学文网《水生态学杂志》2014年第四期
1材料与方法
1．1藻种培养小球藻藻种购于中国科学院水生生物研究所(湖北武汉)，实验前扩大培养1周。取培养后高浓度的藻液于离心机中，以3000r/min离心5min，除去上清液。用浓度为15mg/L的Na2CO3溶液清洗后再次离心，重复3次，用超纯水稀释后用于接种(黄莹莹，2008)。考虑到需要较长的培养周期才能更直观地了解不同梯度小球藻的生长情况，故实验采用BG-11培养基(Bhatnagar，2010)。
1．2实验装置培养小球藻的容器为外径4．0cm、内径3．7cm，长度70cm的玻璃长管，置于实验室内人工培养架上。通过实验室精密空调控制温度，小球藻生长适温为20～30℃(杨桂娟，2009)，因此温度设置为20℃。采用多排密集日光灯管控制光照强度，参照Kohji(2003)的方法，光照强度均通过调节日光灯管控制为1000lx。实验装置如***1所示。
1．3实验设计在玻璃长管中加入等量处理后的藻液，分别使用BG－11培养液稀释至200mL。设置曝气比率为0%、2%、10%、20%、30%、50%、70%共计7个梯度组(Xin，2010)，0%为不曝气状态，2%为藻液中小球藻不沉降的临界曝气比率。每个梯度组均设置1个相同培养条件的平行样。实验结束后，将所有藻液置于离心管，3000r/min离心30min，倒去上清液，敞口置于80℃烘箱，约烘30h至恒重(黄美玲，2010)。
1．4指标测定实验时间为2013年8月30日至9月8日。8月30日为实验第1天，9月8日为实验第10天，隔天定时(9∶00)取样。测定各组梯度的温度，采用防水中心数字温度计记录;光照强度采用JC07-testo540光照度测量仪正对玻璃管底部测定。光密度法是测定藻类生物量的方法之一，其操作简单、需要样品量少、能够准确而又快速地测出微藻生物量;吕旭阳(1986)在波长680nm时测得藻液吸光度值与小球藻细胞浓度有极显著的线性关系，能够很好地反应小球藻的生长情况;因此使用分光光度计测定波长680nm光密度值(OD680)(Griffiths，2011)。采用国际上广泛应用的Arono法测定叶绿素(Chl．a)浓度(苏正淑，1989);考虑紫外可见分光光度计的测量范围和实验误差等因素，取样10mL，稀释10倍后测定OD680、Chl．a、溶解性总氮(DTN)、溶解性总磷(DTP)等指标，DTN与DTP根据《水和废水监测分析方法》在实验结束时测定(国家环境保护总局，2002)，以了解营养盐的消耗情况;另外，考虑0%梯度不曝气，小球藻由于自身重力作用沉降，在取样前对该梯度通少量空气将溶液混匀。由于取样和蒸发将导致各梯度水样损失，因此采样结束后用去离子超纯水补充至200mL。称取9份0．1g处理后的藻粉，分别溶于15、20、25、30、40、50、100、250、500mL蒸馏水中，并测定其光密度值。比增长率(μ)计算公式为:μ=(lnxt－lnx0)/t式中:μ为比增长率;xt为第t天光密度值;x0为初始光密度值;t为初始至第t天的时间。根据所测得的光密度值，计算每个梯度小球藻每天的比增长率。采用真空高压力鼓风机，通过调节进气阀门使玻璃管中保持固定体积的曝气量，而曝气体积所占藻液体积的百分比即为曝气比率(AR):AR=V/V式中:V为藻液初始体积;V为曝气后藻液所增加体积。
2结果与分析
2．1生物量
2．1．1光密度值由***2可知，不同曝气比率条件下光密度值差异较大。各梯度的初始OD680值均为1．27。实验期间，除0%对照外，各梯度OD680变化趋势相近，随着培养时间的增加，OD680均呈增长趋势;其中，在第2－8天，20%曝气比率小球藻生长优势扩大，OD680明显高于其他梯度，依次为20%＞30%＞10%＞50%＞70%＞2%＞0%。0%梯度由于水体未搅动，藻类沉降附着在玻璃管壁上，水体中缺少CO2等气体，同时光合作用产生的O2不易排出，过高的溶氧不利于藻类生长(朱亮，2007)，小球藻死亡速率大于生长速率，生物量降低，至实验结束时OD680降低至0．84;而2%梯度的设置是为了与不曝气形成对比(2%表示刚好保证藻液中小球藻不沉降于管底，而其所曝入的空气量又微小到可以忽略不计)，从***2可以看到，前者小球藻的生长情远好于后者，说明水体扰动对小球藻生长的影响远大于补入空气。
2．1．2叶绿素a浓度及其与光密度的关系从***3可以看到，各梯度叶绿素a浓度变化在4．52～89．91mg/L。实验初期的叶绿素a浓度均较低;从第3天起，叶绿素a浓度逐渐增大(0%梯度除外)，20%梯度的叶绿素a浓度高于其他梯度，30%梯度与其最为接近;至第9天，20%梯度下叶绿素a浓度最高，达到89．91mg/L;第10天各梯度(除10%与50%)叶绿素a浓度均略微下降，10%与50%梯度下叶绿素a浓度增大趋势减弱，说明至第9天，小球藻的生长已趋于稳定;其中，2%梯度下叶绿素a浓度增长幅度小于其他梯度，0%梯度下小球藻停止生长，叶绿素a浓度几乎没有变化。结合***2可知，叶绿素a浓度与OD680变化趋势一致，通过回归分析可知二者的线性关系显著(***4);叶绿素a浓度随着OD680的增加而明显升高。
2．1．3细胞干重与光密度值的关系如***5所示，小球藻干重(x)与OD680值(y)也存在显著的线性关系:y=2．6337x+0．2815(R2=0．9922)
2．2比增长率从***6可以看出，无曝气(0%)条件下的小藻比增长率始终最低，几乎均为负值，表明小球藻在没有曝气的情况下，会生长缓慢甚至逐渐死亡;而其对照梯度2%则呈现出极低且稳定的比增长率，这是由于该梯度中所溶入空气只能产生轻微的扰动，而没有补充足够的空气促进O2在藻液中的传递与扩散。实验前6d为小球藻对数生长期，在此阶段，20%曝气比率的小球藻比增长率一直保持最高，而10%、30%、50%和70%曝气比率的小球藻比增长率变化趋势差别不大;从第7天开始，20%曝气比率的小球藻较其他梯度率先进入稳定期，以至于第7～9天其比增长率不再处于最高水平，可见各梯度小球藻的比增长率呈逐日下降;这是因为随着其浓度增高，藻液浊度逐渐变大，光的透过率随之变低，导致小球藻光合作用减弱;除了0%、2%和70%梯度的小球藻出现了负增长，其他梯度最小比增长率均大于0;由此判断在足够优化的培养条件下，小球藻的生长会一直保持在稳定期。
2．3营养盐***7是第10天各梯度溶解性总磷(DTP)和溶解性总氮(DTN)的含量。实验所用BG-11培养基中，P含量为7．13mg/L，N含量为247mg/L;DTP最低值为0．41mg/L，DTN最低值为138．58mg/L，均没有消耗完全。结合本文2．1．2中叶绿素a含量数据可知，至第8天各梯度小球藻的生长已趋于稳定，可以推断实验最后小球藻生长缓慢甚至死亡的限制因素不是营养盐的缺失，而是因为受不同曝气的影响其本身已达到生长稳定期。
2．4pH值藻液中的pH值会影响小球藻的光合作用及其对磷和无机碳的有效利用，同时还会影响其代谢产物的再利用性和毒性，pH值是影响藻类生长代谢的重要因子之一(王翠，2010)。***8为不同曝气比率pH值的变化。各梯度pH在8．51～11．55。10%、20%、30%、50%、70%梯度下pH变化较为一致，而0%、2%梯度下pH高于各梯度。实验中曝气所通入的CO2不仅参与藻细胞的生理代谢活动，而且改变培养液的pH，影响细胞内酶的活性(Tsuzuki，1990)。0%、2%梯度曝气较弱，CO2含量较少，实验期间，培养液pH较高，超过了适合藻类生长的范围，因此0%、2%梯度下小球藻生长情况较差。
3讨论
3．1小球藻最适曝气比率的确定适量的曝气不仅加速了水体复氧过程，使溶解氧水平得到提高，而且CO2的补充改变了水体中O2和CO2的含量组成(孙从***，2001);同时曝气也对水体进行了扰动，改善了藻液的混合状况，增加藻胞与周围介质交换营养和代谢产物的速率，使藻不断得到新的营养物质供应，从而增加生产力和光合作用效率(Grobbelaar，1994);并能降低藻体间的相互遮荫现象(李志勇，1998)。在一定的范围内，增大曝气比率能加速藻细胞的生长，但过大的曝气比率会使得藻液过度掺混，液体之间产生较大的流体剪切力，对藻细胞造成损伤(Merchuk，1991)，同时使藻液过于分散，过度接收光照，超过其光饱和点，导致光合速率不再增加，甚至减弱和停止(欧阳峥嵘，2010)，不利于细胞生长。因此，不同曝气比率对小球藻生长机制的影响不同，必定存在最适宜的曝气比率。根据2．1．3中细胞干重与OD680的线性关系式，可求出各梯度每天的细胞干重，从而得出日生产量。统计各梯度最大OD680、比增长率μ和日生产量(详见表1);可见不同梯度下小球藻ODmax、μmax、Cmax差异明显。各梯度(0%除外)下的OD680随时间变化逐渐增大，10%、20%、30%和50%梯度均在第10天达到最大值，0%梯度的ODmax出现最早。各梯度ODmax大小顺序依次为20%＞30%＞10%＞50%＞70%＞2%＞0%。在本实验曝气比率范围内，20%梯度下的小球藻OD680最大，与初始值差异达到9．580，生物量最大;30%梯度次之，为9．045。因此，若以ODmax为评价指标，20%和30%的曝气比率最适合小球藻生长，尤以20%的曝气比率为佳。实验期间，0%梯度下的μmax最小，结合***6，其第1、5、7、8天均呈负增长，整体死亡速率大于生长速率。各梯度μmax大小顺序依次为20%＞50%＞10%＞30%＞70%＞2%＞0%;其中，20%和50%梯度下的μmax较大，20%的μmax高于其他梯度，为0．649;因此，若以μmax为最终评价指标，20%的曝气比率下小球藻生长速率最快。0%和10%梯度下的日生产量在第2天达到最大，20%～70%共4个梯度日产量均在第3天达到最大，而2%梯度至第4天才出现Cmax，且其值最小。各梯度的Cmax大小顺序依次为20%＞30%＞10%＞50%＞70%＞2%＞0%。若以Cmax为评价指标，20%的曝气比率下小球藻日产量最大。综合考虑不同评价指标，20%的曝气比率较其他梯度更适合小球藻生长。
3．2曝气比率与小球藻生长适配曲线优化分析为了探究曝气比率与小球藻生长的适配曲线，将曝气比率与ODmax、μmax、Cmax进行拟合(***9)。曝气比率与ODmax、Cmax和μmax均为3次抛物线拟合曲线，方差较高，拟合所得的曲线关系式均能较好地反映不同光照强度与小球藻生长之间的数学关系。曝气比率在0%～50%时，ODmax先增长、后降低，峰值出现在20%～30%区间;50%＜x＜70%时的拟合曲线显示，ODmax降低到一定值后再次上升，但实验数据显示ODmax无回升现象，而继续呈降低趋势，因此其关系式有待进一步验证。曝气比率(x)在0～50%的关系式为ODmax=170．63x3－231．83x2+84．341x+1．8439(0＜x＜50%;R2=0．9850)曝气比率与Cmax的拟合曲线同ODmax的拟合曲线变化规律相似，峰值出现在20%附近，曝气比率(x)与Cmax的关系式为:Cmax=15．844x3－19．803x2+6．8594x+0．0521(0＜x＜50%;R2=0．9285)曝气比率与μmax的拟合曲线也为3次方程。***9显示，μmax呈先增长、后降低的趋势，峰值出现在20%～30%区间，与实验数据相符;曝气比率(x)与μmax的关系式为:μmax=8．1202x3－11．428x2+4．4963x+0．1173(20%＜x＜30%;R2=0．8581)4结论(1)不同曝气比率下，小球藻生长差异较大。适宜的曝气量能促进小球藻的生长，曝气比率为0%～70%时，小球藻OD680、叶绿素a浓度随着曝气强度的增加呈先增大、后减小的变化规律，且其浓度峰值均出现在20%～30%。不曝气(0%)不适合小球藻生长，OD680、叶绿素a浓度在培养时间内逐渐降低;(2)曝气比率不仅影响小球藻OD680和叶绿素a浓度变化，而且改变培养液的pH。曝气比率较小时，培养液的pH较高;(3)曝气比率适宜的小球藻比增长率最小值均≥0，说明在培养条件足够优化时，小球藻的生长会一直处于稳定期;(4)不同评价指标的最适曝气比率各异，综合考虑认为小球藻最适曝气比率为20%;(5)曝气比率与μmax符合3次抛物线拟合曲线，且能较好地反应曝气量与小球藻的数学关系;而其与ODmax和Cmax也符合3次抛物线拟合曲线，但只在有限区间内反映曝气量与小球藻生长的关系，对于区间之外的数学关系仍需进一步验证。
作者：万晓安刘德富杨正建方丽娟崔玉洁朱小明胡雪单位：三峡大学水利与环境学院湖北工业大学资源与环境科学学院武汉大学水利水电学院
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