学文网摘要：目的 探索细菌特殊结构的染色观察及实验室检验方法。 方法 在实验室条件下，取样本分别采用涂片、干燥固定、染色和加热等步骤进行检测。结论 通过光学显微镜的观察，了解细菌芽孢、荚膜和鞭毛染色的原理和意义，学会芽孢、荚膜和鞭毛染色的方法。
关键词：细菌；细菌的染色体；检验
细菌（英文：germs；学名：bacteria），是微生物的主要类群之一，属于细菌域。广义的细菌即为原核生物是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region）（或拟核）的DNA的原始单细胞生物，包括真细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二***方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。细菌的个体非常小，目前已知最小的细菌只有0.2微米长，因此大多只能在显微镜下看到它们。细菌一般是单细胞，细胞结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器。
1 检验准备
1.1 仪器：普通光学显微镜、超净工作台、恒温培养箱。
1.2 实验菌：枯草芽孢杆菌，为24～48h营养琼脂培养物；肠膜状明串珠菌，为24h营养琼脂培养。
1.3 普通变形杆菌：为营养琼脂培养基（琼脂用量0.8%）连续转接培养4～5代，每代
培养18～22h。
1.4 染色液：无菌水（10mL分装于试管中）、孔雀绿染色液、沙黄染色液、结晶紫染色液、20%硫。
酸铜溶液、95%乙醇溶液、硝酸银染色液。
1.5 其他：香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、烧杯、玻璃棒。
2 细菌原理：
2.1 芽孢：
芽孢是某些细菌生长到一定阶段后在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细
菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴
定细菌的依据之一。
芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，对各种不利因素如高温、冷冻、射线、干燥、化
学药品和染料等具有很强的抵抗力。
芽孢染色法是根据芽孢具有难以染色而一旦染色后又难以脱色的特点而设计的，所以
芽孢染色法都基于同一原则：选用着色力强的染料进行染色。
2.2 芽孢染色法的操作步骤为：
涂片――在洁净的载玻片中央加一小滴无菌水，用灭菌的接种环取少许枯草芽孢杆菌置于水滴中并和水滴充分混匀，并涂成极薄的菌膜。
干燥固定――涂片在空气中干燥后，手持载玻片一端，有菌膜一面向上，通过酒精灯的微火三次。注意用手指触摸载玻片反面，以不烫手为宜。冷却。
染色和加热――在涂菌处滴加孔雀绿染色液，并在微火上加热至染料冒蒸汽开始计时，加热染色l0min。注意加热时要不断补充孑L雀绿染色液，以免烧干。
水洗――倾去染色液，冷却后用水冲洗。
复染――用沙黄染色液染色1min。
水洗、干燥、镜检――结果：芽孢被染成绿色，营养体呈红色。
2.3 荚膜：
荚膜是包围在某些细菌细胞外的一层黏液状或胶质状的物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。荚膜与染料的亲和力弱，不易着色，再有荚膜物质溶于水，用水冲洗时易被除去。
Anthony染色法是先以结晶紫作为初染剂，加于未经加热固定的菌膜上，菌体和荚膜均被染成深蓝紫色，然后用20%硫酸铜溶液为脱色剂。
2.4 荚膜Anthony染色法的操作步骤：
涂片――在洁净的载玻片的一端加2～3滴结晶紫染色液，用灭菌的接种环取l环菌与玻片上的结晶紫染色液充分混匀。用一块洁净的载玻片的窄边将混匀的菌液刮开涂成极薄的菌膜，放置5～7min。
干燥――在空气中自然干燥。注意切勿用酒精灯加热。
脱色――用20%硫酸铜溶液冲洗脱色后，在空气中干燥或用吸水纸吸干。
镜检――结果：荚膜浅蓝色或灰白色，菌体深蓝紫色。
2.5 鞭毛：
细菌的鞭毛很细，直径为10～20nm，用电子显微镜可以清楚观察到。但是若采用特殊染色方法使鞭毛加粗，在普通光学显微镜下也可以看到鞭毛。鞭毛染色方法很多。本实验采用银染法进行鞭毛染色。
2.6 银染法进行鞭毛染色的操作步骤：
载玻片清洗――选择新的光滑无划痕的载玻片，浸泡于洗洁精充分溶解的水中，煮沸20min，稍冷后取出用自来水冲洗干净并沥干，然后浸泡于95%乙醇溶液中。用时取出，在酒精灯火焰上烧去酒精后即可使用。
菌液制备――将分装于试管中的无菌水缓慢地倒人经4～5代转接培养的斜面培养物中，不要摇动试管，让菌体在水中自行扩散。注意蒸馏水预先在恒温培养箱中保温，使之于与菌种同温。置于恒温培养箱中保温10min。目的是让没有鞭毛的老菌体下沉，而具有鞭毛的菌体在水中松开鞭毛。
涂片――用吸管从菌液上端吸取菌液于洁净的载玻片一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端。
干燥――在空气中自然干燥。
染色――滴加硝酸银染色液A液，染色4～6min；用蒸馏水轻轻地充分洗净A液。用B液冲去残水，再加硝酸银染色液8液于玻片上。用酒精灯微火加热至有蒸汽冒出，维持1mm左右。注意加热时应随时补充B液，不可使玻上B液蒸干。用蒸馏水冲洗，干燥。
镜检――结果：菌体和鞭毛呈深褐色至黑色。
3 检验步骤：
对枯草芽孢杆菌进行芽孢染色，镜检，并绘***和描述菌体、芽孢特征。
对肠膜状明串珠菌进行荚膜染色，镜检，并绘***和描述菌体、荚膜特征。
对普通变形杆菌进行鞭毛染色，镜检，并描述鞭毛着生方式。
4 检验结果
通过光学显微镜的观察，了解细菌芽孢、荚膜和鞭毛染色的原理和意义，学会芽孢、荚膜和鞭毛染色的方法。
参考文献
[1] 陈菊滟，陈文娟，赵桂芳. 教学用细菌染色方法的改进. 微生物学通报， 1999，26，02.
[2] 姚文琴，刘晓焱.两种改良芽胞染色法染色效果观察.检验医学与临床， 2008， 5，07.
[3] 叶生梅，高威.细菌芽胞染色方法改进研究.微生物学杂志， 2011， 31，01.
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