学文网摘要 随着分子标记的发展，SSR与ISSR分子技术越来越多地被应用于真核生物遗传多样性分析中。介绍了SSR与ISSR的原理、特点以及它们在家蚕研究中的应用。
关键词 SSR；ISSR；家蚕
家蚕的SSR与ISSR技术，是分子细胞生物学领域的一个独特技术，可直接应用于家蚕的基因定位以及遗传多样性、亲缘关系的研究，随着分子标记的发展，SSR与ISSR今年来在家蚕研究中获得了快速的发展和应用。
1SSR与ISSR分子技术
SSR 与ISSR分子标记是近年来继RFLP、AFLP 之后发展起来的、建立在PCR 基础上的第2代分子遗传标记技术。与RFLP、RAPD、AFLP 分子标记技术相比，SSR与ISSR具有多态性高、遵循孟德尔遗传规律、结果重复性好、操作简便等特点。
1.1SSR分子技术
简单序列重复（SSR，simple sequence repeat）又叫微卫星DNA或STR（short tandemrepeat），是目前应用最广泛的第2代共显性分子遗传标记。SSR的核心结构是由 1～6 个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列。微卫星DNA的两侧是相对保守和专一的单拷贝序列。利用其侧翼序列设计引物可以特异性扩增微卫星位点，使微卫星DNA以PCR的形式从基因组中被选择性地扩增出来，这就是微卫星标记。
微卫星DNA存在于所有已检测过的真核生物的基因组中，并在整个基因组中都有分布，其均一性比其它分子标记都高，不但在常染色质而且在异染色质中也有均匀分布，并且是唯一的一个分布在着丝粒区域附近的多态性标记。由于SSR标记大多位于非编码区，不编码蛋白质和RNA，不受选择压力影响，因此还具有很高的稳定性。SSR 标记遵循孟德尔式遗传规律和共显性遗传模式。SSR标记的表型没有显隐性之分，其等位基因的差异表现在 PCR 产物的长度上，可通过 PAGE 凝胶电泳检测分析带型而轻易辨别杂合型与纯合型的差别，易于开展基因型分析。这一特点使它明显优于呈显隐性的RAPD标记。SSR标记最大的优点是，它是单纯应用PCR技术原理的分子标记，通过对SSR特异性引物进行荧光标记，可以进行多重PCR，并通过DNA测序仪进行高通量的基因型分析
1.2ISSR分子技术
ISSR（Inter simple sequence repeats）又称为加锚微卫星寡核苷酸。Zietkiewicz等[1]对SSR技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，在SSR的5’端或3’端加上2～4个随机选择的核苷酸，这样就可以引起特定位点退火，对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增，而是重复序列间的片段，这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增，这类标记是显性遗传的。所扩增的inter-SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。
ISSR技术操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素显示；扩增基因组DNA，适用于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种，可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体间变异的信息；遗传多态性高，重复性好。采用较长的引物（17～24bp），退火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，与模版结合的强度提高，降低了杂带的干扰，随之提高了实验结果的可重复性；ISSR引物设计上比SSR技术简单得多，不需要知道DNA序列既可以用引物进行扩增，又可以揭示比RFLP、RAPD和SSR更多的多态性，其引物可基于任何在微卫星位点发现的SSR重复单元（2～4个核苷酸等），并且侧翼靶序列简单序列重复的任何一端均能够锚定基因组序列。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点，耗资少，模版DNA用量少 。因此广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析及指纹***谱的建立。
2SSR与ISSR分子技术在家蚕研究中的应用
2.1 分子标记遗传***谱的建立与基因定位
遗传作***研究的目的是寻求足够的多态分子标记，从而将所有基因座位定位到特定染色体的特定区域，最好是在染色体步查距离内。Dietrich[2]构建了1张含有7 377个遗传标记的小鼠连锁***，其中有6580个微卫星标记；Dib等[3]构建了含有5264个微卫星的人类连锁***；在植物的遗传***谱中，SSR标记还没有占主导地位，最初只是将其添加到以 RFLP为主的连锁***上。张月华等[4]利用微卫星标记SSR，在DNA水平上构建了96个中国系统二化性家蚕品种的DNA指纹***谱，57对SSR引物共扩增出507条有效带，表明各品种之间存在丰富的微卫星多态性，发现SSR扩增片段具有品种特异性，能准确地对各品种进行分类和鉴别。Reddy等[5]通过构建基因组文库，经杂交测序获得了28个家蚕SSR标记，并用其中的15个标记对13个家蚕品种进行了遗传分析，并将这些品种聚类为滞育和不滞育两类。Reddy等[6]采用 5’锚定和3’锚定的ISSR标记分析了家蚕品种的指纹，并将 13 个品种按滞育和非滞育分开。Chatterjee等[7]用ISSR方法筛选了与家蚕发育及生产性状相关标记。Li等[8]分别筛选了与nsd-Z相关的RAPD分子标记和SSR分子标记，并尝试将SSR标记应用于抗DNV-Z蚕品种选育，取得了初步结果。
2.2亲缘关系与遗传多样性的研究
物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是其生存和发展的前提。对物种遗传多样性和遗传结构的研究，是探讨其适应性、生存力的基础，也是分析濒危物种致濒机理的基础，从而帮助制定科学有效的保护策略和措施。SSR与ISSR分子标记目前在研究物种的遗传多样性和遗传结构研究方面获得了广泛的应用。Li等[9]用26个SSR标记研究了31个代表性品种的遗传多样性。侯成香等[10]用ISSR技术对蓖麻蚕的遗传多样性进行了分析。房守敏等[11]利用ISSR技术对6个家蚕品种和2个不同地域的野桑蚕群体进行了遗传多样性分。钱荷英等[12]利用微卫星标记（SSR），在DNA分子水平上构建了家蚕84个日本系统二化性品种和9个多化性品种共94个材料的指纹***谱，发现其SSR标记不但具有系统特异性，而且具有品种特异性，能够证明二化性日系品种与多化性品种在进化上属于显著差异的两个类群，较准确地将各品种按亲缘关系远近聚类。沈利等[13]用家蚕品种P50 为材料构建了一个家蚕长插入片断基因组质粒文库，并用筛选出的8个SSR标记对6个家蚕品种进行遗传多样性分析。
人们已经开始同时采用多种分子标记技术构建物种基因组的遗传***谱的研究，避免了单种分子标记技术的局限性，大大提高***谱的适用性，分子基因***是突变基因研究、基因定位分析的新里程碑，它代表在蚕的基础研究和应用之间的一个重要的桥粱和纽带，使基因分析作成的连锁***的应用成为可能。这项研究的完成将使家蚕遗传、育种学研究取得重大突破。
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