学文网【摘 要】细菌“活的非可培养状态”（viable but non-culturable state ，VBNC）概念的提出对公共卫生学、微生物学、预防医学等传统学科产生了巨大冲击，大量研究结果证明很多细菌包括许多重要病原菌均可进入VBNC状态。处于VBNC状态的细菌在常规培养基上不生长，但在一定条件下可以复苏并保持毒力，实验表明部分病原菌处于VBNC状态仍具有致病性。本文对目前国内外关于VBNC状态细菌的研究进行了如下综述。
【关键词】活的非可培养状态；致病性；复苏
自上世纪80年代提出细菌“活的非可培养状态”至今，作为公认的非可培养微生物，它一直是流行病学、预防医学以及公共卫生检验检***等方面的热点研究问题之一。大量研究已证明，许多重要病原菌都存在VBNC状态，由于该特殊存在形式使得其可能逃避传统的检测手段监测，从而造成流行病学及公共卫生学隐患。本文对目前国内外关于VBNC状态细菌的研究进行了如下综述。
1.VBNC状态细菌的生物学特性
1.1. 形态学变化 处于VBNC状态的细菌形态会发生改变。大多数G-菌会出现体积变小，由杆状或弧状变为球杆状甚至有些会缩成球形。当然并非所有的G-都会缩小，有研究表明G-的Enterococcus f aecalis 的形态变化没有变小反而有轻微的伸长。这也说明其形态的变化可能只是菌体对于环境变化产生的一种自我保护现象。尽管VBNC状态细菌其形态会发生变化，其细胞内白体和合算物质密度明显降低，但其细胞外膜是保持正常的。
1.2. 生理生化特性的改变 处于VBNC状态的细菌其对底物吸收减少，核糖体及染色质核素密度明显降低。细胞中浓缩，蛋白质和脂质总量下降。但细菌在开始进入VBNC状态时一般会合成一些新的蛋白，如费氏霍乱弧菌能合成出40种新的正常条件下没有的蛋白质。此外，VBNC状态细菌的营养盐转运及呼吸速率还明显下降。Tholozan发现，C.jejuni进入VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K+浓度和膜势能均降低，ATP及ADP浓度降低，30d后仅能检测到AMP存在。HEIM等发现粪肠球菌处于VBNC 状态时， ET2Tu 明显降低， EF2Ts 合成增多。ET2Tu 为蛋白质合成的关键酶，在VBNC 状态时降低说明蛋白质合成下降， EF2Ts 的增多是细菌的代谢调节机制造成的，EF2Ts 可促进ET2Tu 再利用，从而保证细菌在低代谢水平上合成少量蛋白质。
2.VBNC状态细菌的致病性
大量实验实验证明进入VBNC状态的病原菌并不意味着其致病性的消失。Saux等人曾应用半套式RT-PCR对于进入VBNC状态的V.vulnificus进行检测，证实其仍有细胞毒素-溶血素vvhA的mRNA的存在；Colwell等人证实VBNC状态的V.cholerae仍然能够导致人腹泻，并发现进入VBNC状态28d后该菌依然可以产生霍乱毒素，经过PCR检测也证实了该基因的存在；Rahman等人对VBNC状态的S.dysenteriae进行组织培养实验并同时应用PCR和ELISA方法进行检测，发现VBNC状态下的该菌不但仍然保留着志贺菌毒素stx基因和具有生物活性的ShT毒素蛋白，而且该菌对于小肠表皮细胞仍具有吸附能力。
当然，并非所以的VBNC状态病原菌都具有毒性。大量事实说明细菌进入VBNC状态时间越久，其细胞完整性越容易受到破坏，从而导致其感染能力下降，而有的甚至失去复苏的能力。然而由于实验室条件的特殊性存在，在实验室中获得的结果在某些情况下可能与实际情况有一定的差距，也就是说某些细菌其在实验室条件下的存活情况以及其致病性状况的改变并不能将其完全视为自然环境中的真实体现。
3.VBNC状态细菌的检测
目前应用于VBNC细菌的检查方法众多，然而任何方法都有其本身的局限性，因此对于活细胞检测方法的选择，还是应该取决于检测的目的。即要获得最大可能的活细胞数目还是要获得最严谨意义上的活细胞数。目前较常用的检测VBNC状态细菌的主要方法有以下几种。
3.1 活菌直接计数法（DVC）
DVC是基因底物吸收能力的检测方法，也是目前最为常用的检测方法。Kogure于1979年首次使用该方法。该方法主要是在细菌培养物中添加少量的DNA合成抑制剂萘啶酮酸，培养数小时后用戊二醛或甲醛固定，经吖啶橙染色后用落射荧光显微镜进行观察。若观察结果显示细胞变粗且伸长则说明其为存活状态。该方法常被应用与检测自然环境中的某些特定细菌，并时常结合原位杂交、单克隆抗体等技术，其灵敏度较高可以特异性的检测出目标菌体。姚斐等人曾将DVC和IFAT技术结合用来检测VBNC状态的V.parahaemolyticus，实验结果证实其特异性较强，重复性良好。然而该方法还是有一定的缺点的，由于绝大多数G+菌和少数的G_菌对萘啶酮酸会产生抗性，而且营养物中的酵母膏和固定细菌时所使用的福尔马林会产生沉淀，其沉淀可被吖啶橙染色导致背景过亮从而影响观察效果。为改善其不足，后有学者用环丙沙星作为DNA合成抑制剂应用与DVC方法，同时将营养物更换为10%大豆蛋白胨，实验结果发现其不仅能够有效抑制G+菌和G_菌的细胞***而且很好的解决了荧光观察背景问题。
3.2 呼吸检测法
该方法是基于氧化还原能力的检测方法。主要方法是哎培养物中加入INT或者CTC等电子受体物质，此类物质在细菌新陈代谢作用下可以被还原。而被还原后的INT和CTC可由无色物质变为紫色和红色，该方法即通过此特异性进行检测。无论是自养还是异养细菌，只要其有活跃的电子传递链，都可通过该方法被检测出来。因而此方法相对于DNC方法有着其明显的优越性。然而有报道发现当细菌处于VBNC状态时，其膜表面的INT沉淀物质很难被观察到，另外目前还不能确定是否所有的细菌均能降解CTC。因此为保证其准确性，该方法如果能结合DNC方法效果将好很多。
3.3 Live/Dead染色法
Live/Dead BacLightTM Bacterial Viability Kit试剂盒目前广泛应用于VBNC的研究当中，该试剂盒主要是基因细胞质膜结构完整性的检测。试剂盒包括两种核酸染料：绿色荧光染料SYTO 9和红色荧光染料PI。前者在480/500nm波长下呈绿色，无论活菌死菌其细胞均可染色；而PI则无法进入具有完整细胞膜的细菌因此只能染色“死”细菌，其在490/635nm波长下呈红色，而且会降低SYTO 9造成的绿色荧光效果。因此染色后在荧光显微镜下分别显示红色和绿色。
3.4 分子生物学方法
随着分子生物学的飞速发展，利用分子手段检测细菌已经成为大势所趋。但是对于VBNC状态的细菌自身特点即DNA、RNA等含量均减少，因此这些方法所具有的高灵敏度等特点对于VBNC细菌的检测明显减低。因此若要利用PCR等手段进行检测VBNC状态细胞，所需要的检测模板用量势必要有所增加。然而Warner等人利用RAPD技术在检测VBNC细菌时发现，细菌在进入此过程中其检测信号在逐渐消失。而以DNA为基础的检测手段还有一个明显的不足即无法区分细胞的死活。由于以上缺点的存在，mRNA由于其在细胞代谢过程中的中心地位以及其非常短暂的半衰期，被认为是活细胞存活的标志。Saux等利用半套式RT-PCR检测创伤弧菌mRNA，发现死细胞中的mRNA信号随即消失，因此mRNA的检测可作为判定细胞死活的标志之一。
3.5 免***学方法
大量研究结果证实了处于VBNC状态的细菌其细胞壁完整，仍保留着和正常细菌同样的表明抗原，因此可以应用免***技术对其进行检测。姚斐等采用间接ELISA技术检测了VBNC状态下的E.coli O157：H7，结果发现该方法可以快速有效的将其检测出来，然而同时发现在相同抗原浓度下，处于VBNC状态的细菌其OD值要远远低于正常细菌，而且其在包被过程中不能像正常细胞一样吸附于测定板上。
4.VBNC状态细菌的研究意义极其展望
细菌的VBNC状态的发现对于生物遗传学、微生态学、流行病学、公共卫生检测等方面的研究有着重要的意义，大量研究证明处于VBNC状态的细菌在条件适宜时即可复苏并保持其毒力，部分细菌在VBNC状态下仍保持其部分致病性。由于VBNC状态细菌其该特殊性的存在使得该状态下的病原菌可以逃避传统检测手段监视，从而造成公共卫生隐患，因此寻求一种新型有效的检测手段对于公共卫生学意义重大。另外，VBNC状态细菌作为自然界中未能开发利用的微生物资源，对其形成机理、潜在机能及应用性能的研究将成为学者们广泛关注的焦点。
关于VBNC状态菌的形成机制，各阶段性的特殊表达基因，其与各种生态环境因子间的作用等都有待于通过分子生物学、分子生态学、遗传学等手段进行深入研究，对于VBNC状态细菌的研究也将赋予科研工作者更多新的科学依据，为其提供更为广阔的科研思路。对于其潜在机能的研究，也将为其提供更为广阔的开发应用前景。
参考文献：
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[2]SAUX M F L ， HERVIO2HEATH D ， LOAEC S ， et al . Detection of cytotoxin Hemolysin mRNA in nonculturable populations of environmental and clinical Vibrio vulnificus strains in artificial seawater [ J ] . Appl Environ Microbiol ， 2002
[3]DU M， CHEN J X， ZHANG X H ， et al . Retention of Virulence in a Viable but Nonculturable Edwardsiella tarda Isolate [J ] . Appl Environ Microbiol ， 2007
基金项目：
天津农学院科研发展基金计划（2011N15）
作者简介：
胡烨（1984-），女，黑龙江省齐齐哈尔市人，硕士，研究方向为动物微生物学。
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