以上细胞呈阳性染色。阴性对照组无着色。
3 讨论
视网膜血管内皮细胞的分离和培养在认识视网膜血管性疾病的病理生理等过程中发挥了重要作用。视网膜微血管内皮的培养由于取材困难，培养的细胞不易纯化，一直是视网膜细胞培养中的难点。
3.1 视网膜微血管内皮细胞的分离
取材过程中，要采用新鲜的人眼，并保证操作过程绝对无菌，尽量去除视网膜上的视网膜色素上皮细胞，并夹除可见的大血管。视网膜微血管段的分离和内皮细胞的获取、纯化作为视网膜血管内皮细胞培养中的关键步骤，对微血管段的分离程度要求较高，因此我们采用剪碎匀浆分离法获得视网膜微血管段。在匀浆器的选择上，注意玻璃杵与管壁应有一定的间隙，匀浆物与匀浆液的比例控制在1：1左右，研磨次数不宜太多，以免微血管段过度破碎。将组织分离后得到的匀浆液进行过滤和离心。用220um及86um的细胞筛可分别筛去未分离的血管段组织和一些较大的细胞以及血细胞等比血管内皮细胞小的细胞及一些碎片，得到较为纯净的微血管段。我们采用0.1g/L胶原酶在37℃200r/min摇床上消化60min，能够将视网膜间质消化获得单细胞悬液并保持较好的细胞活性。
3.2 视网膜微血管内皮细胞的贴壁和纯化
我们使用纤维连接蛋白包被的培养瓶能够有效地促进内皮细胞贴壁，同时抑制其他混杂细胞贴壁生长[1]。在培养液的选择上，我们配制了添加有15g/LFBS、90ug/ml肝素、0.1ug/L ECGF的内皮细胞培养基，形成只利于内皮细胞生长的选择性培养环境，使内皮细胞进一步得到纯化[2]。周细胞与内皮细胞的分离是纯化技术的难点，我们采用密度梯度离心和物理刮除等方法去除周细胞。Percol1分离液是一种外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒，它无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张。Percoll在离心过程中会自然形成密度梯度，内皮细胞和周细胞因其密度不同而在分离液中处于不同的层面。从而将提高内皮细胞纯度[3]。原代培养3-5d后，一些混杂的细胞常常分区成片的生长，可以利用内皮细胞呈独特的铺路石样形态单层生长，而周细胞呈长梭状的可重叠生长，在培养瓶底部标记后用细胞刮匙刮除杂细胞，从而获得较纯的内皮细胞[4]。此外，在传代过程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周细胞较内皮细胞更先松动，利用该特点可以除去部分周细胞。
综上所述，我们认为使用纤维连接蛋白包被培养瓶及添加肝素和内皮细胞生长因子的培养基，并结合物理刮除、密度梯度离心法等可以成功获得高纯度的视网膜血管内皮细胞，为体外研究视网膜血管相关疾病奠定了基础。
参考文献
[1] Schor AM,Schor SL.The isolation and colture of endothelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasculature: a comparative study with large vessel vascular cells. Microvase Res,1986,32(1):21-38.
[2] Lin C,Mctough R,Aswad B,et al.Hypoxin induces HIF-1,alpha and VEGF expression in chondrosarcoma cells and chondrocytes[J]. J Orthop Res, 2004, 22(4): 1175-1181.
细胞膜篇7
【关键词】树突状细胞;角膜移植;免***耐受
【中***分类号】R779.65【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)12-086-2
角膜移植术是用健康透明的角膜替代病变混浊角膜的手术,目的主要在于恢复患眼视力或***某些难治性角膜病变,有时也为了先改善患眼的角膜基地条件或改变患眼的屈光或美容而行此手术。早在18世纪,就有了角膜移植的设想,但其发展很慢。两百多年来随着免***学、药理学、分子生物学、遗传学等学科的发展和显微手术器械及技术的进步,角膜移植术才有了飞跃性发展。然而穿透性角膜移植仍然是***角膜盲的主要手段,同种异体免***排斥反应仍是角膜移植失败的主要原因。
目前临床使用的各种免***抑制剂主要通过作用于T淋巴细胞达到抑制免***排斥反应的目的,但长期用药费用昂贵,且为非特异性免***抑制。当免***抑制不足时就会发生排除反应,而抑制过强易诱发感染或肿瘤,并且阻断受体形成免***耐受。免***耐受是指受体在无免***抑制状态下,不能启动针对外源性抗原的免***应答,其特征包括对特定抗原长期不发生免***反应,对其他抗原可发生正常的免***反应性。
角膜移植的最终目标是非药物控制的角膜植片长期存活。近二十年来,有关角膜组织的免***特性,排斥反应发生机制及诱导免***耐受方面有了长足进展。而树突状细胞作为一类专职抗原呈递细胞在诱发免***反应及免***耐受的形成中起着重要的作用,被广泛应用于肿瘤及器官移植中。本文就树突状细胞与诱导角膜移植后的免***耐受形成关系进行初步讨论。
1角膜的免***特性
与其他系统的器官移植相比,角膜组织缺乏血管和淋巴管,可阻止植片抗原进入宿主局部淋巴组织,使得角膜移植不易发生免***排斥反应,这种低易感性成为角膜组织的免***赦免特性。近来发现,前房相关性免***偏离(ACAID)与角膜移植免***密切相关,其免***反应的特点是迟发型超敏反应和同种异体排斥反应受到抑制的同时保持着正常的体液免***和细胞毒性T细胞反应,是眼免***赦免的中心部分。正常情况下角膜中央无LC,只在角膜周边部和角膜缘区域有大量的郎格罕细胞(LC)、T细胞、B细胞、树突状细胞(DC)。LC是主要的抗原递呈细胞,且能表达HLA-Ⅱ类抗原(HLA-DR)。这些免***效应细胞在炎症情况下可大量增殖活化,由周边向中央移行,并产生抗体和释放细胞因子,在角膜移植排斥反应中起重要作用。Dana MR等证明在正常角膜上皮存在并表达CD11c+ CD11b+的树突状细胞,并证明这些树突状细胞与传统的上皮LC极为相似。在炎症状态下和角膜移植早期(24小时内),不但角膜缘部大量的抗原提呈细胞募集到角膜,而且角膜固有的抗原提呈细胞也明显上调MHC Ⅱ类分子CD80、CD86的表达。
2角膜移植排斥反应发生的机制
角膜移植免***排斥反应的发生一般包括宿主对异体组织抗原的致敏和宿主对异体组织抗原的反应两方面。免***致敏过程包括抗原呈递、T细胞活化和淋巴因子的释放。供体表达的抗原包括MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类抗原。角膜移植术后,这些供体来源的抗原可被受体的抗原呈递细胞处理,进一步呈递给受体的免***系统,受体的CD8+ T细胞识别供体细胞表面的MHC-Ⅰ类抗原,受体的CD4+ T细胞识别MHC-Ⅱ类抗原。另一方面,免***效应的传出阶段主要是指激活的T细胞通过淋巴管抵达角膜植床,攻击并破坏携带外来抗原的植片。最终导致角膜水肿、混浊和前房内炎症等角膜排斥反应。此时对植片的破坏过程起作用的是CD4+ T细胞。
3树突状细胞与角膜移植的关系
3.1树突状细胞的生物学特性
DC的概念始于1972年,Steinman于1973年首次在小鼠脾的淋巴结中分离出来,因细胞表面具有伪足样或树枝状突起而得名。DC作为T细胞是抗原特异性活化的最有活力的抗原递呈细胞,在整个掌管免***系统的细胞中发挥着中心的作用。主要分为两类:髓系DC(BDC)和淋巴系DC(LDC)。MDC来源于骨髓CD34+造血前体细胞,其发育和分化受间质生长因子或直接与骨髓间质细胞接触来调控。
3.2树突状细胞的成熟与功能
树突状细胞诱导免***反应或耐受的能力与其功能成熟状态密切相关。imDC表达CD14、CD1a和CD32、巨噬细胞集落刺激因子受体、甘露糖受体、趋化因子受体,具有极强的抗原内吞和加工处理能力,但低表达MHC-Ⅱ类分子、B7分子,低表达协同刺激分子CD80和CD86。混合淋巴细胞培养实验发现,imDC能够诱导同种异体淋巴细胞低反应,触发T细胞凋亡介导免***耐受。在一项视网膜移植的动物模型中,实验组移植了用含imDC培养的视网膜胚胎细胞,其免***耐受明显高于对照组。成熟的树突状细胞体外激发同种异体淋巴细胞反应能力很强但吞噬能力显著降低能,能够提呈抗原刺激Thl细胞反应,是导致移植排斥反应的关键环节。
3.3树突状细胞诱导角膜免***耐受的机制
国内外学者大量研究发现,在同种异体小鼠的心脏、肾脏、肝脏、小肠、皮肤、骨髓移植时,输注imDC能够减弱移植排斥反应,证实了利用imDC防治移植物排斥反应的可行性。利用DC的这些功能特点,在角膜移植前,将来自供体或负载供体抗原的受体imDC输入受体体内,可以诱导供体抗原特异性的移植免***耐受,从而延长移植物生存时间。DC的免***耐受作用主要表现在对T细胞的诱导耐受,归纳起来主要有以下几个方面。
3.3.1诱导T淋巴细胞无能无能状态是指抗原特异性T细胞对DC呈递的抗原呈低反应性,不行使效应者的作用,致机体免***系统对该抗原不产生有效的免***应答。DC激活T细胞产生特异性免***应答需要双信号,第一信号主要来自T细胞表面的T细胞受体(TCR)与DC表面MHC分子一抗原肽复合物的特异性结合;第二信号主要由DC表面和T细胞表面黏附分子对的相互作用所提供。第一信号和第二信号联合使T细胞活化,启动机体免***应答。而imDC表面只表达第一信号(MHCⅠ类分子),不表达第二信号(CD40、B27等),因此不能激活初始型T细胞。导致T细胞的无能或低反应,从而诱导抗原特异性耐受。国内学者朱振新和李元新报道了通过阻断第二活化信号诱导免***耐受的研究进展。
3.3.2imDC介导T细胞克隆清除角膜内皮和上皮细胞表面表达Fas,使进入角膜内的活化的T细胞凋亡,而角膜细胞本身免于杀伤。利用Fas/Fas介导细胞凋亡这一机制,可通过诱导移植物高表达FasL形成免***耐受而延长移植物的存活期。imDCs能表达抑制T细胞生长或诱导T细胞凋亡的分子(如NO,FasL等),使得imDCs具有破坏T细胞应答的能力。
3.3.3通过诱导调节性T细胞(Treg)介导免***耐受调节性T细胞是一类具有免***抑制功能,专职对免***应答进行控制的T细胞亚群。Treg可抑制mDC的成熟,而且还能触发DC分泌高水平IL-10,使其表达B7-H分子,发挥对效应性T细胞的抑制作用。由imDC诱导的Treg细胞主要包括CD25+ CD4+ Treg细胞、CD4+ Treg细胞、CD8+ Treg细胞。诱导同种异体Treg细胞大量增殖的同时,Treg细胞又可作用于imDC,阻断CD80、CD86共刺激分子的表达,介导移植免***耐受。
4问题与展望
在器官移植领域,imDC临床应用的前景非常广阔,诸多研究已证实无论是以DC为基础的细胞***,还是以DC为调控对象的***均可诱导抑制免***耐受。如对移植物进行预处理,清除移植物中的DC及预存抗体;或对受者预处理降低体内T细胞活性等。尤其是基因修饰的imDC,即避免了全身用药的不良反应,又能够诱导特异性免***耐受,防治移植排斥反应。但有些学者研究文献报道imDC诱导耐受不一。Zhang等报道,IL-10培养的imDC经静脉途径输入受体体内不能延长心脏移植小鼠的存活时间,而经门静脉途径注射同样的imDC则可显著延长小鼠的存活时间。由于目前基因工程技术的应用尚处于起步阶段,经基因修饰的imDC输入机体后,imDC在体内是如何维持耐受状态的,可以维持多久;目的基因表达不稳定,以及对宿主的安全性等问题,有待进一步研究。但随着移植免***学和基因***学研究的不断深入,基因修饰imDC诱导移植免***耐受,防治移植排斥反应的临床应用终将成为现实。完善现有的或寻找新的培养DC的方法或寻找新的干预靶点以获得更加稳定的imDC是进一步研究的方向之一。作为重要的免***调节细胞,DC无疑将会在免******中发挥重要的作用并将有光明的应用前景。
参考文献
细胞膜篇8
【关键词】细胞膜的结构；细胞膜功能；合作探究；小组合作
我今天说课的内容是人教版必修一第三章第一节细胞膜的结构和功能。高中生物必修课本一共三册书，必修一分子与细胞是其中的基础，而必修一中细胞的结构和功能为基础中的基础，前面学习了构成生物体的物质基础：元素和化合物，接下来又学习元素和化合物构成的结构基础细胞。只有这部分知识的熟练掌握才能更好地理解和学习后面的细胞的增殖，分化，衰老，癌变；必修二的减数***；必修三的兴奋地传递和激素的功能特点。同时高一的学生刚刚进入高中阶段的学习对高中的学习方法和技巧没有更多的深入，而且初三没有学习生物学科，我在上课的过程中注意学生生物学科的学习方法和技巧的培养，培养学生的生物学思维和生物学的学习方法，例如让学生多参与实验，设计实验，体验生物学科是实验科学；为学生尽可能多地提供动脑动手的机会，培养学生的发散思维、想象力，初步培养科研的思维。
一、课堂前教案分析
（一）教学目标
知识目标：了解细胞膜的成分、结构和功能。能力目标：进行用哺***动物红细胞制备细胞膜的实验；体验制备细胞膜的方法；探讨在建立生物膜模型的过程中，实验技术的进步所起的作用。情感态度目标：认同细胞膜作为系统的边界对于细胞这个生命系统的重要意义；探讨建立生物膜模型的过程如何体现结构与功能相适应的观点。
（二）教学重点与难点
教学重点主要包括以下几点：细胞膜的成分和功能；细胞膜对于细胞这个生命系统的重要意义。教学难点：用哺***动物红细胞制备细胞膜的方法。细胞膜对于细胞这个生命系统的重要意义。建立生物膜模型的过程如何体现结构与功能相适应的观点。
（三）教学方法
教学方法有很多种，本次主要是运用以下的一些方法：引导探究，模型制作，小组合作，小先生讲课，通过这些方法能很好地引导学生尽快地进入课堂氛围，而且能够亲自参与到课堂教学中，增加同学们的学习兴趣。
二、课堂教学过程设计
通过做一个演示实验：两个烧杯分别装凉水和开水，同学上来操作，分别放入等量的玫瑰花瓣，用玻璃棒搅拌，请同学们观察有什么现象？得出什么结论？通过这个观察到的现象从而引出细胞膜的功能，锻炼和培养学生的观察和分析的能力，此部分大约用时5—8分钟。
细胞膜的这么重要的功能，与什么有关？究竟又怎样的结构决定的呢？首先要制备出真正的生物膜才能够是由有说服力。此处是一个很重要的实验，鉴于实验材料和器材的显示采用的方法是理论实验，培养学生自己在脑中先预设实验，用问题串的形式将该实验需要的所有问题都引导出来。
我们选择什么样的材料来做这个实验呢？（动物细胞，植物细胞，细菌类细胞，哺***动物的成熟的红细胞）你为什么选择这样的实验材料，依据是什么？
你选择了哺***动物的成熟的红细胞，接下来你如何操作能够制备细胞膜呢？为什么要这样操作？
细胞破裂后，如何才能将细胞膜取出来呢？用到了其他学科的什么知识？
制备了细胞膜，究竟含有哪些化合物？我采用的方法是沿着科学史的步伐，根据曾经的科学家们的实验，看看同学的分析能力。
细胞膜的化学组成为：磷脂分子，蛋白质分子，多糖分子。这些化合物用什么样的方式结合起来，能够满足我们前面分析的细胞膜的功能？提供材料：塑料板，磷脂模型，蛋白质模型，多糖模型。
分组：同学们六人一组，进行拼***实验，看看你做的模型怎样才能满足细胞膜的功能。
在这个过程中，学生会存在这样那样的问题，你的设计，为什么这样设计，有不同意见的同学起来反驳，你的反驳理由是什么？这样设计对不对，为什么？应该怎样设计呢？边设计边订正，到最后同学自己说服自己，制作出真正正确的磷脂双分子层的流动镶嵌模型。能够让学生充分理解为什么细胞膜要有这样的结构，同时还锻炼了学生设计实验的能力，科学辩证的思维能力。
课堂快结束的时候，让同学起来总结一下这节课你学习了什么？知识方面的收获还有其他的收获吗？为了满足不同层次的学生的需求，采用分层次布置作业，基础的部分+能力提高部分。有兴趣的同学上网查资料，细胞膜上的甲胎蛋白与人体健康。
三、小结
高中生物教学方法多种多样，本文旨在对学生生物学科的学习方法和技巧的培养，培养学生的生物学思维和生物学的学习方法，为学生尽可能多的提供动脑动手的机会，培养学生的发散思维、想象力，初步培养科研的思维。
【参考文献】
［1］冯文琪.浅谈如何在高中生物教学中培养学生的探究能力[J].新课程（中），2011（2）.
细胞膜篇9
【摘要】 目的 制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免***组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达，扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免***反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
【Abstract】 Objective To produce the acellular muscle as biomaterial scaffold and to observe its biocompatibility with the human amniotic epithelial cell. Methods The acellular muscle scaffolds were made by extraction with 3% Triton X100 and 1% sodium dodecyl sulfate. The histological structure of acellular muscle was observed in frozen section. Then the cultured human amniotic cells were implanted into acellular muscle scaffolds. After cultured 1 w， the scaffolds with cells were sectioned， and BrdU，NT3 and BDNF immunohistochemical staining were performed to observe the proliferating capacity and the expressions of NT3 and BDNF of amniotic cells in scaffold. SEM was performed to examine the distribution of human amniotic epithelial cells growing in scaffold. Results The cells in scaffold completely disappeared after the muscle had been extracted. The scaffold of acellular muscle was arranged in parallel tubules composed of collagen fibers and elastic fibers which were left intact. In scaffold the human amnion cells could proliferate and synthesize NT3 and BDNF. Scanning electron microscopy demonstrated a uniform distribution of cells in scaffold. Conclusions The cells in rat skeletal muscle are successfully removed by chemical extraction. The acellular muscle scaffold made in this way possess good compatibility with human amniotic cells.
【Key words】 Acellular muscle; Human amniotic cell; Biocompatibility
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处，4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架***神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的***神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程***神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3，脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免***组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后，转入3%的TritonX100溶液，摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈***白色，半透明，质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见***1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见***2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(***
***1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
***2 去细胞肌肉支架的病理***片2A)。免***组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(***2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(***2C，2D)。J***5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(***2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为***神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似，仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免***排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为***神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免***排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架***神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括胰岛素样生长因子、层黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质，IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的***具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为***神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免***组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合***神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体***神经损伤奠定了一定的实验基础。
参考文献
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细胞膜篇10
【摘要】 【目的】 探讨体外分离培养细针活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞(FLS)的方法。【方法】 滑膜组织来自接受盲式细针滑膜活检术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法和改良组织块培养法分离培养FLS。采用台盼蓝染色进行细胞计数及活性鉴定，并应用倒置相差显微镜、透射电镜、免***细胞化学染色、流式细胞术对第3 ～ 4代FLS进行鉴定。【结果】 3种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。台盼蓝染色示FLS细胞计数约(8.30 ± 1.65) × 105/瓶，活细胞百分率 > 95%。传代可使FLS达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜、透射电镜观察均符合FLS的形态结构特征，免***细胞化学染色示Vimentin阳性、CD68阴性、CK阳性，流式细胞术检测示CD55+ 细胞占(95.34 ± 2.47)%。改良组织块法培养FLS成功率较高，细胞游出时间较早，所需传代时间较短。【结论】 改良组织块法特别适合于细针滑膜活检标本FLS的培养，第3 ～ 4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。 教育教学
【关键词】 成纤维样滑膜细胞; 细胞培养; 细针活检
Abstract： 【Objective】 To explore the culture method for fibroblast-like synoviocytes (FLS) from needle biopsied synovium tissue. 【Methods】 Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by blind needle synovium biopsy were cultured with three different methods (digestive enzyme culture， tissue culture and modified tissue culture). Cell count and the percentage of viable cells were observed by trypan blue staining. FLS were identified by morphology， immunocytochemical staining and flow cytometry. 【Results】 All three methods could culture FLS successfully，of which modified tissue culture method was better than the other two methods. FLS cell count was (8.30 ± 1.65) × 105 per flask with more than 95% viable cells by Trypan blue staining. FLS of the third or forth generation showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope and transmission electron microscope with Vimentin+/CD68-/CK+ staining and (95.34 ± 2.47)% CD55+ cells. Modified tissue culture method has higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. 【Conclusion】 Modified tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from needle biopsied synovium tissue. The cell count， the percentage of viable cells， and purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.教育教学
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节滑膜炎症为特征的慢性自身免***性疾病，滑膜细胞增生并向周围组织侵袭形成血管翳在RA的发病、慢性炎症的维持及骨与软骨的破坏中起重要作用。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)是滑膜组织最活跃的组成细胞，可通过自分泌或旁分泌方式产生大量的炎性细胞因子及免***反应介质，是参与RA发病的重要细胞[1]。FLS体外培养模型的建立对于研究FLS的功能、进一步探讨 RA的发病机制及体外筛选***RA的药物具有重要意义[2]。目前用于FLS体外培养的滑膜多来自关节开放性手术、关节镜手术、从滑液中分离及细针滑膜活检等方法，其中细针滑膜活检局麻下操作，技术简单，并且获取的滑膜组织常较少混有其它成分，有利于原代细胞培养的纯化和操作。然而，细针活检获取的滑膜组织体积较小，标本总量较开放手术少，若采用经典的消化酶培养法或组织块培养法进行原代培养，成功率偏低，细胞生长速度缓慢。为此，本实验探讨细针活检滑膜组织FLS体外培养的最佳方法，为有效进行下一步实验做准备。教育教学
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 滑膜组织
来自接受盲式细针滑膜活检术[3]的确诊活动期RA患者，RA诊断符合1987年美国风湿病协会(American College of Rheumatology， ACR)修订的诊断标准。
1.1.2 主要试剂
DMEM/F12 培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、2.5 g/L胰酶-0.2 g/L EDTA(美国GIBCO公司);I 型胶原酶、PBS缓冲液、台盼蓝(广州威佳生物有限公司);鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG、DAB反应显色试剂盒(武汉博士德公司)、鼠抗人CK单克隆抗体(北京中杉)、鼠抗人CD55单克隆抗体(BD Pharmingen公司)。教育教学
1.2 方 法
1.2.1 消化酶培养法
①将活检的滑膜组织剪碎，加入I型胶原酶(1 mg/mL)并充分混匀，置37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中消化4 ～ 6 h;②用100目细胞滤网过滤、离心，弃上清，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，移入细胞培养瓶中培养;③每2 ～ 4 d更换一次含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液。教育教学
1.2.2 组织块培养法
①将活检的滑膜组织剪成1 mm3大小，以5 mm间距均匀排列在培养瓶的培养面，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12培养液，使培养面斜向上置细胞培养箱;②孵育4 h待组织块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养;③每2 ～ 4 d更换一次含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液。待组织块周围FLS成片生长后，去除组织块继续培养。教育教学
1.2.3 改良组织块培养法
①将活检的滑膜组织剪成1 mm3大小，加入I型胶原酶并充分混匀，置细胞培养箱中消化4 ～ 6 h;②细胞滤网过滤、离心，弃上清，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，移入细胞培养瓶中培养;③收集细胞滤网上的组织碎屑，以5 mm间距均匀排列在另一培养瓶的培养面，加入含200 mL/L FBS的DMEM/F12培养液4 mL及I型胶原酶1 mL，使培养面斜向上置细胞培养箱;④孵育4 h待组织块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养;⑤24 h后更换含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液，以后每2 ～ 4 d更换一次培养液，待FLS成片生长后，去除组织块继续培养。教育教学
1.2.4 FLS的传代培养
待细胞长至融合度约70% ～ 80%时进行细胞传代，2.5 g/L胰酶-0.2 g/L EDTA消化，待细胞突起逐渐收缩、细胞变圆、细胞间距增大时终止消化，离心后按 1：3进行传代培养。
1.2.5 台盼蓝染色FLS计数及活性鉴定
将第3 ～ 4代FLS消化离心重悬后，取等体积细胞悬液和5 g/L的台盼蓝染液混匀，静置染色3 ～ 4 min后计数。死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。根据以下公式进行细胞计数：细胞总数/毫升 = (4大格细胞总数/4) × 104 × 稀释倍数。活细胞百分率(细胞活性) = (4大格活细胞总数/4大格细胞总数) × 100%。教育教学
1.2.6 倒置相差显微镜
观察细胞原代及传代后的形态及生长状况。
1.2.7 透射电镜
第3 ～ 4代细胞细胞消化离心后，25 g/L 戊二醛、20 g/L多聚甲醛混合液前固定，10 g/L锇酸后固定，乙醇、丙酮梯度脱水，Epon包埋剂包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染，Philips CM10透射电镜观察。教育教学
1.2.8 Vimentin、CD68、CK免***细胞化学染色
将第3 ～ 4代细胞爬片用40 g/L多聚甲醛液固定，加一抗(鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、鼠抗人CK单克隆抗体，1 ∶ 100稀释)、加生物素化羊抗小鼠IgG，DAB显色，苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，中性树胶封片。PBS作为阴性对照。
1.2.9 流式细胞术检测CD55+ 细胞百分率
第3 ～ 4代细胞经消化重悬制成1 × 105/mL的单细胞悬液，加入鼠抗人CD55单克隆抗体进行免***荧光染色，流式细胞术检测细胞表面CD55表达并计算其阳性率。教育教学
2 结 果
2.1 三种体外培养FLS方法的比较
共行24例次细胞培养，其中消化酶培养法10次，成功6次;组织块培养法5次，成功4次;改良组织块法9次，成功9次。采用消化酶培养法，FLS约24 h贴壁，初期生长较慢，约2周长满瓶底20% ～ 30%，之后生长较快，约4周长满瓶底的70% ～ 80%(***1)。采用组织块培养法，2 ～ 3 d可见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，两周后细胞迅速生长，约3 ～ 4 周长满瓶底的70% ～ 80%(***2)。采用改良组织块培养法，分为2瓶原代细胞，1瓶为胶原酶所消化下来的细胞，其生长速度与消化酶法相近;另1瓶为组织块，1 ～ 2 d后见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，1周后细胞迅速生长，约2 ～ 3 周长满瓶底的70% ～ 80%(***3)。教育教学
2.2 FLS计数及活性鉴定
3 种方法培养出的FLS长满25 cm2培养瓶时细胞总数为(8.30 ± 1.65) × 105/瓶，活细胞百分率 > 95%。
2.3 FLS的鉴定
倒置相差显微镜下观察可见FLS呈三角形、梭形，细胞核成卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，细胞周围可见分泌物聚集。Vimentin、CD68、CK免***细胞化学染色结果显示第3 ～ 4代FLS Vimentin染色阳性，胞浆内见大量棕黄色颗粒，CD68染色阴性，CK染色阳性，胞浆可见棕黄色颗粒(***4)。透射电镜下观察可见FLS核染色质较疏松，呈细颗粒状分布在核周围，核仁明显，粗面内质网丰富，胞浆突起长而粗，胞浆中往往缺乏高尔基复合体，可见少量小泡和囊泡(***5)。流式细胞术检测3 ～ 4代FLS CD55+ 细胞百分率为(95.34 ± 2.47)%(***6)。教育教学
3 讨 论
滑膜包括衬里层和衬里下层，衬里层主要有巨噬样滑膜细胞和FLS，衬里下层为结缔组织，RA尤其是病程长的患者其滑膜衬里下层含较多的纤维组织。FLS在慢性炎症过程中被激活后，出现细胞表型的显著改变，具有不完全转化细胞的特性，即使脱离炎症环境仍持续活化，增殖能力升高，逃脱接触抑制，呈现肿瘤样增殖，并具有侵袭能力[4]。FLS体外培养模型的建立对于研究包括RA在内的多种滑膜关节病变的发病机制具有重要意义。教育教学
目前用于FLS体外培养的滑膜多来自关节开放性手术、关节镜手术、从滑液中分离及细针滑膜活检等方法。前两种方法所获取的滑膜组织较大，采用消化酶培养法或组织块培养法往往都能成功培养出FLS[5-6]。然而，开放手术对患者的创伤大，多用于晚期RA患者[2]，切取的滑膜组织可能混有较多其它组织成分;关节镜手术则实现了可视下滑膜活检，是目前获取滑膜标本的“金标准”[7]，但需专门设备、价格昂贵、技术难度高。从滑液中分离得到的滑膜或滑膜细胞数量有限，且脱落至关节腔的滑膜或滑膜细胞的生物学特性可能与关节表面的滑膜或滑膜细胞的生物学特性不完全一致。细针滑膜活检术操作安全、简便，成功率高[3]，可用于早中期的RA患者。本实验采用盲式细针滑膜活检术获取滑膜组织，其体积往往较小，滑膜组织数量不如关节开放性手术及关节镜手术多。因此利用这种细针活检滑膜组织进行FLS体外培较困难。教育教学
经典的细胞原代培养包括消化酶培养法和组织块培养法。消化酶培养法属于化学法，需要的滑膜标本量较多，且消化酶活性不够稳定，不利于有效消化分离滑膜纤维组织，细胞不易游离出来，加上所用的消化酶对细胞有一定的毒性，因此该方法FLS体外培养的成功率不高，细胞生长速度缓慢。组织块培养法虽然适合滑膜标本量较少的情况，细胞生长可定位观察，换液次数少，减少了污染的机会，但种植的组织块不易成活，簇状方式长出的细胞时间间隔较长，细胞生长缓慢。我们根据细针活检滑膜组织的特点，对上述传统的方法进行了改良，将消化酶法及组织块培养法有机地结合起来，既具有组织块培养法的优点，又避免了消化酶培养法的缺点，尤其适合滑膜标本量较少时。教育教学
在FLS体外分离培养过程中，可能同时混杂巨噬样滑膜细胞以及少量的内皮细胞、树突状细胞等。巨噬样滑膜细胞(A型滑膜细胞)呈卵圆形，胞周有短突起，核仁清晰;内皮细胞光镜下呈三角形或梭形，长满时呈铺路卵石状排列[8];树突状细胞多为悬浮，光镜下细胞体积较大，形状不规则，并且有毛刺状突起[9]，这三种细胞的形态学及生长特性与FLS有差异。研究显示，第一代的滑膜细胞中约40% ～ 50%为巨噬样滑膜细胞，50% ～ 60%为FLS，而第三代则99%以上为均一的FLS[10]。这主要是由于巨噬样滑膜细胞不具有增殖能力，随着培养时间的延长，细胞渐渐衰老至失去活性，在体外仅可存活约10 d[11]。FLS在含100 mL/L FBS的DMEM培养液中培养的***增殖迅速，呈长梭状极向排列，能以传代培养的方式在体外培养较长时间。因此用自然纯化、酶消化及反复贴壁传代相结合对细胞进行分离和纯化，可逐步获得较纯的FLS。教育教学
分离纯化FLS之后还必须对其进行鉴定，包括形态学和细胞表面标记物的检测。值得注意的是细胞表面标记物的检测。FLS较特异的细胞表面标记有UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55、钙粘蛋白-11(Cadherin-11)、Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羟化酶、CD44等[12]，其中Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羟化酶是各种成纤维细胞的标记，而UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55是衬里层FLS的特异标记。其中CD55为补体衰退加速因子(DAF)，在与血液接触的细胞中都有低表达，而在组织空腔衬里的间充质细胞、滤泡状树突状细胞有高表达[13]，在关节腔滑膜组织中FLS也有较高的表达，可与其它成纤维细胞相鉴别。CD68是巨噬细胞的表面标志，巨噬样滑膜细胞阳性表达。教育教学
另外，本实验分离培养的FLS还可能同时混杂衬里下层的纤维母细胞或成纤维细胞。衬里层的FLS具有上皮样表型如E-Cadherin的表达[14]，而衬里下层的纤维母细胞或成纤维细胞来源于间充质细胞，Vimentin阳性而不表达DAF/CD55，说明衬里层和衬里下层的成纤维样细胞亚群之间表型及功能不同[15]。新近研究发现，RA滑膜衬里层的FLS不但具有成纤维细胞形态，而且具有不依赖支持物生长、细胞连接粘附分子消失、Vimentin表达增高等间充质细胞特点，表明RA-FLS存在上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[16]。EMT不仅可能是RA-FLS大量增多的原因之一，而且还可能与RA滑膜浸润破坏软骨有关[14，16]。本文体外分离纯化的细胞通过细胞表面标记检测发现其Vimentin、DAF/CD55、CK均阳性，CD68阴性，表明分离纯化的细胞为衬里层同时具有上皮和间充质细胞特点的FLS而不是衬里下层仅有间充质细胞表型特点的纤维母细胞或成纤维样细胞。教育教学
本实验对RA滑膜体外培养的第3 ～ 4代细胞行形态学及细胞表面标记检测，结果显示，培养出的细胞为FLS，纯度 > 95%。由于第1 ～ 2代FLS的纯度不够，而第5代之后的FLS出现老化现象，增殖活性明显降低，细胞形态变化较大，至第8代完全失去增殖活性，因此采用第3 ～ 4代FLS进行后续实验。教育教学
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