细胞骨架10篇

细胞骨架篇1

[关键词]软骨细胞；细胞骨架；细胞形态

关节软骨处在一个具有压应力、张应力、流体剪切力等机械应力作用的复杂力学环境中，而机械应力在调节关节软骨细胞生物学行为中具有十分重要的作用，能够对软骨细胞新陈代谢进行调控，是保证软骨基质正常状态的必要条件。可调控软骨细胞的新陈代谢，是维持正常软骨基质必不可少的条件。关节软骨组织缺乏血液供应、细胞代谢缓慢、自我修复能力较差，即使较小的软骨损伤也会引起严重的后果。我们的前期动物实验表明，中等强度的炮台运动能促进大鼠软骨缺损的修复重塑，但其作用机制尚不清楚。

本研究拟通过体外实验对大鼠关节软骨加载周期性压应力，观察应力下的软骨细胞形态和细胞骨架的变化，为软骨细胞内力一生物信号转化研究提供基础，为适度应力促进关节软骨缺损修复重塑的机制研究提供依据。

1.资料与方法

1.1一般资料

主要包括大鼠来源及所用试剂的来源。本研究中所用大鼠为7d龄，且身体健康，均由南方医科大学实验动物中心提供。主要试剂：鼠抗人Tubulin B单克隆抗体（北京中杉金桥生物进口分装）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培养基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸缓冲液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；链菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番红（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；双乙酸荧光素（Salarbio公司）；甲苯胺蓝（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型胶原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC思牵ū本猩冀鹎派物进口分装）；I型胶原蛋白裱衬的6孔培养板（Flexercell公司）。

1.2仪器设备

主要包括四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院研制）；流式细胞仪（Coulter，美国）；CO2培养箱（ShelLab，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；数码相机（Olympus，日本）。

1.3实验方法

主要包括细胞培养、染色以及检测。

1.3.1软骨细胞的分离培养及应力加载 体外分离大鼠四肢的关节软骨并进行传代培养，细胞培养传至第3代，随机分为对照组（A组）和周期性机械应力组（B组）。A组：在正常条件下培养软骨细胞；B组：软骨细胞置于周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。加载应力组细胞卸载后与对照组细胞同时进行以下检测。

1.3.2番红及甲苯胺蓝染色 软骨细胞生长于柔性的硅胶膜上，选择PBS进行冲洗，并加入0.25%番红以及1%甲苯胺蓝染液，在室温条件下，进行孵育2h。随后利用显微镜进行观察拍照。番红染色可以明确氨基葡聚糖合成情况；甲苯胺蓝染色可以明确蛋白多糖合成情况。

1.3.3免***荧光检测 当细胞的80%贴合于盖玻片后，在超净的工作台上放置一24孔的培养板，并取出贴有细胞的盖玻片，使用PBS液进行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，进行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗细胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。后加如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的二抗（sigma公司），37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板，0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。将所有盖玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min，后将清洗液弃去，加入4’，6-二脒基2-苯基吲哚（4’，6diamidino2-phenylindole，DAPI）进行染核，在室温条件下，进行5min。后在长方形的载玻片上低落封片剂，盖上盖玻片，并在室温条件下5min封片。用LC***（LeicaSPS Germany）观察并记录***像。

1.3.4 RT-PCR检测cofilin基因表达 以TrizolRNA试剂盒提取细胞总RNA，依据GenBank上登陆cofilin基因序列，以B-actin作为内参照，设计引物序列。cofilin正义引物：TGTGGCTGTCTCTGATGGAG，反义引物：3TGTCTGGCAGGATC 3TGAC：B-acfin正义引物：CAC GTA CGT TGC TAT CCAGGC，反义引物：CTC CqT AAT GTC ACG CAC GAT。PCR条件95℃变性4min：95℃变性45s：53℃复性45s：72℃延伸90s：72℃温育10min：4℃保存24h。扩增结束后取最终产物10 u L，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EBO.5ug/mL）。15mA、90V稳压45min，采用kodak电泳凝胶观察系统EDASl20扫描，分析结果。

1.3.5Western印迹检测cofilin蛋白表达 选择实验组与对照组中贴壁生长的软骨细胞悬浮液，并进行蛋白样品提取，以pierce公司生产的BCA蛋白定量检测试剂盒说明为标准稀释样品，进行蛋白浓度的检测，并选择5mg/mL的BSA液体将蛋白质标准品完全溶解，置于-20℃的环境下保存。选择取标准品用PBS 10mL，并将其稀释为100uL，保证液体的最终浓度为0.5mol/mL。进行SDS-PAGE电泳，再完成转膜的过程中加入一抗与二抗，并进行ECL发光。通过扫描仪进行扫描，将***像输入到Image J软件中进行***像的定量分析。

1.4统计学分析

应用SPSS15.0软件进行统计分析。计量数据用（x±s）表示，行配对t检验，P

2.结果

2.1软骨细胞的形态学观察

体外分离的大鼠关节软骨细胞培养24h后开始贴壁，72h后能够完全贴壁。并且大部分细胞表现为多边形，而细胞核表现为椭圆形或者圆形，能够清晰的观察到1～2个核仁。进行甲苯胺蓝染色后，形态学观察可见：大部分聚集于细胞内的呈深蓝色的蛋白多糖。而细胞核则被染色为深蓝色或者蓝紫色。进行番红染色后，形态学观察可见：大部分呈深红色的氨基葡聚糖阳性物质聚集于细胞内。加载组和对照组无显著差别，而应力组的关节软骨细胞发生形态改变，并且其取向逐渐趋于相同。见***1A～D。

2.2微丝的形态学观察

实验组软骨细胞微丝为与细胞长轴平行的线状均匀纤维，排列整齐，呈线状拉伸，核深染。对照组软骨细胞微丝形态及分布较散乱，纤维显稀疏，与对照组比较核淡然。见***2A～B。

2.3微管的形态学观察

实验组软骨细胞边缘平整、锐利，细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。对照组软骨细胞微管荧光强度明显较弱，边缘模糊，未见明显核周聚集区。见***2C～D。

2.4中间纤维的形态学观察

实验组软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带，中间纤维扩展的细胞外基质的部分呈现为亮带外周的微弱绿色荧光。对照组软骨细胞中间纤维排列紊乱，荧光强度普遍较弱，呈波浪状围绕细胞核分布，个别细胞中存在中间纤维的斑块状聚集，膜周亮带较弱或无，亮带以外微弱绿色荧光较宽。见***2E～F。

2.5RT-PCR检测cofihn基因表达

RT-PCR检测显示实验组软骨细胞cofilin基因表达为（1 52±0.12），对照组为（0.99±0.01），两组相比差异具有统计学意义（t=31.123，P=0.000）。见***3。

2.6Western蛋白印迹检测cofifin蛋白表达

实验组软骨细胞中cofilin蛋白表达明显高于对照组软骨细胞cofilin蛋白的表达。见***4。

3.讨论

软骨在动物全身关节活动中发挥着重要作用，其含有特殊的软骨基质，因而能够承受一定的机械力而不会发生永久变形。同样，在软骨的生长发育过程中，其形态和功能的维持及损伤后的修复也离不开力学刺激，缺乏力学刺激会导致软骨退行性变。

软骨细胞在机械力的传导和转化方面起着举足轻重的作用。细胞形态是细胞功能的体现形式，是细增殖分化与凋亡等诸多胞内事件的参与者，同时，细胞形态与细胞所处的力学环境密不可分，是细胞内部力平衡的最直观外在表现，因此，对软骨细胞的形态研究，是研究机械应力影响软骨修复机制的基础。

本实验中在周期性机械应力刺激下，大鼠关节软骨细胞附壁生长良好，能够合成有软骨细胞生物学特点的粘多糖和氨基葡聚糖，并促进软骨细胞的规则排列，说明在软骨细胞的生长过程中，周期性的机械应力具有较为积极的刺激作用。临床研究证实，外力施加载荷的频率、时间与大小等均是影响软骨细胞新陈代谢和生长的刺激因素。本实验中的细胞特殊染色技术只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而无法从蛋白表达的基因水平辨别蛋白合成过程中的微小差别。仍然需要更加深刻的定量分析研究，对基因和蛋白层面进行探讨，进一步阐述周期性机械应力对软骨细胞的刺激作用。

细胞骨架是维持细胞形态的重要部分，同时在维系软骨细胞功能方面也具有十分显著的作用。细胞骨架包括微丝、中间z与微管是胞骨架的组成部分，联合各种具有不同作用的调控蛋白共同构成细胞内部蛋白纤维网络体系。细胞骨架明显的为力学信号发生转导提供了十分理想化和有效化的途径。在细胞受到外界力学的刺激后，会导致细胞骨架发生重新排列，导致使细胞内应力随之发生相应的重新分布。细胞骨架的改变不仅会造成细胞形态的变化，同时也会导致细胞力学特征及生物学特征发生变化。

微丝是真核细胞中含量最丰富的一种蛋白复合体，是细胞骨架的主要成分之一，是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝，F-actin是细胞骨架微丝蛋白的主要成分，与细胞黏附、吞噬、运动、***等密切相关。细胞伸出的丝状伪足参与细胞间的通讯并使细胞具有趋化性，产生细胞形态的变化，而成束的微丝对丝状伪足起支持作用。压应力作用于软骨细胞后，微丝会出现不同方向的变化，增加细胞顶-底纵向的微丝张力，但横向微丝张力未发生变化。外界刺激到达阈值后，会破坏Actin微丝和Vimentin中间纤维聚集以及解聚的动态平衡，导致微丝发生生物学降解。应力信号通过细胞骨架网络结构传递至细胞内激活相应的信号转导通路，反馈调控，使其与组蛋白、DNA相互作用来调节复制和转录过程，细胞骨架发生重组，使细胞维持一定的机械强度适应机械力。

本研究中免***荧光染色显示应力组较对照组微丝致密且分布均匀，荧光强度增强，取向趋于一致。实验组细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。而加载周期性机械应力后的软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带。这些现象均表明周期性应力可促进软骨细胞的骨架重排，提高其力学适应性，而细胞骨架在软骨细胞的力学一生物学信号转导中发挥着重要作用。

细胞骨架篇2

向重力性反应是植物适应地球重力场环境的一个重要生理过程,是植物能够正常生长发育不可缺少的反应机制。高等植物根的向重力性使其能够充分吸收土壤中的水分和矿质营养,茎的负向重性使其能够充分接受光照。研究表明,植物感受重力与信号传递之间的精确调控可能是通过不同细胞器之间的相互作用来实现的。细胞骨架被认为是与植物向重性有关的重要细胞器之一。细胞骨架(Cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系[1]。细胞骨架不仅在维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还与细胞运动、物质输运、能量转化、信息传递、细胞***和分化、细胞凋亡、细胞的癌变、基因表达等生命活动密切相关。

1植物根系材料的力学特性

植物根系材料不同于一般的工程材料,研究其力学特性,最大的困难在于它参与代谢活动,具有多相、非均匀、各向异性等特点,其应力不仅与应变有关,还与流动因素有关。在不同生理和生长环境下,其力学性质存在很大差异[2]。许多国内外专家学者对木本植物、草本植物、农作物的根系进行了大量的拉伸、压缩、弯曲、冲击、应力松弛、糯变试验等研究,得到了少数根系的拉伸最大载荷、应力、应变、弹性模量、弯曲应力等参数,得到了个别根系的冲击韧性、应力松弛、糯变试验数据和曲线,推得了本构方程、应力松弛方程和糯变方程等。尽管这些研究成果是初步的、不全面的,但它们已在防风治沙、防水土流失等生态环境建设工程中发挥了重要作用,为植物根系力学的进一步发展奠定了基础。

2植物感受重力的2种假说

植物重力信号感受机制一直是生物学界争论不休的话题。截至目前对于重力信号感受的解释主要有2种,即淀粉平衡石假说与原生质体压力假说。

淀粉平衡石假说认为,重力信号是由一类结构特殊的细胞即平衡细胞来感受的。在根中平衡细胞是位于根冠的柱状细胞,而在下胚轴和花序轴中平衡细胞是内皮层细胞。这2种细胞都是高度极化的细胞,但存在结构上的特异性。平衡细胞的细胞核位于细胞的中部或顶部,细胞质可以分为2层,包含内质网的周边区域和富含肌动蛋白微丝的中央区域。平衡细胞最显著的结构特征是都含有淀粉体[3]。淀粉体起平衡石的作用,其比重大于细胞质。在垂直生长的器官中,这些淀粉体沉降在细胞的底部,当植物器官在重力场中的方向发生改变,这些淀粉体因为比重较大,重新沉降到新的物理学底部。中柱细胞和内皮层细胞就是通过这些淀粉体的沉降来感受重力的变化。

原生质体压力假说是平衡石假说之外的另一种关于重力感受的假说。在拟南芥无淀粉体的突变体中,尽管重力敏感性降低,但给予植物长时间的重力刺激,其根仍能发生一定程度的向重力方向弯曲。因此,有人认为在植物体中除了结构特异的平衡细胞外,植物的原生质体本身也可以感受到重力的改变。原生质体压力假说的主要内容是:当植物体的原生质体在重力场中的取向发生改变时,原生质体上部的细胞膜与细胞壁之间的张力增强;这种张力的改变通过特异的区域,即细胞膜与细胞壁通过细胞骨架相连接的区域,传递到细胞膜上改变细胞膜的张力,从而活化质膜上张力敏感的离子通道,特别是钙离子通道;胞质中钙离子浓度的改变引发下游的信号传导,最终引起植物器官的向重性弯曲。

3细胞骨架结合蛋白在重力信号传导链中的作用

3.1微丝结合蛋白

细胞骨架结合蛋白可分为微丝结合蛋白(ABPs)和微管结合蛋白(MAPs)。在植物中研究得最清楚的ABPs是微丝单体结合蛋白以及抑制蛋白和微丝解聚因子,如ADF/丝切蛋白。这2类蛋白都是由多个基因家族编码,在微丝骨架组成方面起着重要的作用。过量表达ADF的拟南芥植株生长缓慢,细胞纵向的微丝束消失;而抑制ADF表达则可刺激细胞伸展和细胞伸长生长,同时细胞形成粗的纵向微丝束。细胞周边部位的微丝网络可能是这一蛋白的作用靶点,但是由于周边微丝的动态性与不稳定性,通常很难通过***像观察到其变化[4]。重力刺激可能调控某些细胞骨架结合蛋白的活性,进而引起细胞骨架重组。如在受到重力刺激的早期拟南芥根的柱状细胞和玉米的胚芽鞘细胞质的pH值发生改变,ADF的活性受到磷酸化与去磷酸化的调控。在高的pH值条件下ADF调控微丝的解聚,并可能因此改变平衡细胞中微丝骨架的动态性。

3.2微管结合蛋白

与微丝相似,微管重组的过程中微管聚合和解聚的调节可能与结合蛋白有关。利用拟南芥突变体分析微管结合19蛋白的功能取得了巨大的进展。最近发现的细胞壁束间纤维束机械强缺失突变体(fra2)和下胚轴减少伸长突变体(botero 1)都表现为周边微管的扰乱。

4细胞骨架与高等植物向重性的关系

细胞骨架不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还参与许多重要的生命活动。如在细胞***中细胞骨架牵引染色体分离;在细胞物质运输中,各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运;在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。

研究认为,细胞骨架一方面在细胞质中形成网络,受到沉淀的淀粉体的牵动,另一方面与质膜上的受体相互作用,激活受体,启动重力信号传导过程。最近的研究表明,细胞骨架不仅是细胞感受重力信号的重要环节,而且对根尖细胞中的生长素运输起重要的调控作用。对生长素运输载体(PIN)突变体根向重力性反应的研究表明,生长素的极性运输与其向重力性反应有关。微丝解聚剂(如cytochalasin)可减少生长素的极性运输,也影响根的向重力性[5]。

5结语

细胞骨架和植物细胞向重性研究表明,植物向重性现象是一个集研究细胞骨架排列、信号传导、植物激素行为、植物生长调控于一体的完美系统。传统的研究细胞骨架和植物向重性的方法已加入了新的生物学技术,如免***荧光技术、套笼探针技术和其他新发展的显微技术。免***荧光技术可以观察到向重力性过程中细胞骨架的重排,套笼探针的微注射技术可以观察到细胞骨架的实时动态变化过程[6]。利用修饰细胞骨架的荧光报告蛋白可以观察到活细胞中细胞骨架的变化,采用荧光蛋白显示剂监测细胞质中钙和pH值变化已用于保卫细胞中信号传导的研究,以及根的发育和向重力性的研究。

6参考文献

[1] 刘贻尧,王伯初.植物对环境应力刺激的生物学效应[J].生物技术通讯,2000(11):219-222.

[2] 段传入,王伯初,王凭青.水稻茎的结果及其性能的相关性[J].重庆大学学报,26(11):11-13.

细胞骨架篇3

骨组织工程支架材料首先要有良好的细胞相容性，种子细胞能够在支架材料上粘附并生长[1][2]。骨组织经脱钙处理形成脱钙骨基质，移植无明显免***排斥反应[3]，有良好的组织相容性。国内外学者将它作为植骨材料进行了大量的实验和临床应用研究。组织工程研究为脱钙骨基质的应用提供了新的思路，即体外分离培养自体细胞，细胞增殖分化后与脱矿骨基质复合，应用于临床修复工作。目前的脱钙骨产品多为异体完全脱钙的骨基质，在本实验中，我们将部分脱钙骨与hADSC：复合，观察部分脱钙骨的细胞相容性。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂：人脂肪干细胞：由脂肪抽吸组织中分离、培养。部分脱钙骨：由上海组织工程中心提供。3，3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DiO） Mol Probes公司。

1.2 实验方法

1.2.1 hADSCs在部分脱钙骨上粘附率的测定 将第2代hADSCs按5 × 105/0.1 ml/块的浓度接种于5mm × 5mm ×3mm部分脱钙骨支架上，共8块，将细胞支架复合物于37℃ ， 5%二氧化碳培养箱中放置4h后，换于另一平皿，加入培养液，将原平皿中加入0.25%胰酶0.02%EDTA，消化收集细胞，计数仪计数，得出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24h后，将细胞材料复合物于培养液中轻轻晃动，并换入另一培养皿培养，收集原培养皿培养液，加0.25%胰酶0.02%EDTA于原培养皿中消化收集贴壁的细胞，并与原培养液中细胞一并计数，得出未粘附的细胞数。细胞粘附率=（接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞）/（接种的细胞数-流失的细胞数）。

1.2.2 ALP定量检测

3 讨论

细胞在材料上的粘附率是评价组织工程支架材料的重要指标，我们检测了人脂肪干细胞在部分脱钙骨上的粘附率。实验结果也表明，人脂肪干细胞能较好地粘附在部分脱钙骨上，在部分脱钙骨的表面及内部孔隙中都能粘附，并能正常生长。符合骨组织工程支架材料的基本要求。人脂肪干细胞与部分脱钙骨的粘附率为96%，与Kasten的研究结果相符合。

ALP是成熟成骨细胞标志酶之一，通过检测成骨的重要指标ALP表明，对成骨诱导的hADSCs在三维立体培养环境下ALP仍呈上升趋势，14d达高峰，随后下降。表明细胞在支架材料上三维诱导培养时仍表达成骨细胞表型，体外实验支持成骨。

参考文献：

[1] Li， H.， Dai， K.， Tang， T.， et al. Bone regeneration by implantation ofadipose-derived stromal cells expressing BMP-2. Biochem Biophys Res Commun， 356： 836-842， 2007.

细胞骨架篇4

【摘要】

目的： 观察体外重组高迁移率族蛋白B1（HMGB1）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌释放白介素-6（IL6）的量效关系，探讨细胞骨架在HMGB1诱导HUVEC释放IL6中的作用。方法： 构建原核表达质粒并表达纯化HisEGFPHMGB1及HisEGFP融合蛋白，刺激体外培养的HUVEC；利用液相芯片分析系统观察HMGB1及相关细胞骨架抑制剂作用或低温培养作用下细胞分泌IL6因子的情况。结果： 酶切和DNA测序证明所构建原核表达载体正确，表达纯化的重组蛋白经SDSPAGE电泳鉴定大小正确，刺激体外培养HUVEC后IL6高表达且具有明显量效关系；Nocodazole、Cytochalasin D等细胞骨架抑制剂作用及低温培养后可明显抑制IL6表达。结论： 体外重组的人HMGB1蛋白可以有效诱导HUVEC分泌和释放IL6，而细胞骨架结构在此过程中起重要作用，并具有明显的能量依赖性。

【关键词】 高迁移率族蛋白质类 细胞骨架 内皮 血管 脐静脉 人 白细胞介素6

［Abstract］ Objective: To understand the role of cytoskeleton in the expression of interleukin6 (IL6) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under the stimulation of the fusion HMGB1 protein. Methods: The coding sequence of HMGB1 was amplified and subcloned into pET14bMCSEGFP plasmid for the construction of fusion protein expressing vector. The recombinant vector was transformed and the expression of fusion protein was induced and purified. The fusion proteins and different cytoskeleton inhibitors were added to the cell culture media of HUVECs and IL6 level in the supernatant of the cell culture media was measured with LiquiChip system. Results: The recombinant vector was identified by PCR， endonucleases digestion and DNA sequencing. After protein was expressed and purified， the molecular mass and purity were assessed by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE). High level expression of IL6 was detected in cell culture media dosedependently after stimulation of HMGB1. IL6 level was significantly decreased if be pretreated with Cytochalasin D and nocodazole or under the low temperature incubation. Conclusions: The fusion protein HMGB1 can induce the expression of IL6 in HUVECs effectively and cytoskeleton may play an important role in this process.

［Key words］ high mobility group proteins；cytoskeleton；endothelium， vascular; umbilical veins; persons；interleukin6

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1， HMGB1）广泛存在于真核细胞核中，具有多种重要的生物学功能，其作为核蛋白参与多种基因的表达调控，同时又可以被分泌到细胞外参与炎症反应、肿瘤发生和转移、神经细胞生长等重要生理病理过程。在由脓毒症引发的严重的全身炎症反应过程中，HMGB1参与并起重要作用。在炎症反应中，致炎物刺激细胞后延迟释放的HMGB1通过内分泌和旁分泌的形式又作用于单核、内皮等多种细胞，引起更多的炎症因子的释放和黏附分子的表达，引起级联放大的效应，导致炎症反应的进一步扩大。HMGB1作用于细胞导致炎症反应放大的相关信号过程是近几年国内外研究热点，本实验构建表达体外重组的HMGB1蛋白，并引入增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）作为内对照，观查HMGB1对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell ，HUVEC）中IL6的诱导表达情况，并初步研究细胞骨架在其中发挥的作用。

1 材料和方法

1.1 试剂

引物由上海博亚生物公司合成，1 kb DNA分子标准、KOD plus DNA聚合酶、限制性内切酶Kpn I、T4 DNA 连接酶购自日本ToYoBo公司，LB细菌培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco BRL公司，琼脂糖购自西班牙Biowest公司，质粒微量提取试剂盒和DNA 纯化回收试剂盒购自美国Ugene公司，胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，Ni2+NTAagrose、异丙基硫代βD半***糖苷（isopropyβDthiogalactopyranoside， IPTG）、细胞因子检测试剂盒等购自德国Qiagen公司，Bradford蛋白定量试剂盒购自德国Merck公司。

1.2 质粒和菌株

pET14bMCSEGFP由本室改造并保存，pGEX4THMGB1由日本Kimitoshi Kohno博士惠赠，大肠杆菌株DH5、BL21(DE3)由本实验室保存。

1.3 融合蛋白表达载体的构建

用含有Kpn I酶切位点的上游引物5'catggtaccggcaaaggagatcctaagaagc3'，下游引物5'catggtaccttcatcatcatcatcttcttcttcat3'，从质粒pGEX4THMGB1上扩增HMGB1编码序列，插入载体pET14bMCSEGFP中。以高保真DNA聚合酶KOD plus行PCR反应，产物琼脂糖凝胶电泳回收后与质粒pET14bMCSEGFP行酶切反应，产物凝胶电泳回收后行去磷酸化反应，用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提1次，乙醇沉淀回收。T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接，连接反应产物转化DH5α感受态菌并接种到Amp+的LB琼脂培养板继续培养。挑取单菌落接种于AmpI+的LB培养液中扩增，小量提取质粒，行PCR、酶切及测序鉴定。构建所得原核表达载体命名为pET14bMCSHMGB1EGFP。

1.4 融合蛋白的表达和纯化

构建所得的载体pET14bMCSHMGB1EGFP及原载体pET14bMCS EGFP分别一步法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；挑取单菌落，接种于5 ml Amp+的LB培养液中，过夜培养后按1∶100扩大，培养至A600=0.5～0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导培养5～6 h。依照His·BindTM Kit操作说明，离心（5 000×g，4 ℃，5 min）收集菌液，每200 ml培养液所得细菌沉淀以5 ml结合缓冲液重悬，冰上超声裂解细菌细胞，离心除去沉淀（39 000×g，4 ℃，20 min），收集上清液；将上清液转入加有Ni2+NTAagrose的层析柱中，用10倍体积的冲洗缓冲液洗涤3次，用0.5 ml洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。SDSPAGE电泳检测纯化的各融合蛋白。洗脱的融合蛋白用3 kD截留生物半透膜透析脱盐，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，并应用Bradford法进行蛋白定量。

1.5 HUVEC的分离和培养

将取自胎儿的新鲜脐带以无LPS的DHanks液冲洗内皮2～5次，每次10～20 ml；将脐静脉内淤血冲洗干净后，以1 g/L胶原酶37 ℃消化脐静脉内皮12～15 min，然后用含血清RPMI 1640培养基反复冲洗内皮；收集消化液及冲洗液，1 200 r/min离心8 min；弃去上清液，用含20% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，并于含20% FBS、100 μg/L内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养液中，37℃、5% CO2条件下培养。次日换液，除去未贴壁细胞，以后根据细胞生长情况每2～3 d换液一次。倒置显微镜观察传代细胞形态，Ⅷ因子相关抗原免***荧光检测鉴定为血管内皮细胞。

1.6 细胞的处理及待测样品的制备

于实验前24 h将HUVEC以1.5×104细胞/孔铺于96孔板中。24 h后更换无血清、无内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养基继续培养，12 h后撤去培养上清液，加入含有重组融合蛋白或不同抑制剂的无血清、无内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养液，于37 ℃，5 % CO2培养箱中继续培养，一定时间后收集细胞培养上清液于-80 ℃保存待测。抑制剂处理组先以5 μmol/L Nocodazole或5 μmol/L Cytochalasin D分别预处理细胞1 h，再加入50 nmol/L的HisHMGB1EGFP蛋白。

1.7 细胞因子含量的检测

利用液相芯片分析系统（LiquiChip）对待测细胞培养上清液中IL6含量进行检测。待测细胞培养上清液于-80 ℃保存，检测前14 000 r/min离心15 min，取50 μl上清液加入96孔过滤板中，加入25 μl偶联有抗人细胞因子抗体的球形基质（一抗），漩涡混匀，室温避光振摇2 h。然后用真空泵从反应板底部将各孔中液体除去，加入75 μl检测缓冲液，轻轻振摇后，再次抽去液体，每孔加入75 μl检测缓冲液和25 μl生物素化的二抗，室温避光振摇1.5 h；每孔加入25 μl链霉亲和素偶联的藻红蛋白（phycoerythrin）溶液，室温避光振摇0.5 h；每孔加入25 μl终止缓冲液，室温避光振摇5 min后，用真空泵从反应板底部将各孔中液体除去，每孔加入125 μl测定缓冲液，室温避光振摇1 min；最后在LiquiChip液相蛋白芯片检测系统上读取各孔荧光强度。利用公司提供的标准品样品建立荧光强度和浓度标准曲线，根据标准曲线和待测样品荧光读值得到样品的细胞因子浓度。

1.8 统计学处理

运用SPSS 11.0软件进行统计学分析，所有数据用x±s表示。采用析因设计资料的方差分析不同浓度HMGB1对HUVEC表达释放IL6的影响，固定浓度的两组间比较采用随机设计的t检验，不同浓度间比较、不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响采用Oneway ANOVA方差分析，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 重组质粒pET14bMCSHMGB1EGFP的鉴定

对构建质粒pET14bMCSHMGB1EGFP行PCR、酶切鉴定（***1），PCR扩增产物电泳可见特异的约650 bp的DN***段，与插入的DNA序列大小相符；BamH I单酶切鉴定产物电泳可见5 kb和1.2 kb两条带，表明单点插入方向正确。DNA测序结果显示，质粒构建正确。

2.2 HisHMGB1EGFP融合蛋白的表达和纯化

经IPTG大量诱导、His亲和树脂层析纯化目的蛋白、透析脱盐和过滤除菌后，取少量蛋白样品行SDSPAGE电泳和Bradford法蛋白定量，结果显示得到较纯净的重组融合蛋白HisEGFP和HisHMGB1EGFP，蛋白分别约32 kD 和55 kD（***2），与理论值一致，所得浓度满足实验要求。

2.3 重组HMGB1蛋白对HUVEC细胞表达释放IL6的影响

以重组蛋白HisEGFP为阴性对照，以不同浓度HisHMGB1EGFP刺激HUVEC，24 h后检测培养上清中IL6含量，结果表明（表1，***3），不同HMGB1浓度组IL6升高值有显著意义，表明HMGB1作用于HUVEC可以显著诱导细胞表达释放IL6。50 nmol/L的HMGB1已经可以显著诱导IL6的表达和释放，刺激浓度为100 nmol/L时，IL6的释放水平已基本进入平台期。表1 HMGB1蛋白对HUVEC表达释放IL6的影响（略）注：（1）P＜0.001。

2.4 不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响

以空白处理为阴性对照，单独HisHMGB1EGFP处理为阳性对照，分别用Nocodazole、Cytochalasin D预处理或4 ℃条件培养观察终浓度为50 nmol/L HisHMGB1EGFP蛋白刺激细胞结果。于蛋白加入后6 h收集培养液上清检测IL6的含量。结果表明（表2），同阳性对照相比，Nocodazole、Cytochalasin D预处理以及低温条件培养处理均使IL6下降，具有显著性差异。表明各抑制剂均可有效抑制HMGB1诱导HUVEC释放IL6的作用。表2 不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响（略）注：方差分析F=292.88，P

3 讨论

HMGB1是高迁移率蛋白超家族成员，广泛存在于真核细胞核中，是重要的非组蛋白之一 [1]。HMGB1具有极其丰富的生物学功能，可通过使染色质或DNA构形发生变化，调节转录起始复合物的形成，从而在基因表达调控中起重要作用[1]。研究还发现HMGB1可以被分泌到胞质或胞外，广泛参与炎症反应、肿瘤发生和转移、神经细胞生长等重要生理病理过程[2]。脓毒症是由感染引起的严重的全身炎症反应综合征[3]，是临床危重患者的重要死因之一。HMGB1参与了脓毒症的发病过程[4]，在致炎刺激脂多糖和TNFα、IL1活化单核巨噬细胞后8～32 h的延迟后释放HMGB1到细胞外，释放入血的HMGB1通过内分泌和旁分泌形式作用于单核、内皮等多种细胞，引起一系列炎症因子的释放和黏附分子的表达，导致炎症反应的进一步扩大[5]。研究表明，HUVEC受HMGB1刺激后可上调表达细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1、E-选择素和IL8等[6]。此外，HMGB1还进一步刺激巨噬细胞释放更多的HMGB1入血，引起炎症的级联放大效应。HMGB1参与炎症反应的分子基础，特别是其诱导炎症细胞释放炎症因子的相关信号过程是近几年国内外研究热点[7]。晚期糖基化终末产物受体，Toll样受体2和Toll样受体4陆续被鉴定为HMGB1在细胞表面的受体[8，9]，细胞内一些相关信号分子也得到鉴定。然而当阻断细胞表面所有这些受体仍不能完全抑制HMGB1对细胞的作用，表明HMGB1诱导炎症反应的相关信号机制存在着极大的复杂性[10]。

细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力，保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，包括染色体分离、细胞中各类小泡和细胞器的定向转运以及白细胞迁移、***游动、神经细胞轴突伸展等[11，12]。此外，研究表明，在多种信号分子的信息传递过程中，细胞骨架也可能起重要的作用。

本研究发现体外重组的人HMGB1刺激HUVEC诱导IL6的表达释放增多，50 nmol/L的刺激浓度就具有显著意义，而100 nmol/L的刺激浓度时IL6的释放基本到达平台，表明所构建的蛋白具有较好的生物活性和刺激灵敏度。

细胞松弛素D可切断肌动蛋白微丝纤维，并结合在微丝末端抑制肌动蛋白加合到微丝纤维上；而诺考达唑是有效的微管解聚剂，特异性的抑制微管功能。实验中发现这两种药物都能有效地抑制IL6的释放，表明细胞在受到HMGB1刺激释放IL6的过程和细胞骨架是密切相关的，而具体的影响机制还有待于进一步的研究。此外，细胞在低温培养条件下不能受HMGB1诱导释放细胞因子，这表明这一诱导表达过程具有能量依赖性，也进一步支持了细胞骨架参与了这一过程的结论。

我们所构建的HMGB1融合蛋白引入了EGFP标签，同时表达纯化了HisEGFP融合蛋白作为对照，相比以往类似实验采用无关蛋白作为对照更加合理。同时，两种蛋白在表达纯化过程中的操作一致性，可进一步排除纯化过程对结果带来的干扰，包括高盐洗脱液以及裂解细菌的内毒素污染等。结果表明，与HisEGFP相比较，HisHMGB1EGFP引起的IL6水平的增高具有显著的统计学意义，这些蛋白和方法的构建也为进一步研究奠定了基础。

参考文献

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[10]Yang H， Wang HC， Czura CJ， et al. The cytokine activity of HMGB1 [J]. J Leukoc Biol， 2005(1): 1-8.

细胞骨架篇5

【摘要】 目的：尝试构建基于脂肪干细胞、I型胶原凝胶以及PLGAβTCP支架的新型仿生骨组织工程复合体，并对其生物学性能进行研究. 方法：取3 mo龄日本大耳白兔皮下脂肪，获得脂肪干细胞，经体外成骨诱导分化鉴定后使用I型胶原凝胶将其悬浮并与三维多孔支架PLGAβTCP复合，从而构建成脂肪干细胞I型胶原凝胶/PLGAβTCP骨组织工程复合体，体外成骨诱导培养2 wk，实验以脂肪干细胞/PLGAβTCP材料复合体作为对照. 扫描电镜观察复合情况，并对脂肪干细胞的增殖以及成骨诱导分化情况进行检测. 结果：I型胶原凝胶将rADSCs均匀悬浮于材料孔隙中，碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度检测显示I型胶原凝胶能显著促进rADSCs的成骨分化. 结论：脂肪干细胞I型胶原凝胶/PLGAβTCP复合体的构建成功为骨组织工程复合体的设计提供了一条新的思路.

【关键词】 脂肪干细胞； I型胶原凝胶； PLGAβTCP支架； 骨组织工程

【Abstract】 AIM: To fabricate a novel bone tissue engineering construct using collagen I gel to suspend adiposederived stem cells (ADSCs) into a porous PLGAβTCP scaffold (rADSCsCOL/PLGAβTCP) and explore its potentiality for bone tissue engineering. METHODS: ADSCs were prepared by collagenase I digestion of subcutaneous fat from the suprascapular site of Japanese white rabbit. Firstly， the osteogenic differentiation of rabbit ADSCs (rADSCs) was identified by von Kossa staining after in vitro culture for 4 weeks under osteogenic medium. Then the rADSCsCOL/PLGAβTCP composite was fabricated using collagen I gel to suspend rADSCs into PLGAβTCP scaffold and cultured under osteogenic medium for 2 weeks. Meanwhile， the single combination of rADSCs and PLGAβTCP scaffold was also prepared as control. Morphological observations were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Cell proliferation， alkaline phosphatase activity and calcium deposit were also determined to fully evaluate the osteogenic differentiation of rADSCs in both composites. RESULTS: By presuspended in collagen I gel， the rADSCs were evenly distributed in the pores of the PLGAβTCP scaffold. Furthermore， collagen I gel remarkably promoted the osteogenic differentiation of rADSCs in PLGAβTCP scaffold. CONCLUSION: The successful fabrication of rADSCsCOL/PLGAβTCP composite casts a new light on the construction of bone tissue engineering composites.

【Keywords】 adiposederived stem cells; collagen I gel; PLGAβTCP; bone tissue engineering

0 引言

生物支架材料是骨组织工程研究中的一个重要环节［1］. 目前常用的生物材料例如高分子聚合物、生物陶瓷等，在与种子细胞复合过程中仅仅能够起到机械性支架作用，而缺乏生物活性，在与种子细胞复合以后，难以与其形成良好互动，对其进一步的增殖、成骨分化施加积极影响. 而I型胶原作为骨组织中主要的有机成分，在骨形成过程以及维持正常骨结构中发挥了重要作用［2］. 为此，我们从仿生学角度考虑，初步尝试利用I型胶原凝胶悬浮脂肪干细胞（adiposederived stem cells， ADSCs）与三维多孔支架PLGAβTCP复合构建一种新型仿生骨组织工程复合体，并对其生物学性能进行研究，以探讨将其应用于骨缺损修复的可行性.

1 材料和方法

1.1 材料 3 mo龄成年日本大耳白兔，由第四***医大学实验动物中心提供；DMEM培养基、地塞米松、抗坏血酸、β甘油磷酸钠、Ⅰ型胶原酶、磷酸对硝基苯酚（PNPP）、对硝基苯酚（PNP）均购自SIGMA公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；碱性磷酸酶检测试剂盒购自上海仁宝试剂公司；细胞外钙定量检测试剂盒（Calcium C kit， WAKO Pure Chemical Industries）.

1.2 方法

1.2.1 兔ADSCs（rabbit ADSCs， rADSCs）的原代培养 3 mo龄成年日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气处死. 常规备皮，消毒，取其颈背部皮下脂肪. 分离肉眼可见的筋膜、血管，无菌PBS冲洗3遍，眼科剪将组织剪成1～2 mm3组织块，置于1.5 g/L Ⅰ型胶原酶中于37℃消化1 h. 100目筛网过滤后900 r/min离心10 min，用普通培养液（含100 mL/L胎牛血清的DMEM）重新悬浮、接种. 待细胞达90％汇合时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.

1.2.2 rADSCs的成骨诱导分化鉴定 采用第3代rADSCs，以105个/孔接种于6孔板，待其完全贴壁后于普通培养液中加入10-7 mol/L地塞米松、抗坏血酸50 mg/L和10 mmol/L β甘油磷酸钠进行成骨诱导，4 wk后采用冯库萨（von Kossa）钙染色法检测诱导分化情况.

1.2.3 PLGAβTCP支架的制备 由清华大学激光快速成型中心将聚***酸聚乙醇酸（PLGA）［polylactide (50%)coglycolide (50%)］与β磷酸三钙（βTCP）按照7∶3，W/W的比例经快速成型技术低温沉积工艺制成［3］，具有良好的孔隙率（>90 %）以及孔径（300 ～350 μm）.

1.2.4 I型胶原凝胶溶液的制备 将I型胶原用100 mL/L，V/V醋酸溶解并定容至50 mg/L，然后将其以10∶1∶1的比例与10×的DMEM及胎牛血清混合，最后使用1 mol/L NaOH调整溶液pH至7.4. Co60消毒灭菌，置于4℃备用.

1.2.5 rADSCsI型胶原凝胶/PLGAβTCP骨组织工程复合体的构建（rADSCsCOL/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其达100％汇合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、离心，于冰浴条件下使用100 μL I型胶原凝胶溶液以2×109个/L的密度悬浮细胞并均匀滴加于PLGAβTCP支架材料孔隙中，37℃作用0.5 h以使胶原凝胶溶液凝结. 最后加入成骨诱导培养液于37℃ 50 mL/L CO2条件下进行成骨诱导培养. 同时设立无细胞I型胶原凝胶/PLGAβTCP复合体作为对照（COL/PLGAβTCP）.

1.2.6 rADSCs/PLGAβTCP骨组织工程复合体的构建（rADSCs/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其达100％汇合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、离心，以2×109个/ L的密度悬浮细胞. 取100 μL细胞悬液均匀接种于预处理的PLGAβTCP支架中. 于37℃ 50 mL/L CO2条件下共培养4 h，使细胞与材料充分复合. 最后加入成骨诱导培养液进行培养. 同时设立空白PLGAβTCP支架材料作为对照.

1.2.7 材料中细胞增殖检测 于接种后4 h和第1，3，7，10，14 d进行细胞增殖测定. rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组：将培养液吸除后加入20 g/L的I型胶原酶于37℃条件下作用45 min以彻底分解I型胶原纤维，等量培养液中和后将细胞悬液吸出并于1200 r/min离心10 min. rADSCs/PLGAβTCP复合体组：将培养液吸出后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，等量培养液中和，900 r/min离心9 min. 最后将细胞团块重新悬浮于培养液中进行细胞计数并计算初始细胞接种密度（复合细胞数量/总细胞数量）（每组每个时间点共有4例标本）.

1.2.8 碱性磷酸酶活性检测 采用PNPP法. 步骤：于诱导培养第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP复合体细胞（实验方法同1.2.7）. 将两组细胞经超声裂解后，加入PNPP于37℃反应30 min，0.1 mol/L NaOH中止反应. 于405 nm处读取A值. 参照总蛋白定量以及预先绘制的PNP标准曲线，将碱性磷酸酶活性单位定义为每分钟每微克总蛋白中所含PNP纳摩尔数（nmol PNP/μg protein/min）（每组每个时间点共有4例标本）.

1.2.9 细胞外基质矿化程度检测 采用OCPC法. 于诱导培养第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP以及rADSCs/PLGAβTCP复合体细胞（方法同1.2.7），加入0.5 mol/L HCl于常温下过夜，将细胞外不溶性钙盐分解成可溶性钙离子，实验操作按照Calcium C Kit说明书进行. 钙离子浓度以μg/105个细胞表示（每组每个时间点共有4例标本）.

1.2.10 形态学观察 在诱导培养2 wk后，将各组复合体取出，进行扫描电镜观察. 实验步骤：无菌PBS冲洗3遍，2.5 g/L戊二醛固定，逐级梯度酒精脱水，临界点干燥. 经表面喷金后置于镜下观察.

统计学处理： 所有计数资料均采用x±s表示，采用SPSS 11.0 软件进行配对t检验， P

2 结果

2.1 rADSCs的体外培养及成骨诱导分化鉴定 于体外培养条件下，原代培养rADSCs呈成纤维细胞样，传代后细胞形态变化不大，仍呈梭形、三角形，增殖能力旺盛. 连续培养至第15代仍保持良好的细胞形态与增殖能力（***1A）. 换用成骨诱导液干预4 wk后经von Kossa染色可见细胞及其周围附着的钙盐与硝酸银发生置换反应而被染成黑色，说明此时细胞外基质矿化，成骨分化基本完成（***1B）.

A：原代培养rADSCs 相差 ×100；

B：von Kossa染色 相差 ×200.

***1 体外培养兔ADSCs细胞（略）

2.2 材料中的细胞增殖情况 rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组的初始细胞接种密度为(97.20±2.30)%，而rADSCs/PLGAβTCP复合体组仅为(36.50±3.80)%，前者显著高于后者（n=4，P

2.3 碱性磷酸酶活性定量检测 诱导培养1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组碱性磷酸酶活性为(0.27±0.02) nmol PNP/μg protein/min， 而rADSCs/PLGAβTCP复合体组为(0.14±0.02) nmol PNP/μg protein/min，前者显著高于后者；诱导培养2 wk后rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组碱性磷酸酶活性则高达(0.85±0.27) nmol PNP/μg protein/min，显著高于rADSCs/PLGAβTCP复合体组(0.51±0.14) nmol PNP/μg protein/min，两组差异具有统计学意义（n= 4， P

2.4 细胞外基质矿化程度检测 诱导培养1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组细胞外基质矿化程度［(23.69±3.50) μg/105个细胞］与rADSCs/PLGAβTCP复合体组［(20.90±1.68) μg/105个细胞］差异无统计学意义（n= 4， P>0.05）；而2 wk后前者［(71.88±2.89) μg/105个细胞］则显著高于后者［(48.10±2.77) μg/105个细胞］（n=4， P

2.5 形态学观察 扫描电镜显示，PLGAβTCP支架材料为规则的相互交通的多孔状三维立体结构（***2A），而对于无细胞COL/PLGAβTCP复合体组，可以看到I型胶原纤维均匀分布于材料表面及孔隙中（***2B）. 在rADSCs/PLGAβTCP复合体组中，rADSCs仅贴附于材料表面，孔隙中没有细胞长入(***2C). 然而在rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组中，材料孔隙被悬浮于胶原凝胶中的rADSCs所完全充填(***2D). 复合细胞共培养2 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP复合体组中的rADSCs在材料孔隙中均呈成纤维细胞样生长(***2E，F).

A: PLGAβTCP支架材料（：材料的小梁， ：材料的孔隙） ×60；B: COL/PLGAβTCP复合体 ×70；C: rADSCs/PLGAβTCP复合体 ×50；D: rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体 ×50；E: 为C***白框的放大，rADSCs贴附于材料表面呈复层生长（: rADSCs） ×300；F: 为D***白框的放大，rADSCs填满材料的孔隙（: I型胶原凝胶经扫描电镜样品处理程序处理后所形成的胶原颗粒， : rADSCs） ×200.

***2 扫描电镜观察（略）

3 讨论

在骨组织工程复合体的构建过程中，三维多孔支架材料所具有的孔隙率以及孔径大小具有重要意义. Karageorgiou等［4］报道的当支架材料具有良好的孔隙率以及孔径大于300 μm时，在体内能够明显促进新生骨组织形成以及新生血管长入，从而能够在骨缺损修复过程中发挥重要作用. 然而，良好的孔隙率以及孔径往往会导致种子细胞在与材料复合时的大量丢失. 本研究采用具有良好的骨缺损修复能力的PLGAβTCP 作为支架材料［3，5］. 实验结果显示直接将rADSCs滴加于PLGAβTCP材料时，仅有一少部分细胞成功与材料复合，大部分细胞由于材料的孔隙率而丢失. 因此，具有良好的孔隙率以及孔径的支架材料虽然具有良好的骨传导性，但是由于其表面积相对有限，采用传统直接滴加细胞的接种方式并不能够促成细胞在材料孔隙中的均匀分布.

为了解决这个问题，在本实验中I型胶原凝胶被用来实现脂肪干细胞与材料的均质复合. I型胶原凝胶作为水凝胶类支架的一种，其所具有的半固体、半液态的特点使其不仅能够相对容易的实现细胞的均匀分布，而且能够通过物理性捕获效应将大量细胞限制于其中，一方面解决了细胞与材料的复合问题，另一方面也解决了在接种过程中细胞的丢失问题. 此外，作为正常骨组织结构中主要的有机成分， I型胶原能够调控细胞黏附［6］，促进成骨细胞的增殖［7］、分化并能够引导骨组织再生［8］. 因此，在本实验中我们使用PLGAβTCP多孔支架、rADSCs以及I型胶原凝胶来构建了一种新型仿生骨组织工程复合体. 实验结果显示I型胶原凝胶能够显著促进复合体中rADSCs的碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度（rADSCsCOL/PLGAβTCP复合体组＞rADSCs/PLGAβTCP复合体组，P

综上所述，我们通过将rADSCs悬浮于I胶原凝胶后再与PLGAβTCP支架复合构建了一种新型仿生骨组织工程复合体（rADSCsCOL/PLGAβTCP），与传统直接滴加细胞接种方式所构建的复合体相比（rADSCs/PLGAβTCP），本研究采用的构建方法材料孔隙中的rADSCs分布均匀且密度高，进一步体外成骨诱导分化相关检测显示I胶原凝胶能够显著促进rADSCs在材料中的成骨分化，为骨组织工程复合体的构建提供了新的思路.

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细胞骨架篇6

对力学刺激的识别和反应是生物体的重要功能。触觉、听觉、压力感受器、本体感受器及重力感受功能都与力学信号的感受、传递机制有关。体内组织的形成、发展方式与其所受的应力有关，例如骨组织的结构与其内部应力分布有关，应力大的部位骨组织密度大，应力小的部位骨密度小［1］。骨组织能用最少的骨量来满足运动功能所需的骨强度。当因衰老或力负荷减少使骨量下降时，应力小的部位骨量丢失常常较快，应力大的部位骨量保存常常较好。可见骨组织能根据外界负荷和内部应力来调节整体骨量的增减和内部骨量的分布及构造。但骨组织对力负荷的感受、传递和反应机制还不十分清楚，这也正是骨代谢研究中的重点课题。本文根据目前的研究进展和有关学说，试***对骨组织的力负荷感受机制进行阐述和探讨。

1　骨细胞是骨组织的力负荷感受细胞

骨表面有骨衬细胞(bone-lining cell)、成骨细胞和破骨细胞，其中骨衬细胞占94%，成骨细胞占5%。埋于基质中的低活性成骨细胞称为骨细胞(osteocyte)。骨衬细胞与骨细胞极相似，也是由成骨细胞活性下降转化而成，但位于骨的表面。骨衬细胞为扁平细胞，细胞器较少，蛋白合成和能量代谢较慢。骨细胞和骨衬细胞有许多突起，深入矿化基质的骨小管(canaliculi)内。细胞突起的浆膜和骨小管壁之间充满了骨组织间液和大分子蛋白聚糖。骨细胞突起长约15mm，能穿过骨小管与相邻细胞的突起相接触。每个骨细胞与多个细胞相连，最多可达12个。两个相接触的突起构成缝隙连接，连接蛋白为connexin43［2］。离子和小分子物质可以通过缝隙连接在细胞间传递，缝隙连接也是细胞间的电信号传递的通道。所有的骨细胞与骨内、外膜上的骨衬细胞、成骨细胞通过缝隙连接构成多极的网状结构，局部的反应信号能迅速传递到整个骨组织。

在骨骼系统中哪种细胞最有条件成为骨力学感受器呢?破骨细胞首先可排除，因其只有在骨吸收时才出现。骨衬细胞可认为是在骨表面的骨细胞。成骨细胞位于骨的表面，必须通过骨基质才能感受应力，但骨的应变很小，这需要很高的灵敏度，而且成骨细胞与矿化基质之间还存在类骨层(osteoid layer)，它也不太适合于充当力学感受器。只有骨细胞最适合成为骨组织的力学感受器，首先骨细胞广泛分布，其位置适合于感受骨组织的应变，能直接感受骨应变产生的液体流动；其次骨细胞对液体流动的剪切力极为敏感。当然这并不否认成骨细胞的力负荷感受能力，因为成骨细胞是骨细胞的前身。

用脉冲液体流动和间歇液体静压力分别处理培养的骨细胞、成骨细胞、骨膜成纤维细胞，发现3种细胞的前列腺素E2(PG E2)的产量都升高，但骨细胞的PG E2升高最快［3］。骨细胞受到脉冲液流作用1小时后，其PG E2产量升高可维持1小时以上，而间歇静压力需要6小时才能出现此变化。实验结果表明，骨细胞的力学感受敏感性＞成骨细胞＞成纤维细胞，骨细胞对流体剪切力的敏感性大于液体静压力。

采用Biot［4］的小孔调节理论来计算，可知：生理范围内的骨力学负荷所产生液体流动的剪切力峰值为0.8～3.0Pa。经实验可知，体外培养骨细胞能感受的流体剪切力范围是0.2～6.0Pa［4］，实验结果基本与理论计算相符合，表明体内骨细胞能感受骨力学负荷产生的液体剪切力。

骨细胞受到液体剪切力后引起PG和NO的产量升高，这与血管内皮细胞相类似。内皮细胞可以感受和调节血液流变力学的变化，当血流剪切力达到0.5Pa时，内皮细胞增加PG和NO的产量，使血管舒张，以保持恒定的血管内剪切压力。骨细胞可能与内皮细胞相类似，调节骨适应性再建，使骨保持稳定的应变和稳定的骨小管内液流剪切力。

2　整合素(integrin)将细胞膜外的应力传递入细胞膜内的细胞骨架

整合素是介导细胞与细胞外基质粘附分子，是细胞膜表面糖蛋白受体，主要通过识别配体的“精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸”三肽序列(Arg-Gly-Asp,RGD)介导粘附。骨细胞与基质的粘合并非均匀，细胞膜上的整合素将细胞“点焊”到胞外基质。整合素跨越细胞膜，向外与基质的纤维连接素(FN)、骨桥蛋白(OPN)、骨唾液蛋白(BSP)相连；向内与粘着斑相连。粘着斑由肌动蛋白(actin)、踝蛋白(talin)、桩蛋白(paxillin)、粘着斑蛋白(vinculin)和张力蛋白(tensin)组成，将细胞骨架固定在细胞膜上［5］。

Wang等［6］用RGD肽段包被的微小磁性铁珠黏附在内皮细胞的细胞膜上，然后用磁场扭转磁性珠使整合素受力而不改变细胞的形态，发现细胞骨架的内在硬度(stiff=应力/应变)随着整合素所受应力的增大而增大，并且抑制磁珠的旋转；用含RGD的可溶性多肽可抑制细胞骨架内在硬度升高的反应，而不含RGD的可溶性多肽不能抑制此反应。磁珠包被整合素的抗体也能使细胞骨架产生相同的内在硬度升高的反应，而包被非特异蛋白如牛血清蛋白则不能抑制磁珠的旋转。细胞骨架的内在硬度的升高，需要细胞骨架3个组分——微丝、微管、中间纤维的结构保持完整。破坏微丝的完整性可导致细胞骨架的内在硬度下降85%，破坏微管和中间纤维的完整可使内在硬度下降25%。从以上实验结果可以得出以下结论：整合素是细胞膜上的应力信号受体，将应力传递给细胞骨架后引起细胞骨架的重排和内在硬度增大。

骨组织抵抗力负荷而产生应变，骨小管和骨陷窝中的骨组织间液因压力的变化而流动。当液流经过骨细胞时，流体的剪切力使骨细胞膜上整合素与基质蛋白的联结产生应变，使整合素的形态发生改变，从而激活酪氨酸激酶如粘着斑激酶(focal adhesion kinase)［7］。粘着斑激酶通过自身磷酸化而激活，启动桩蛋白、张力蛋白的磷酸化，加速粘着斑的形成。随着粘着斑的形成，流体剪切力通过细胞外基质蛋白经整合素透过细胞膜传递给细胞骨架。

3　细胞骨架的张拉完整性与骨组织的力学敏感性

整合素将应力传递给细胞骨架后，是如何将力学信号转化为生化信号的?要回答这个问题，必须引入一个概念：细胞骨架的张拉完整性。张拉完整性的概念是由Donald E.Ingber引入生物结构研究的［8］。

大分子自装配成细胞器，细胞器自装配成细胞，细胞自装配成组织，组织自装配成器官，指导生物自装配的基本原则为张拉完整性(tensegrity)，能使组件的能量和质量减至最小。张拉完整性为建筑学术语，表示一种机械上自我稳定的方式，它能使张力和压力在结构内得以分散和平衡。张拉完整性结构分为两类，一类为短程线圆顶(网架穹顶)，由刚性支杆构成，每一根支杆都承受张力和压力；另一类为预应力结构，所有的构件都已受到张力或压力，承受压力的刚性支杆将承载拉力的柔性构件(如：绳索)拉直或拉紧，同时承受拉力的柔性构件将刚性支杆压紧。张拉完整性结构有一显著特性，张力能连续传递到所有柔性构件上，一个柔性构件上的张力增加就会造成整个结构内所有柔性构件的张力增加，刚性支杆抵抗张力的局部压力同时增加。张拉完整性结构的构件都定位于承受应力的最佳位置上，张力按两点间最短距离进行传递，能使整体结构达到最大强度。

细胞骨架符合张拉完整性结构，微管作为刚性支杆，抵抗压力；微丝作为绳索，将张力传遍整个细胞，对细胞骨架的内在硬度起主要作用。微丝将细胞膜和所有内部组分拉向核心的细胞核。与微丝向内拉力相抵抗的压力构件是细胞外基质和细胞内的微管及交联微丝。中间纤维作为整合者，将微管和微丝相互连接起来并将它们连接到细胞膜和细胞核上。微丝、微管、中间纤维共同传递应力信号，但以微丝为主。最近的研究表明：微丝网本身就是一种张拉完整性结构［8］。

Maniotis等［8］将微量吸管与细胞表面的粘附分子相连并往外拉，细胞骨架和细胞核的结构立即按照拉力的方向重新调整。细胞膜上某一局部的整合素受到应力刺激，将应力传递给细胞膜下粘着斑内的肌动蛋白(微丝的组分)，再传递到整个细胞骨架，引起整个细胞骨架的重排，但构件的拓扑关系不变。细胞骨架按照应力的方向延伸，这可以解释肌肉、骨骼随着应力而生长，以及植物根部顺着重力而生长。应力使细胞骨架重排时使整个细胞骨架的内在硬度增加。细胞骨架的内在硬度与整合素所受的应力成正比，正是因为细胞骨架的张拉完整性造成的。内在硬度与应力成正比的现象在人造材料上很少见，在生物组织中多见。

细胞受到力学刺激前细胞骨架的应力大小和内在硬度对随后的细胞内反应非常重要。许多酶和其他控制蛋白合成、能量代谢和细胞生长的因子都是以物理方式固定在细胞骨架上，因此细胞骨架的几何形状和内在硬度的改变会影响细胞内的生化反应，如基因的激活和蛋白质的合成。细胞骨架的张拉完整性结构使细胞膜局部的粘附分子受到应力后导致整个细胞作出生化反应。这样力学信号通过细胞骨架的变形而转化为生化信号，从而启动一系列生化反应，如压力敏感离子通道、腺苷酸环化酶及PKC的活性发生变化，使PG、NO和骨桥蛋白的含量升高，最终引起骨量的增加。

细胞通过整合素固定在基质上，当细胞脱离基质时，因细胞内细胞骨架的张拉完整性将细胞变成较圆的球形。当细胞通过整合素固定于基质时，通过张拉完整性将细胞变得扁平、展开、极化。扁平细胞内细胞骨架伸长，感到需要更多细胞来覆盖周围的基质，细胞的***激活。圆形的细胞表明基质上的细胞太多、空间有限，一些细胞必须死亡，细胞凋亡则开始启动。若骨组织所受的力负荷较大，骨细胞膜上的整合素受到基质的牵拉，细胞骨架得到一定程度的展开，使成骨细胞的增殖激活，使骨量增加。若骨组织所受的力负荷较小，骨细胞膜上的整合素感受不到基质的应力或应力减少，细胞骨架得不到充分伸展，骨细胞的凋亡将激活。这可能正是骨骼去负荷后骨量减少的原因。

4　骨组织的电信号传递

骨细胞作为力学感受器，感受到力负荷刺激后，必须将力学信号传递给成骨细胞，因为成骨细胞才是效应细胞，其信号是如何传递的呢?首先骨细胞、骨衬细胞、成骨细胞组成了多极，多联结网络，每个骨细胞与多个细胞联结。一个骨细胞的信号能传递给邻近细胞，直到整个骨表面的细胞。从以往实验可知，骨组织对15～60HZ的力负荷反应敏感［9］。而化学信号如钙离子在细胞间的传递速度，相对于30HZ的力负荷来说，传递太慢。现在一般认为骨细胞间的信号传递为电信号，它的传递速度比化学信号(如第二信使)快得多。应变使骨细胞兴奋后，兴奋电信号通过缝隙连接传递到相邻的骨细胞和成骨细胞，促进成骨细胞的骨形成能力。

Zhang等［10］认为：骨组织受到循环力负荷产生应变-流动电位，引起细胞间的电流。根据细胞间连结子孔径及细胞突起的大小，以及细胞膜的面积和细胞体积，可以计算穿过成骨细胞膜的漏电流及电信号传递的延迟时间。骨细胞间的突起连接，起着低频通过滤器的作用，高频电信号通不过。骨组织间液进入骨小管后压力衰减的时间与电信号传遍整个骨表面细胞的延迟时间为同一数量级，时间的吻合可以使液体流动和电流的传递发生共振，频率为30HZ。这样骨表面细胞间有一个放大的电位和电流，可以作为启动骨再建的信号，这也正是骨组织只对15～60HZ力负荷敏感的原因，因为只有这种频率的力负荷产生的液流才能和电流发生共振。骨组织的力负荷大多源于骨骼肌的收缩，而哺***动物骨骼肌强直收缩的频率正好为15～60HZ，与骨组织敏感的力负荷频率一致。也就是说骨骼对肌肉的强直收缩敏感，当肌肉以15～60HZ这种频率有力收缩时，常能引起骨组织的调节反应。这种频率的巧合只能归于生物进化的结果。

5　骨组织的重力负荷感受机制

骨组织的重力负荷感受机制是近来航天骨代谢研究的重点，现在问题的焦点在于重力负荷感受机制是在细胞水平上还是在组织水平上。也就是说，单个骨细胞或成骨细胞能否不依赖环境的变化而直接感受重力的变化，还是通过感受周围环境作用的应力变化而间接发觉重力的变化。长期航天飞行时肌肉骨骼系统的防护措施一定程度上依赖于此问题的解决。

物体所受的力分为接触力和非接触力。非接触力也称远作用力，如重力和电磁力；接触力如液体静压力、流体剪切力和粘着力。骨组织的力负荷环境调节骨形成和骨吸收的平衡，骨组织感受力负荷的变化，通过骨再建调节骨量和骨结构。

在地球上生物体内的骨细胞受到向下的重力、向上的浮力、液体静压力、流体剪切力和粘着力。人在地面所受最大的力为重力，但对于微观的细胞则不同，最大的受力为粘着力。骨陷窝中的骨细胞为椭圆形，骨细胞半轴约为a=9μm,b=22μm,c=4μm，体积约为88(μm)3=88×10-12(cm)3，因骨细胞密度约为1.1，则骨细胞重量约为1pN，失重时为0。骨细胞所受的浮力为0.9pN，其垂直方向重力和浮力的合力为0.1pN，失重条件下变为0［11］。

骨细胞可以通过整合素与基质形成粘着斑，骨细胞与基层最小距离可为20nm。通常采用流体剪切力来研究细胞与基层的粘着力。目前还没有直接测量骨细胞与基层粘着力的资料，但可以假定骨细胞的粘着力类似于成纤维细胞，从而估计骨细胞的粘着力。成纤维细胞粘着于玻璃板上，当液体剪切力为350dyn/cm2时，大于50%的成纤维细胞开始脱落［12］。可以把剪切力350dyn/cm2作为骨细胞脱离玻璃基层的剪切力，从而可以计算出骨细胞的粘着力为6160pN，而骨细胞重量为1pN，粘着力比重力大3～4个数量级。液体剪切力为5dyn/cm2就能使骨细胞发生反应，其数值大小约为粘着力的1/70，但也相当于骨细胞重量的93倍。

骨细胞粘着力比其重量大这么多，重力的变化相对于粘着力来说，几乎可以忽略不计，似乎骨细胞不能直接感受重力的变化。但有资料表明重力方向能影响微管装配的结构［11］。从牛脑中提取微管蛋白，当重力方向不同时微管蛋白装配成微管的形状不同。因为重力方向的不同，导致微管蛋白分布和流动的方式不同，形成不同的微管蛋白浓度。微管的装配和方向顺着微管蛋白的浓度，产生不同方向的微管，而微管是构成细胞骨架的重要元件，细胞骨架又是骨组织力学感受机制的重要一环，由此可以看出：重力能直接影响骨细胞的结构，骨细胞能直接感受重力的变化。但这观点还有待于进一步证实。也有人认为，就算骨细胞能直接感受重力的变化，也不太可能导致失重骨丢失，因为持续不变的力对骨再建影响很小，骨的调节反应只能识别变化的力。

从细胞水平来说，失重对骨的影响似乎很小；但从组织水平来说，失重对骨的力负荷影响则很大。骨组织的力负荷主要源于肌肉的主动收缩［13］。肌肉通过费力杠杠，用多倍的力抵抗重力和外力。在失重环境下，重力负荷几乎为零，骨组织的力负荷水平减少许多，从而导致骨量的减少。这似乎可以说：骨从组织水平感受重力的变化。骨组织的重力负荷感受机制还有许多不明之处，但从目前的研究结果来看，骨骼可能是在组织水平上靠感受接触力的变化而感受重力的变化，而不是在细胞水平上直接感受重力的变化。

6　小结

骨组织受力负荷后，应变驱使骨组织间液流动，使骨细胞膜上整合素发生变形，引起细胞骨架的重排，导致一系列的生化变化。骨细胞通过电信号将力负荷刺激信号传给整个骨表面细胞如成骨细胞，调节骨形成。骨组织靠感受接触力的变化而感受重力的变化。骨组织的力负荷感受机制还有许多不明白之处，有待于进一步的研究和完善。

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细胞骨架篇7

关节软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，但可引起免***排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。1977年，Green等以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是作者第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成支架材料无可比拟的优势。本文就天然生物支架材料在软骨修复中的现状和研究进展做如下综述。

1天然脱细胞生物支架材料

天然脱细胞生物支架材料主要利用同种或异种器官／组织，经脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。细胞外基质(ECM)是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白，层连素等。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。目前已经有研究应用同种异体脱细胞材料修复膀胱、尿道、动脉和皮肤缺损［1～3］，以及构建心脏瓣膜［4］，结果比较满意。另外关于脱细胞软骨基质和小肠粘膜下基质(SIS)这2种天然的细胞外基质材料应用也有相关的研究报道［5～7］。

脱细胞基质材料具有多种天然细胞外成分，有利于细胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长而重建软骨，在未来组织修复中它们将拥有广泛的应用前景；但其脱细胞后的孔穴大小及孔穴间的连接缝隙的大小制约着种植细胞向深层发展。

2胶原支架材料

胶原是人体内含量最丰富的蛋白，占人体蛋白总量的30％以上，其中以细胞外基质中胶原蛋白含量最高。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。胶原纤维与细胞外基质中其它成分形成结构与功能的复合体。胶原作为天然的生物材料，其本身无毒性，可被细胞酶类识别、标记、降解，有利于软骨细胞黏附、增殖和分化，还可刺激移植组织产生新的胶原，并且降解产物可被机体吸收。

Wakitani等用Ⅰ型胶原凝胶与软骨细胞或间充质干细胞混合后修复兔膝关节软骨的全厚度缺损，取得较为满意的结果［8,9］。Wambach等从狗甲状软骨上获得的软骨细胞种植到牛Ⅰ型胶原纤维上体外培养，结果发现甲状软骨细胞在Ⅰ型胶原基质中，通过产生Ⅱ型胶原，表达自身表型［10］。Stone等设计了一种用作半月板再生的胶原支架，经FDA批准后在10位病人身上作了初步的临床实验［11，12］。实验结果表明，胶原支架是可移植的，而且在3a的植入期内是安全的，支架支持半月板缺损的组织再生，在连续的血清学测试中未发现不良的免***反应。术后6个月通过关节镜检查发现新生成的软骨组织替代了已被吸收的原植入物。Lee用Ⅱ型胶原作支架培养软骨细胞，结果表明细胞生长和功能表达良好［13］。这些结果表明利用胶原材料作为基质支架开发组织工程化软骨是可行的。

Ⅰ、Ⅱ型胶原由于含有特别的识别信号，有利于软骨细胞粘附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂。缺点是缺乏一定的机械强度，难于塑形，支架材料在体内降解过快，新生软骨组织生化组成也难于评价。另外，由天然生物材料制备的胶原，每批产品之间，还存在着生化性质的差异。

3纤维蛋白支架材料

纤维蛋白凝胶在软骨组织工程中的应用仅排在聚***酸(polylacticacid，PLA)、聚羟基乙酸(PolyGlycolicAcid，PGA)和胶原材料之后。纤维蛋白与胶原一样，本身就来自天然的细胞外基质，因此，也具有很好的生物相容性。纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体在凝血酶作用下聚合成的具有可塑形、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构凝胶，它可通过减慢凝血酶的聚集，因而减慢它从液态转变为凝胶的过程，为凝胶的塑形提供充分的时间。纤维蛋白凝胶聚合时能释放血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β(TGFβ)，有趋化性和致有丝***作用，能进一步促进细胞增殖、黏附和基质分泌。用这种凝胶包埋软骨细胞，为细胞的生存提供了三维空间支持。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，为组织工程化软骨提供了一种可选择的聚合物支架。来源于自身血液制备的纤维蛋白凝胶，避免了免***原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点［14］。Hendrickson等将软骨细胞-纤维蛋白原-软骨-凝血酶混合物注入马软骨缺损区，1个月后形成类透明软骨，内含大量的糖胺多糖和Ⅱ型胶原［15］。Silverman等将纤维蛋白与凝血酶混合产生纤维蛋白凝胶，再与猪软骨细胞混合，注射到裸鼠皮下，在6、12周收集新形成的软骨，通过组织学检查及糖胺多糖、DNA和胶原Ⅱ含量分析，细胞浓度为40×104／ml时在6、12周形成固体软骨，较对照组(仅注射软骨细胞或纤维蛋白胶组)有显著差异，因此认为，纤维蛋白胶对于可注射组织工程软骨是一个合适的聚合物［16］。Meinhart的研究工作也支待上述观点［17］。VanSusante等在羊的股骨髁制造全层软骨缺损，然后将兔软骨细胞和纤维蛋白胶原混悬液植于缺损处，研究显示纤维蛋白凝胶作为三维支架材料不能提供足够的生物机械支特［18］。Sims等利用血纤维蛋白单体聚合成凝胶用作基质支架，将浓度为12～15×106c

ell／ml的软骨细胞―支架复合物植入裸鼠体内，术后12周发现有新的软骨生成。作者还将人的肋骨软骨细胞接种在纤维蛋白凝胶支架上，然后植入裸鼠皮下，也取得了很好的实验结果［19］。

纤维蛋白胶可促进细胞的粘附、增殖和基质分泌，但作为三维支架材料它不能提供足够的机械强度，这也是天然生物材料的共同缺点，再者它来自血液，大量获取困难，但在非承重区的小范围软骨修复中仍不失为一种较好的支架材料。

4糖胺多糖

糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)是软骨细胞增殖、分化的标志性产物。在体内GAG与蛋白质结合成为蛋白多糖(proteoglycan，PG)，构成细胞外的四大成分之一，可促进细胞的粘附、增殖、分化。人体内存在7种糖胺多糖：透明质酸(hyaluronicacid，HA)，4硫酸软骨素(chondroitin4sulfate，CH4S)，6硫酸软骨素(chondroitin6sulfate，CH6S)，硫酸皮肤素(demaransulfate，DS)，硫酸角质素(karatansulfate，KS)，肝素(heparin，HP)和硫酸肝素(heparansulfate，HS)。

Aigner等研究半合成可吸收物质透明质酸苯甲基硫(Hyaff11)在软骨重建组织工程中人鼻中隔软骨细胞培养的支架的可能性，研究证实Hyaff11无纺网支架在软骨移植组织工程中有很好的发展前景［20］。Grigolo等用Hyaff11无纺网与软骨细胞混合培养修复软骨缺损，在第24周时，已有透明软骨生成［21］。另外研究表明透明质酸及其衍生物支架有利于软骨细胞的粘附、迁移、增殖与分化，并且促进其中生长的软骨细胞合成和分泌细胞外基质［22,23］。这种糖胺多糖支架在自体软骨细胞移植中具有一定潜力，在软骨组织工程中有较好的应用前景。

5几丁质

几丁质是一种天然高分子有机多糖，亦称甲壳质、甲壳素、壳聚糖。其化学名称为β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。这类天然多聚糖有明显碱性，良好的生物相容性和生物可降解性。几丁质所有降解产物对人体均无毒性、无刺激、无免***原性、无致突变效应［24］。该材料具有广谱的抑制细菌、霉菌的作用，能促进上皮细胞生长和创面愈合，且来源广泛、价格便宜。Lahiji等在包被和未包被几丁质的塑料盖玻片上种植人软骨细胞和成骨细胞，培养7d用荧光分子探针评价细胞活性，RT-PCR和免***组织化学分析软骨、成骨细胞的表型表达。几丁质包被的细胞在玻片上成骨和软骨细胞表现为圆形和折光性。相反在塑料玻片上90％的细胞变长或呈纺锤形。RT-PCR和免***染色证实在几丁质上成骨细胞表达I型胶原、软骨细胞表达Ⅱ型胶原［25］。在体外研究证实，具有生物相容性的几丁质作为基质材料可促进成骨和软骨细胞生长并保持其功能，几丁质作为组织工程支架材料，具有修复骨和软骨缺损的潜能。

6藻酸盐

藻酸是从海藻中分离出来的一类多糖聚合物。藻酸钙水凝胶可保持较好的形状，并且藻酸钙无毒性，在组织培养中用于细胞培养载体。Paige等采用藻酸钙水凝胶复合牛肩关节软骨细胞做成圆盘状移植物，移植于裸鼠背部皮下，8、12周后形成新鲜软骨［26］。Fragonas等研究了藻酸盐凝胶混合同种异体软骨细胞，体内修复全层损伤的兔关节软骨，4～6个月后，软骨细胞移植物完全修复缺损，并恢复到正常组织结构［27］。藻酸盐水凝胶与其他聚合物相比，价格低、来源丰富、易塑形、具有更好的亲水性，易于细胞吸附，营养物质易于渗透等特点；它本身不是软骨细胞外基质的天然成分，与PLA、PGA等特定形状聚合物材料相比，藻酸钙水凝胶具有亲水性好、营养物质易于渗透、可预先制成各种形状、能为细胞提供良好的三维生长环境并能保持良好形态等优点。藻酸钙水凝胶在生物体内以酶解方式生成甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸单体，对机体无毒性、无免***原性［28］。但藻酸钙也存在组成成分不稳定，不同成品纯度不一，藻酸钙的纯度不够会导致一定程度的免***原性和较差的可吸收性。

7蚕丝蛋白

蚕丝蛋白直接来源于蚕的腺体蛋白，经分离和鉴定，它是一种多肽，Inoue等研究发现，家蚕分泌的丝蛋白包括一个重链，一个轻链和一个精蛋白P25，重链和轻链由二硫键连接，P25以二硫化合物通过非共价键形式结合。蚕丝蛋白定量酶联免***吸附试验显示，重链、轻链、P25的克分子比为6：6：1［29］。Inouye等检测了动物贴壁细胞在蚕丝蛋白、胶原、聚苯乙烯3种材料包被的培养皿中生长情况，发现蚕丝蛋白和胶原蛋白包被的培养皿，细胞生长情况基本一致，均较在聚苯乙烯包被的培养皿中生长的细胞高出30％～50%［30］。Santin等评价蚕丝纤维膜的炎症反应，并与2种物理-化学性质完全不同的物质聚苯乙烯、2-羟乙基一甲基丙烯酸酚作对比，蚕丝膜引起的炎性反应要少于高分子材料［31］。天然材料本身包含很多生物信息，能够使细胞更容易附着，并促进细胞的分化、增殖，保持细胞的表型，但天然材料在生产、加工过程中，质量难以控制，性能发生变化。蚕丝已是天然成品可避免其它天然生物材料需进一步加工形成的缺点。蚕丝具有良好的表面活性和很好的组织相容性。所以蚕丝是软骨细胞立体培养的良好天然支架，其来源丰富，价格便宜处理简单，在软骨组织工程领域中将有广泛的应用前景。

8复合天然聚合物支架材料

体内细胞生长的基质非常复杂，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共混调整不同材料之间的比例，使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性和生物学性质等。天然可降解生物材料既可以与天然的生物材料共混，也可以与人工合成的生物材料共混。Yamane等用几丁质和硫酸软骨素混合制得水凝胶，在其中接种关节软骨细胞，发现细胞能很好地贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，如细胞呈圆形，存在有限的有丝***，能生成Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等。这些结果证实硫酸软骨素-几丁质可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架［32］。透明质酸

与藻酸盐、胶原蛋白或者几丁质混合包埋，将会对软骨细胞的吸附、增殖、分化产生更好的促进作用，最终导致特异性软骨基质形成［33］。天然高分子生物材料还可作为高分子聚合物的包埋剂以增强高分子材料的亲水性及对细胞的粘附、增殖、分化作用［34］。

9天然生物支架材料存在的问题和展望

理想的软骨组织工程支架材料应具有以下特性：（1）具有良好的生物相容性。在体外培养时无细胞毒性，植入体内，无论其本身或其降解产物都应对机体无毒性，都不会导致机体炎症反应和引起宿主的移植排斥反应；（2）具有三维立体结构。必须是高度多孔的类似泡沫状，孔隙率应达到90％以上，并具有很大的内表面积，这样既有利于细胞的植入、粘附，又有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出；（3）具有良好的表面活性。应能够促进软骨组织粘附和增殖，并且能很好维持和促进软骨细胞的表型表达；（4）具有生物可降解性和降解率。支架在组织形成过程中应逐渐被降解，并且不影响新生成组织的结构和功能。材料支架的降解速率必须与种植入的细胞组织形成的速率相匹配，当材料支架完成为组织再生提供模板的功能后，可被完全地降解吸收掉；（5）具有可塑性。可被加工成所需要的形状并具有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，并使新形成的组织具有符合设计的外形。

天然生物支架材料来源于生物体本身，具有组织相容性较好，毒性较小，易降解，且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。但天然生物材料也存在一些需要解决的问题：(1)天然可降解的生物材料每批产品的质量都不一样，故其产品质量比较难控制。天然高分子材料在力学性能及降解速度、通透性等方面存在矛盾，即高分子量通常有高强度，但是它的降解速度和通透性就难以满足组织工程中细胞培养支架的要求。因此需要统一材料的质量标准，严格控制其质量，加强材料的性质和结构等基础理论的研究；(2)共混生物材料的研究开发，可以取长补短，来满足组织工程中不同组织的要求，生产出具有合适降解速度、良好通透性、弱免***原性的细胞培养支架材料，所以应加强对共混膜的性质及制备方法的研究；(3)对现有天然生物材料，包括其衍生物也有待于进一步的研究开发，如对几丁质和透明质酸进行化学修饰，产生多种衍生物，使其更适合作为细胞培养的支架材料；(4)天然可降解生物材料与细胞之间的粘附问题也有待于进一步的研究，选择有利于细胞粘附的材料，同时可以对作为细胞培养支架材料进行表面修饰。

总之，当前软骨组织工程支架材料研究重点是改进现有材料和制备工艺，并探索新材料和新的制备方法。在改进材料的基础上，将生长因子与支架复合或配以更合理的工程化细胞培养体系以提高软骨质量，并由动物实验逐步向临床应用过渡将是今后研究的方向，并将推动软组织工程研究向成熟阶段迈进。

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细胞骨架篇8

【关键词】 骨组织工程； 支架材料； 成骨因子

doi：10.14033/ki.cfmr.2017.1.084 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2017）01-0150-02

【Abstract】 The repair of large area bone defect in the maxillofacial region has been a major problem in oral and maxillofacial surgery.At present，the methods of repairing in clinic includs prosthesis prosthesis，vascularized bone flap transplantation，allograft bone transplantation，and so on.In recent years，with the deepening of the research of bone tissue engineering，it brings a new way of thinking for repairing jaw defects.

【Key words】 Bone tissue engineering； Scaffold material； Osteogenic factor

First-author’s address：Binzhou Medical University，Binzhou 264003，China

骨组织工程是利用医学原理与工程技术结合[1]，将体外培养及扩增后得到的种子细胞，接种于具备良好生物相容性且能够吸收降解的支架材料上，辅以诱导因子诱导细胞的增殖以及新血管的长入，逐渐达到修复骨缺损的目的的一种修复方式[2]。目前实验室已在种子细胞选择、支架材料选取、细胞与支架材料结合及血管化等方面取得了较大进步，但是存在的问题也不能忽视。

1 载体材料

优良的支架材料可促进种子细胞的黏附与增殖，具有与组织细胞生长相一致的生物降解性。目前，人工合成材料、天然衍生材料和复合支架材料是R床实验阶段常用的骨组织工程支架材料。

1.1 人工合成材料支架

人工合成无机材料中广泛应用于骨替代材料的是羟基磷灰石为代表的磷酸钙陶瓷，机体对这类材料的免***抑制较轻，但此类材料存在脆性强、可塑性差、在机体难以降解等缺点。对于人工合成材料的改进，Young等通过快速反应烧结结合压紧呈盘技术构建了钙铝黄长石多空陶瓷材料支架，通过与传统双相磷酸钙陶瓷支架相比，成骨细胞的黏附及增殖率显著提高，同时检测到成骨基因（RunX2、骨钙素、骨桥蛋白、骨涎蛋白）等的较高表达水平[3]。与传统无机材料降解性较差不同，该材料能够促进形成抗酒石酸酸性磷酸酶从而激活骨髓细胞产生多核破骨细胞，增强了支架材料的可降解性。

1.2 天然衍生支架材料

天然衍生支架材料等高分子材料具备良好的可塑形，可根据需要制成颌骨缺损的复杂形态。Ren等[4]应用聚***酸-羟基乙酸共聚物制造出约100～250 ?m孔径的支架材料与骨髓间充质干细胞复合培养修复兔下颌骨缺损，发现术后3个月下颌骨缺损完全修复。虽然高分子材料可以用于骨组织工程材料，但其较差的机械强度，不易有效的与细胞因子信号识别等缺点也同样不能忽视。

1.3 复合支架材料

目前对单一类型支架材料的研究从未停止，但单一支架材料的固有缺陷常常难以克服[5]。随着基础研究和修复重建材料的进步，利用先进手段将有机/无机材料整合成为复合支架材料在实际应用中获得了很好的修复效果。

现常用的复合材料主要有生物陶瓷材料与天然高分子材料的复合、纳米羟基磷灰石与胶原复合等[6]。康献刚等[7]通过将同种异体骨粉与高分子材料壳聚糖结合制成复合多空支架，结果发现与对照组单纯壳聚糖制备的支架相比，冷冻干燥制备的复合多孔支架在新生骨量以及成骨速度方面具有显著优势。此实验构建的复合支架材料克服了单一壳聚糖支架不具备成骨作用的缺陷，具有良好孔隙率，有利于细胞的黏附和新血管的形成，为成功修复各种复杂形态颌骨缺损提供了良好的应用前景。

近年来在医学领域开展的3D打印技术[8]，经过20多年的发展，该技术现已应用于口腔种植、骨科、口腔颌面外科手术中。在3D打印技术的辅助下，制备的生物支架材料可实现孔径、孔隙率、贯通性的调控，同时具备精度高及可重复性等优势。张海峰等[9]运用3D打印技术构建聚***酸（PLA）-羟基磷灰石（HA）复合支架并在新西兰大白兔单侧胫骨内侧建立体内生物反应器模型，结果生成了较多的新生骨组织并且骨小梁的排列致密。可见结合3D打印技术的复合材料能在体内生物反应器内构建性能较好的组织工程骨。

2 种子细胞

种子细胞是骨组织工程中生物活性的来源，理想的种子细胞应该具有成骨潜能，优良的增殖和分化能力，细胞易于获取无致瘤性倾向等特性。

2.1 骨髓来源种子细胞

骨髓中含有间充质干细胞，在一定条件的诱导下能增殖分化成骨组织，属于多潜能干细胞。Shen等[10]构建犬自体髂骨骨块复合骨髓间充质干细胞膜片作为实验组，单纯犬自体髂骨骨块作为对照组，分别植入到上颌骨两侧骨缺损缝隙中，观察比较两组术后的骨吸收率，骨小梁密度等指标。结果显示，实验组犬上颌缺损裂隙中新形成骨的骨体积分数以及骨密度高于对照组。此实验也证明骨髓间充质干细胞膜片有促进新骨形成的潜力。

2.2 其他来源种子细胞

由于脂肪、肌肉、外周血等组织同样可分离出间充质干细胞且增殖能力优于骨髓间充质干细胞，同时具有来源广泛获取时创伤小等优势被越来越多的运用到骨组织工程[11]。Feng等[12]通过构建β-磷酸三钙支架结合脂肪干细胞，应用富含血小板血浆（PRP）提供细胞因子构建组织工程骨作为实验组修复兔下颌骨缺损，不加入脂肪干细胞，只将β-磷酸三钙支架及富含血小板血浆（PRP）的支架材料作为对照组。术后半年检测骨体积分怠⒐敲芏鹊戎副辏发现实验组均高于对照组。此实验提示新型脂肪干细胞/β-磷酸三钙支架（β-TCP）/富含血小板血浆（PRP）复合物可应用于颌骨修复及组织工程当中。

3 生长因子

种子细胞的生长、分化受很多信号共同参与调控。其中，生长因子、细胞因子、生长抑制因子等共同参与了这一系统调控。目前研究者多是运用基因工程技术构建病毒或非病毒载体，将具有成骨能力的基因转染至种子细胞内，通过细胞增殖实现成骨能力基因的大量表达，促进局部成骨。

人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）是最早应用于临床的BMP，BMP-7主要通过诱导间充质干细胞内的转录因子Run字2和Osterix的表达，实现向成骨细胞的分化[13]。汪卫国等[14]利用AdEasy腺病毒，构建了携带人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）基因的重组腺病毒载体，经体外转染实验，观察复合犬骨髓基质干细胞（DMSCs）的珊瑚羟基磷灰石（coral hydroxyapatite，CHA）支架在修复下颌骨缺损的效果，结果显示材料与周围骨质紧密结合，最终形成的组织呈现交织状骨组织学特征。

人工合成神经多肽P物质（SP）是一种小分子多肽，是动员干细胞和促进创伤修复的重要分子，体外人工合成方便易得，并且没有不良药理作用或遗传毒性，王天珏等[15]构建自固化磷酸钙（CPC）-明胶-SP复合组织工程材料支架植入兔下颌骨状缺损模型当中观察支架形态与骨愈合情况，通过与对照组固化磷酸钙（CPC）-明胶复合支架植入后颌骨缺损修复情况相比，加载活性物质SP后，能够在材料内、外部释放多肽生物活性，从而发挥自主诱导机体干细胞动员的能力，Micro CT显示实验组周围骨质愈合良好，且材料内成骨效率优于对照组。此实验也证实人工合成神经多肽P物质能够促进种子细胞在体内的成骨化。

4 存在问题与展望

口腔颌面部有着特殊的解剖生理外形，身处多种微生物环境之中，这些都增加了骨组织工程修复颌骨缺损的难度，在继续发展和完善骨组织工程三大技术的同时，对于阻碍和影响骨组织工程发展的相关技术的解决以及涉及到骨组织工程发展的相关***策法规、医疗产品质量标准规范的制定等，仍是骨组织工程工作者努力的方向。

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细胞骨架篇9

【关键词】 骨膜细胞 成骨能力 复合移植 骨缺损 骨修复

由于创伤、炎症和肿瘤等各种原因造成的骨组织缺损后的修复重建，是当今医学研究的难点之一。长期以来，自体骨移植是修复骨缺损的常用方法，然而自体骨移植因存在着骨数量有限和供区受损等问题，在临床上的应用受到很大的限制[1]。近年来，人们把目光投向了骨组织工程这个新兴领域，利用生物学和工程学的原理和方法，将成骨细胞和载体材料复合移植入体内，达到修复骨缺损的目的。骨组织工程的首要环节是充足的成骨细胞来源。骨膜源性细胞（periosteum-derived cells,PDC）具有很强的增殖能力和分化成骨潜能[2]，而且，取材方便，对患者造成的创伤小，成为骨组织工程理想种子细胞来源之一。目前，将骨膜细胞体外培养扩增，结合适当的生物材料，移植入体内促进骨组织修复，已成为骨组织工程研究领域的一大热点。本文就目前国内外对骨膜细胞成骨能力、骨膜细胞和载体的复合研究及其在口腔颌面骨修复中的应用研究作一综述。

1 骨膜细胞成骨依据

骨膜是一种非均质膜结构，包括外部的纤维层和内部的生发层。纤维层含有成纤维细胞，生发层含有骨祖细胞、成骨细胞和破骨细胞。体外实验发现，骨膜生发层细胞具有较强的成骨分化能力，纤维层细胞成骨能力较差，但强于腱成纤维细胞[3]。体内实验表明，骨和软骨的形成源于生发层细胞的增殖和分化[4]，但近年有学者将兔的胫骨骨膜移入到肌肉中，发现骨膜纤维层形成软骨细胞和骨组织，生发层却出现坏死、消失，这与上述报道不一致[5]。因此，关于骨膜源性成骨细胞的来源还需要进一步的了解。

2 骨膜细胞的体外培养和成骨鉴定

成骨细胞的分离和培养是骨组织工程细胞移植的基础。已有多项实验证实，体外培养的骨膜细胞能够分化为成骨细胞或软骨细胞,进而形成骨组织,这为骨膜细胞成为骨组织工程种子细胞提供了理论和实验依据。骨膜成骨细胞的鉴定主要有以下几种指标：细胞形态、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin, OCN）、矿化结节和Ⅰ型胶原[6]。

Declercq等培养大鼠胫骨骨膜细胞，观察到最初细胞为成纤维状形态，ALP表达较低，随着培养时间的推移，细胞慢慢呈现为鹅卵圆形,ALP活性增加，矿化结节形成，并表达Ⅰ型胶原和OCN [6] 。有实验发现，骨膜细胞的形态与其成骨能力有一定相关性：小圆形细胞比成纤维状细胞具有更高的成骨分化潜能[3，7]。而且，骨膜细胞具有间充质多分化潜能，自我更新能力强，不受供体年龄影响，体外传代30次仍保持明显增殖能力，经成骨诱导分化后，表达明显的成骨特征，ALP水平增高,大量矿化结节形成[8]。以上研究表明，体外培养的骨膜细胞具有较高的增殖和成骨分化能力，为体外扩增骨膜细胞并将其植入体内促进骨形成奠定了实验基础。

3 单纯骨膜细胞体内移植

培养的骨膜细胞体外表达成骨特征，若将其移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究，并取得成功。Takushima等将兔骨膜细胞悬液注入到人工造成的胫骨骨裂缝处，术后可见裂隙处细胞大量增殖，并有明显的新骨形成[9]。刘建平等临床上将培养的骨膜细胞自体注射到骨不连患者的骨缺损处，术后x线证实在骨折处有骨痂形成，骨折愈合加快，达到了促进骨愈合的目的[10]。以上实验均说明自体骨膜细胞移植具有促进骨缺损修复的作用，但是，应用自体骨膜细胞直接注射到骨折部位或骨缺损部位，因缺少支持物，而无法控制移植细胞的位置和骨形成的形态，可能导致骨异位形成。因此，目前很多学者开展了骨膜细胞与载体复合的研究。

4 骨膜细胞与复合载体研究

细胞外基质-载体材料是骨组织工程研究的重点内容，载体能为细胞提供生存空间，使细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，并使细胞按预制形态三维生长。研究表明，细胞体内形成的新骨特征与其使用的载体种类有关[11]。同时，由于骨膜细胞分化程度较低，能在体外大量扩增，从而成为研究细胞和生物材料相互作用的理想成骨细胞来源[7]。目前已用作骨膜细胞载体的材料种类繁多，包括羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）、胶原(Collagen)、聚乙醇酸（polyglycolide,PGA）、聚***酸（polylactic acid，PLA)及它们的复合物(polyglycolide-polylactid acid,PLGA)[12-18]等。

4．1 体外研究

Turhani等将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养， 观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用[12]。为了制备优良的支架材料，人们将几种单一材料组合，形成在性能上互补的复合材料。例如，PLGA有利于骨膜细胞的粘附和迁移，而纤维素可以使骨膜细胞在三维支架上分布均匀，两者联合应用，有利于骨膜细胞产生的基质稳固于支架中而不易丢失[13]。为了模拟天然骨结构，张超等用钙磷溶液处理胶原支架，使HA沉积于其表面，提高支架的力学整合性，并与PLA复合形成多孔支架HA/Collagen/PLA。该支架适合骨膜细胞的粘附和生长，能够保持细胞的表型达两周，支架表面和孔隙中的骨膜细胞交织成网，具有良好的增殖活性，并产生了大量的细胞外基质[14]。

4．2 体内研究

1993年，Vacanti首次应用骨膜成骨细胞和可降解生物材料PGA在裸鼠体内形成骨组织，证明以骨膜细胞为基础的组织工程化技术构建骨组织的可行性[15]。以后，多位学者采用骨膜细胞和不同的生物材料复合在体内形成骨组织。Kim等分离新生牛肱骨骨膜，将骨膜细胞接种于PGA上培养2周后植入裸鼠的股骨血管周围，6周后发现植入体有软骨细胞和外周骨岛形成，并有血管长入，9周时可见到含骨小梁样结构的有序骨形成，该研究说明了再造血管化工程骨的可能性[16]。Sakata等将人下颌骨骨膜细胞和胶原海绵复合移植入免***抑制的大鼠颅骨缺损处，术后观察到骨膜细胞增殖分化为成骨细胞，缺损处有新骨形成，该实验实现了人骨膜细胞移植修复异种模型骨缺损[18]。与骨髓细胞相比，骨膜细胞与载体移植入体内后具有更强的成骨能力，能有效地形成骨组织[19]。但也有学者报道骨膜细胞尽管能表达成骨细胞特征，但体内形成的骨组织量及骨特定因子表达量都明显低于骨髓细胞[20]。因此，关于骨膜细胞与骨髓细胞在骨组织工程中作为种子细胞谁更具有优势有待进一步研究。

5 骨膜细胞、载体和生长因子的复合研究

正常组织生长过程中，除了一定的理化环境，还需要骨形成蛋白（bone morphogenic protein ，BMP）、成纤维细胞生长因子(fibrob1ast growth factors，FGFs)、胰岛素样生长因子等多种生长因子的调解。研究表明, BMP自身具有修复骨缺损的能力，并有促进和协同骨膜细胞体内成骨作用[21]。骨膜细胞经FGF预处理后，对BMP的敏感性增高，移植后体内产生的新骨量会明显增加[22] 。国内有学者将兔骨膜细胞经重组人BMP-2诱导分化后，接种于多孔支架HA/Collagen/PLA植入裸鼠皮下，8周后发现有大量骨样基质形成，并有血管长入，而单纯骨膜细胞组和单纯支架组无骨形成，证明人重组BMP-2能增强骨膜细胞的活性和成骨分化的能力[14]。但是，此种方法很难保证BMP的长期表达，人们探索将生物因子导入骨膜细胞，以增强骨膜细胞的成骨能力，实现骨组织再生和移植物的抗炎作用。早在1999年，Breitbart等就报道应用人BMP-7成功转染兔骨膜细胞，并用这些转染细胞和PGA成功修复兔颅骨缺损,其成骨能力明显优于单独使用骨膜细胞或BMP-7组 [23] 。这种转基因技术使骨膜细胞能持续表达某种转化生长因子，有利于细胞达到最适分化，为骨组织工程的发展开辟了新的途径。

6 骨膜细胞在口腔颌面骨缺损修复中的研究及应用前景

目前，已经有不少学者研究骨膜细胞在口腔颌面骨缺损中的应用[24-23]。Groger等将体外扩增的猪骨膜细胞，与纤维蛋白胶一起接种于可吸收聚合物上，并用此复合物修复颌骨缺损，与未处理组相比，骨缺损处密度增加，骨修复明显[24]。Mizuno等从成年杂种犬的下颌体分离骨膜块进行培养，7天观测到有细胞外基质和钙化结节形成，4周后见细胞和分泌的基质形成膜样结构。碱性磷酸酶、骨钙素、胶原Ⅰ和Ⅱ均为阳性。培育的骨膜块移植到第四前磨牙的三度根分叉病损处，3个月后发现根分叉骨缺损处有新骨形成，牙根的外侧面也覆盖着新生的牙槽骨，牙槽骨成板状骨样，内有含骨细胞的腔隙。这说明培养的骨膜块在修复牙周骨缺损方面有着潜在用途，其不仅有成骨作用，且还有屏蔽上皮细胞作用，因此可以作为引导性牙周再生的生物膜[25]。

骨膜细胞体外培养较易，扩增速度快，且不受供体年龄限制，在口腔骨组织工程中的应用前景广泛，今后，改善骨膜细胞的成骨能力、制备更为理想的载体材料、深化基因修饰细胞,增强基因表达的可控性,进一步阐述细胞和载体的相互作用以及探索生长因子对种子细胞的调控机理仍将是研究的热点内容。

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细胞骨架篇10

关键词：骨缺损 组织工程学 种子细胞

【中***分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0012-01

1 种子细胞

组织工程是工程学和生命科学的使用原则，以生物材料为载体，整合分离的细胞，并能在宿主体内降解释放细胞形成新的有功能组织的学科。骨组织工程的研究主要包括：种子细胞的来源和文化；细胞载体材料的研究和开发，各种各样的因素在组织培养调节作用。随着骨组织工程的研究的快速发展，组织工程骨在临床应用领域已经成为最有前途的组织工程之一。本文将种子细胞的特点，支架材料、生长因子、功能、实验研究和应用其在临床的应用评估如下：骨组织工程中具有广阔的应用前景，其中，种子细胞的选择和优化是一个重要的环节，选择合适的种子细胞，是组织工程研究的关键一步，并从实验室到临床应用的重要转变。种子细胞主要来源：骨髓、骨、骨膜、骨外组织。其中骨髓由于取材相当方便，对机体损伤比较小，骨髓中的基质细胞容易体外扩增，自体移植无免***排斥性，并在诱导因子作用下，可以使其向成骨细胞分化，而且具备广阔的应用前景，被看作为首选的种子细胞之一。骨髓基质细胞的成骨效应是由于骨髓基质细胞能转变为成骨细胞或软骨细胞，产生基质，形成新骨，并能使骨缺损修复。并且能自发分泌成一些因素，诱导周围结缔组织中的少数间充质细胞成骨细胞。合适骨髓基质细胞在体外培养条件下可以对成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和其它间充质来源的组织细胞分化。所以，又称为间充质干细胞。研究表明，BKSc中含有大量的诱导性骨祖细胞和定向性骨祖细胞。定向性骨祖细胞又能定向转变为成骨祖细胞而成骨，诱导性成骨细胞可以在异位移植或者自体移植时，能自发地分化成为骨组织诱导性骨祖细胞，能在诱导因子的作用下分化成为成骨细胞；BMP存在在骨基质中，是一种有效的诱导物，并在促进骨缺损的修复中，BMP作为诱导因子，靶细胞是一种未分化、有活力的间充质细胞，对已分化的骨细胞是完全没有作用。而且BMP能有效地诱导BM Sc中的诱导性骨祖细胞分化成为成骨细胞，这种诱导机理还不明确。

2 支架材料

在组织工程研究中，寻找能充分发挥潜在的组织再生细胞支架材料是核心内容之一。支架材料不仅影响细胞生物学效率和开发，并决定种子细胞移植后是否与机体完全地适应，结合和修复的效果，是限制组织工程真正应用于临床应用领域的一个重要关键因素。理想的支架材料应该具备以下五个特征：①具有三维多孔的立体结构，而且有利于细胞的植入和贴附，涉及细胞养分的渗入和代谢产物的排出。②良好的组织兼容性，无免***性。③良好的细胞接口，良好的的表面调控性，且有利于细胞的贴附，能为细胞在其表面生长，增殖，分泌基质提供一个良好的环境。④必须具有一定的可塑性和机械强度：材料也可能加工成所需要的形状，具有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持原来的形状，使新形成的组织具有一定的外形，目前常用的支架材料按来源分为：人工合成支架材料和天然支架材料两大类。

3 生长因子

在骨创伤早期，生长因子主要开始形成骨细胞活性，促进骨生成，后期作用并逐渐减弱，并参与骨的生长调节。生长因子具有诱导和刺激细胞增殖，并维持细胞存活等生物效应的蛋白类物质，促进细胞增殖、组织或血管的修复和再生都具有重要的增进作用。骨髓基质中含有很多种生长因子，如转化生长因子类胰岛素生长因子、骨形态发生蛋白（BM P）、碱性和酸性成纤维生长因子、血小板衍生生长因子等等。到目前为止研究最多的是BMP和转化生长因子B。BMP是1965年的时候被发现，并被提出。到目前为止是最有效的促骨生长因子，并能诱导间充质细胞分化成为：成骨细胞和骨细胞，并促进钙化作用，产生钙化的骨基质生长。它有许多种克隆，其中以BMP-2诱导骨化活性最为强大。许多学者利用基因工程将生长因子基因植入骨髓基质细胞，并使细胞增殖，同时表达所需要的定向分化生长因子，通过使用自体分泌的方式来调节，促进细胞增殖和分化。

4 存在的问题与研究的展望

应用组织工程学原理修复骨缺损是一种新的和有前途的道路，其相关的生命科学、工程、细胞生物学、免***学、材料科学等领域，是目前研究的重要热点，其主要表现在：细胞的来源、保存和组织移植的生长环境；聚合物生物材料研究；生长因子和植物细胞和可降解材料整理后修复骨缺损后组织的集成研究。现在需要解决的是：明确分化和增殖的细胞在体外培养的调控机制；加强组织的生物可降解材料集成修复后的研究，明确诱导因子对成骨细胞的促进作用。掌握成骨细胞最佳训练密度和繁殖；建立成骨细胞的成骨细胞库和大规模系统的成骨细胞培养体系；改善细胞物质相互作用，研究和开发优良的基质材料，解决人工聚合材料，是不能满足临床标准问题的。

参考文献

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