学文网胚胎干细胞篇1
2011年7月，美国洛杉矶朱尔斯・斯坦眼科研究所几位医生在卫生部指导下实施视网膜手术，成功扭转了两位患者失明的厄运。其中一位年已七旬，患有老年性黄斑变性，另一位患有黄色斑点状眼底合并黄斑变性。这是科学家首次利用人的胚胎干细胞来修复视网膜，显示出人体持续更新的希望，因而意义重大。与成人某些器官中分化能力有限的干细胞不同，胚胎干细胞具有分化大脑、心脏、肺等各种人类器官的能力，是再生医学的有力工具。1998年，人们从5～6天的人体胚胎中发现了胚胎干细胞。此后，它便成为许多研究项目的研究对象。由于胚胎干细胞的一些作用尚未得到确认，因此还处于实验室研究阶段。此次手术成功，极大地加快了未来医学――再生医学的发展进程。
对此，朱尔斯・斯坦眼科研究所眼外科医生事先并未真正料到。当然，在进入手术室时，他们清楚将要实施一项全新手术。眼科医生让皮埃尔・于布施曼解释说：“从技术上看，我们做的是常规手术。先是轻轻地提起患者的视网膜，然后注射几滴液体。”与以往不同的是，该液体含有眼睛接收光所必不可少的色素细胞，数量达到50000个以上。
新疗法带来希望
这些珍贵的色素细胞由2000个左右的胚胎干细胞转化而来。美国先进细胞科技公司ACT研究的细胞培养与分化方法，使它们保留了若干增值能力。因此，培养的细胞被注射到患者的某个准确部位后，便能够定植于局部视网膜底并且将其覆盖。
解释：胚胎干细胞，也称为多能干细胞，可以从5～6天的人类胚胎中找到，是人体各种细胞的起源。为了开展研究，实验室通常用多余胚胎，也就是体外受精的弃用胚胎。
数月后，视网膜成像技术证实手术取得了成功，***部位的注射细胞最终可视物体。两位患者尽管仍然遭受晚期眼病的折磨，但视力得到了改善。对此，让皮埃尔・于布施曼持谨慎态度：“虽然运用新疗法来***这两种不治之症带给了人们极大希望，但是我们不能相信奇迹。经过手术***的患者仅有两名，因此即使结果看来非常鼓舞人心，但现在断定它的成功还为时尚早。”此后，美国和英国的一些其他患者也接受了类似手术***。全部结果将于2014年揭晓。与此同时，人们还将很快在心脏、大脑和胰腺等各种人体器官上进行试验。毫无疑问，胚胎干细胞将大显身手。
尽管如此，胚胎干细胞自从被发现并用于医学以来，也使人们惶恐不安。从人胚胎或非人胚胎提取胚胎干细胞的合法性，还引发了激烈的伦理争议。人们不安是出于生物学方面的原因。因为，胚胎干细胞的分化能力具有负面作用，有人怀疑它会促使肿瘤细胞生长，尤其是使畸胎瘤快速生长。为了限制这个风险，ACT公司寄希望于将无生命的器官植入眼内。这样，免***排斥反应便极为有限。撇开新疗法的效果，两例开创性的视网膜手术都显示出胚胎干细胞对人体无害。对此，法国获准开展胚胎干细胞研究的21个研究中心之一，单基因病研究与干细胞***研究院实验室马克・佩尚斯基肯定地说：“这是振奋人心的好消息。”几个月前，相关研究还停滞不前。对于胚胎干细胞研究，这些令患者大为安心的结果可谓来得非常及时。
实验室开展胚胎干细胞实验研究逾13年后，怀疑言论开始出现。学界有人甚至预言相关研究在医学上没有任何使用价值。2011年，由于有人指责实验室费用过高，不切实际，而且风险过大，结果很难预料，美国杰龙公司甚至不得已放弃了将胚胎干细胞植入瘫痪患者脊髓的试验。马克・佩尚斯基承认：“放弃实验有点令人沮丧。”直到谈及ACT公司的研究工作，他才重现笑颜。
胚胎干细胞篇2
那么，有没有可能制造出单倍体胚胎干细胞呢？科学家们想出了非常巧妙的办法。他们把注射到去除了细胞核的卵母细胞中，或者把原核期受精卵的雌原核去除，再把这样的细胞体外培养到囊胚期，由此能获得“孤雄单倍体胚胎干细胞”。类似地，去除原核期受精卵的雄原核，或者孤雌激活卵母细胞，再将细胞体外培养至囊胚，则能获得“孤雌单倍体胚胎干细胞”。经检测验证，这些单倍体干细胞既保持了普通胚胎干细胞的特点，又同或卵细胞一样只有一套染色体，而不是像普通二倍体胚胎干细胞那样有两套。
获得基因修饰动物
为了检测单倍体胚胎干细胞的功能，科学家们将孤雄单倍体干细胞注射到卵母细胞中，惊奇地发现，它能够成功替代完成使卵受精的使命，所得胚胎能正常发育至成年并具有生育能力。进一步，科学家们对这种孤雄单倍体胚胎干细胞进行了特定的基因修饰，并注射进卵母细胞得到后代，这样出生的小鼠直接携带了这种修饰后的基因序列，从而方便地获得了基因修饰动物。利用单倍体胚胎干细胞获得基因修饰动物，为一些其胚胎干细胞不能嵌合到生殖系的物种，例如非人灵长类等，提供了新型的获得基因修饰动物模型的方法。
进行同性生殖
由于在哺***动物中进化出了基因组印记调控，哺***动物无法实现同性生殖。而利用单倍体胚胎干细胞技术，小鼠的同性生殖已经成为了现实。科学家们利用新型的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统改变了孤雌单倍体干细胞中称为H19和Gtl2的两个非常重要的印记基因区域，将原本的雌性印记逆转为了雄性印记。然后将这种逆转后的孤雌单倍体干细胞替代，注射进卵母细胞，获得了遗传物质来自于两个雌性亲本的后代小鼠。这一技术将加速人们对于基因组印记机制的研究，也会给生殖方式带来新的认知。
研究物种间杂交
物种之间存在生殖隔离，一直以来，科学家都想获得分别来源于两个物种全套遗传物质的稳定细胞系。而最近，科学家利用单倍体干细胞技术，将这一想法变为现实。他们将大鼠和小鼠的单倍体胚胎干细胞进行细胞融合，创造出了大小鼠异种杂合二倍体胚胎干细胞，这种细胞含有一套大鼠染色体和一套小鼠染色体。他们通过测序方法统计出大部分基因的表达量是小鼠和大鼠各贡献一半。这一研究建立了新型的哺***动物胚胎干细胞，为研究物种间性状差异，物种间基因、RNA和蛋白质之间相互作用提供了非常好的工具。
胚胎干细胞篇3
[关键词] 环孢霉素;胚胎干细胞;细胞分化;心肌细胞
[中***分类号] R329.2+8[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)05(b)-021-02
Cyclosporin-A induces differentiation of cardiocytes from embryonic stem cells
YAN Peishi
(Department of Cardiology, Dalian Central Hospital, Dalian 116000, China)
[Abstract] Objective: To observe the role of cyclosporin-A (CSA) in differentiation of cardiocytes from embryonic stem cells (ESCs). Methods: The differentiation rates of cardiocytes from ESCs with or without CSA induction were observed. The expression of cardiocyte markers were evaluated with immunohistochemistry. Results: Compared with those of spontaneous differentiation, the differentiation rates of cardiocytes were significantly higher in the presence of CSA. CSA-induced cardiocytes showed the specific features of cardiocytes. Conclusion: CSA potently induces cardiocytes derived from ESCs.
[Key words] Cyclosporin-A; Embryonic stem cells; Cell differentiation; Cardiocytes
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)研究已经为再生医学带来了众多的希望和选择[1-2]。许多干细胞研究已表明ESCs可成功诱导出心肌细胞,而且移植到体内可形成心肌组织[3],但目前尚没有非常有效的诱导ESCs向心肌细胞分化的方法。
有研究报道了一个新的体外分化心肌细胞系统[4-5],避免了EB的形成,是一个二维细胞培养系统。Flk1是内皮生长因子的受体之一,是最早形成的内皮细胞和血细胞的表面标志物,也是中胚层干细胞的标志物。这个分化系统中,代表3个不同分化阶段的ES细胞是逐步诱导的,它们是未分化的ES细胞,Flk1+的中胚层干细胞和心肌细胞。第一步诱导ESCs生成Flk1阳性细胞,用流式细胞仪(FACS)分离提纯,再继续在OP9饲养层细胞上分化培养Flk1阳性细胞。在Flk1细胞分化的第4天,可出现自主搏动的心肌细胞。
笔者在进行细胞移植实验时,将分离纯化的心肌细胞注射到服用环孢霉素A(CSA)的小鼠体内,作为对照实验,在体外探讨了CSA对心肌细胞分化的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
高糖DMEM培养液,青/链霉素双抗,非必需氨基酸,β巯基乙醇,L谷氨酰胺,胰蛋白酶,胎牛血清,白血病抑制因子(LIF),明胶,丝裂霉素C,CSA(由诺华药品公司赠送)加入二甲基亚砜溶解为30 mg/ml。用分化培养基在用时稀释成1～3 μg/ml。小鼠抗心肌肌小节(α-actinin)、肌钙蛋白T(cTnT)抗体、Alexander546标记的兔抗鼠荧光抗体、鼠Flk1(AVAS12)单克隆抗体购自NeoMarkers。
1.2 方法
1.2.1 小鼠ESCs的培养及分化EMG7胚胎干细胞株由日本京都大学山下润副教授馈赠。该细胞株导入了αMHC启动子控制的GFP基因,当自主搏动的心肌细胞出现时,在荧光显微镜下可观察到心肌细胞的绿色荧光。
ESCs复苏后接种到明胶覆盖的培养皿上,加入ESCs培养基,于37℃、5% CO2孵箱中培养,隔天传代。ESCs培养基为含有非必须氨基酸(0.1 mmol/L)、青霉素(50 U/mL)、链霉素(50 μg/L)、β巯基乙醇(0.1 mmol/L)、LIF(1×106 U/ml)、胎牛血清(15% V/V)的DMEM。将传代2～3次的ESCs消化,离心后加入分化培养基,分化培养基为含有青/链霉素双抗及胎牛血清(20% V/V)的DMEM。每48小时更换分化液,第4.5天(108 h)时用FACS分离提纯Flk1阳性细胞,继续在OP9饲养层细胞上培养4 d,自主搏动的心肌细胞可出现,第6天可以用FACS分离提纯GFP阳性的心肌细胞。单纯加分化培养基的设为对照组(n=5),即自发分化组;分化培养基中加入CSA(n=5),即诱导分化组,在Flk1阳性细胞接种到OP9细胞上时加入CSA。
1.2.2 OP-9细胞的准备 取3～5代的OP9,加入终浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C处理2 h,PBS洗涤2次,消化、离心,接种到10 cm的培养皿中制成饲养单层细胞。
1.2.3 FACS分离提纯细胞经过96～108 h分化,把细胞从培养皿上消化并收集起来,与APC-Flk1抗体结合,标记上DAPI,用FACS-Vantage分离提纯Flk1阳性细胞,继续在OP9细胞上培养6 d。
1.2.4 细胞免***荧光检测吸掉24孔培养皿中的培养液,室温下4%多聚甲醛固定15 min,冷PBS洗涤2次,加1% BSA室温下封闭30 min。加入cTnT抗体(1∶2 000稀释)及α-actinin(1∶200稀释)4℃孵育过夜。第2天PBS洗涤后加入Alexander546标记的兔抗鼠抗体(1∶200稀释),室温下孵育1 h;PBS洗涤后复染0.1 μg/ml DAPI,荧光显微镜下观察。
1.2.5 定量分析心肌细胞的分化率cTnT荧光染色后,使用电子CCD相机探测cTnT的荧光强度,然后用Image-Pro Plus***像处理软件处理数据。
1.3 统计学处理
经SPSS 11.5软件分析,组间比较采用方差分析,P
2 结果
2.1 CSA对ESCs的诱导作用
数据以均数±标准差(x±s)表示,CSA能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。加入CSA显著增加了自主搏动的心肌细胞(***1A);对照组cTnT阳性心肌细胞为(1.00±0.05),CSA组为(13.00±0.08),CSA组比对照组增加了13倍(P
***1CSA诱导并扩增ESCs分化形成心肌细胞
(A.cTnT-HRP染色后显示CSA诱导的cTnT阳性心肌细胞增多;B.用cTnT免***荧光染色后,定量评估心肌细胞分化率)
Fig.1Cardiocyte induction from ESCs by CSA
(A.CSA-induced cTnT positive cardiocyte increased after cTnT-HRP staining; B.Quantitative evaluation of cardiocyte induction by fluorescent intensity of cTnT staining)
2.2 细胞免***荧光检测
细胞免***荧光检测显示,CSA诱导生成的心肌细胞可正常表达cTnT(***2A)和心肌肌小节α-actinin(***2B、C)说明肌浆网形成。
以上结果表明CSA成功诱导了ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。
3 讨论
心肌细胞是终末分化细胞。当心肌细胞发生缺血、坏死后,心肌组织发生重构,有效心肌数目减少,心脏功能发生不可逆减退,导致心力衰竭[6]。ESCs是具有自我更新能力和多向分化潜能的全能干细胞,是心肌细胞再生的理想供体细胞,但目前胚胎干细胞向心肌细胞分化的阳性率很低[7]。
本研究提供了一种新的方法来诱导和扩增胚胎干细胞向心肌细胞分化。CSA是一种calcineurin拮抗剂,能够阻断T细胞内的NFAT的信息通路,从而发挥免***抑制剂的作用[8]。CSA还参与了各种各样的细胞活动[9],如心脏瓣膜的形成[10]、心肌肥厚[11]和毛发的生长[12]。CSA可能经NFAT信息通路参与心肌细胞的分化,但目前具体的作用机制还不明确,有待进一步研究。
[参考文献]
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胚胎干细胞篇4
近日，英国伦敦帝国学院（Imperial College London）的科学家成功地利用人类胚胎干细胞培养出了软骨细胞，这为在将来某一天进行软骨移植提供了很好的契机。
研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。
软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。
文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”
研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。
科研人员将这些胚胎干细胞移植到老鼠体内的特定生物活性部位，之后进行了35的观察。当干细胞脱离活性部位后，研究人员发现这些细胞形成了新的软骨，研究结果显示这些软骨还可以被成功移植到活体组织中去。
胚胎干细胞篇5
【关键词】纹状体组织块; 诱导;胚胎干细胞; 定向分化
【中***分类号】R321-3【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2012）08-0072-02胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺种分离出来的一种未分化的、具有多向分化潜能的细胞［1］，它具有体外培养无限增殖、自我更新的特性，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。而近期国内一些学者也已成功从人胚胎海马组织中提取并培养出神经干细胞，为进一步的干细胞分化移植研究积累了宝贵的经验［2］。本文采用纹状体组织块与胚胎干细胞联合培养的方法，探索如何高效诱导胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元，取得了满意效果，现报告如下：
1 材料和方法
1.1 一般材料
1.1.1 主要试剂与仪器： Neuralbasal即用型神经细胞液体培养基（美国生命技术公司，批号F15971）；高糖、F12（Gibco公司，批号1459011）；B．巯基乙醇（Sigma公司，批号05558311）；胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所，批号AB3101C190）；小牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；丝裂霉素C（浙江海正，批号050812）重组人表皮生长因子（EGF，英国Peprotech公司）；白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor, LIF）（Sigma公司，批号064K1133）；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）单克隆抗体（Santa Cruz公司）；人胚胎纹状体组织块（自备）。CO2培养箱（美国SIM公司，E191TC）;倒置显微镜（日本Olympus公司，CKX42）。
1.1.2 早期胚胎的收集与培养： 分别取孕3.5、4.5d的母鼠，断颈处死，在无菌条件下取出子宫；用1mL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔；每侧子宫注入冲胚液0.2—0.5mL，冲胚液会将胚胎冲出；将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40—100倍的倒置显微镜下；用移液器（上海大龙公司，0.2—10μL，YR23777）收集胚胎；最后以文献［3］所示方法进行培养。
1.1.3 饲养层的制备： 雌雄鼠合笼，于每天早上观察***栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天；取孕12.5—14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成1mm3以下的碎块，用向培养基中加入10g／ml的丝裂霉素C，作用2—3h，充分洗涤后，接种在涂有0.1％明胶的四孔板中。
1.1.4 ES细胞的分离培养： 无菌条件下分离孕14d 的昆明小鼠鼠中脑腹侧脑组织，加入 0.25％胰蛋白酶室温消化20min，离心弃上清后加入含B27（20mg/mL）、EGF（20ng/mL）、bFGF（20ng/mL）、100u/mL青霉素和100 u/mL链霉素的DMEM/F12（1：1）无血清培养液，玻璃吸管轻柔吹打分散细胞，100目滤网过滤制成单细胞悬液。台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞浓度为5×105个/mL，接种入25 mL培养瓶内，每瓶量约5 mL。培养瓶置入CO2：恒温培养箱（5％CO2、95％O2、37℃）内培养。每3、4天半量换液1次，培养7—10d后，选生长旺盛的ES细胞集落消化成单细胞悬液。
1.1.5 纹状体组织块的制备： 在解剖镜下取新生昆明小鼠的纹状体，于无Ca2+、Mg2+Hanks液中反复冲洗去除血污，剥净脑膜后，切成0.5 mm长、0.5mm宽、0.5mm高的组织块备用。
1.2 培养方法： 实验组：基础培养基+人胚胎纹状体组织提取液（50 ml/L）。分化的第1、4、7、11d取出细胞爬片进行抗TH免***细胞化学染色。对照组只加入基础培养基，不加纹状体组织块，其他条件相同。每组3皿，重复3次实验。
1.3 统计学处理： 采用χ2检验的精确概率检验法。
2 结果
胚胎干细胞篇6
关键词：神经干细胞；黄芪甲苷；增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015
中***分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0042-03
学基础[1]。近来，很多研究表明，NSCs和神经前体细胞的替代移植疗法对***脑和脊髓损伤、帕金森病及周围神经损伤等神经组织疾病具有强大的应用价值[2-5]。
中医药疗法在神经元保护和修复方面显示了一定作用。现代研究发现，黄芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩张血管、改善脑血流等作用[6]。黄芪甲苷是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，是黄芪的主要活性成分之一。本实验采用黄芪甲苷对大鼠胚胎干细胞增殖作用进行研究，为中枢神经系统疾病和损伤的修复提供实验基础和临床应用依据。
1 实验材料
1.1 培养基、试剂与药物
HBSS液（无钙离子和镁离子，LONZA，USA）；DMEM/F12（1∶1）培养液（Hyclone Laboratories，USA）；B27添加物（GIBCO， USA）；重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，ProSpec-Tany， Isreal）；人表皮生长因子（EGF，Strathmann Biotec， Germany）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×，Sigma）；Nestin小鼠单克隆抗体（Santa Cruz，USA）；BrdU小鼠单克隆抗体（Sigma， Germany）；ABC试剂盒（Vector Laboratories，USA）；DAB试剂盒（Vector Laboratories，USA）；黄芪甲苷、丹酚酸B（天津中一制药）。
1.2 仪器
MCO-5M 型O2/CO2孵箱（Sanyo，Japan）；CK30倒置显微镜、IX70荧光倒置显微镜（Olympus，Japan）。
2 实验方法
2.1 神经干细胞原代培养及传代
孕16 d SD大鼠，脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，取出串珠状子宫，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剥离外层骨膜，取出大脑皮质并去除软脑膜，冷HBSS液漂洗2次，转移至离心管加入一定量冷HBSS，吹打呈均匀悬浊状，过200目（70 ?m）筛网，1000 r/min离心8 min，弃上清，以全培基（含2%B27，20 ?g/L bFGF，20 ?g/L EGF的DMEM/F12，1%双抗的HBSS液）重悬，约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d行半量换液1次。约5～9 d传代1次。传代后以1×105个/mL的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。
2.2 神经干细胞亚代克隆Nestin鉴定
将经过多次连续传代所形成的亚代克隆细胞球接种于预先置有50 ?g/mL多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，0.3%Triton X-100室温通透，正常血清封闭，滴加Nestin小鼠单克隆抗体，行ABC法免***组织化学染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.3 神经干细胞BrdU标记及增殖鉴定
将NSCs亚代克隆细胞球制成1×105/mL的细胞悬液，培养3 d后掺入BrdU（10 ?mol/L），24 h后吹散NSCs克隆球，收集细胞接种于预先置有50 ?g/mL-多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，用盐酸变性硼酸中和，然后以正常血清封闭。滴加单克隆Anti-BrdU抗体（1∶800），4 ℃过夜，行ABC法免***组织化学染色，并以苏木素复染，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.4 有限稀释法检测黄芪甲苷对神经干细胞的增殖作用
将NSCs克隆球制成1×105个/mL的单细胞悬液，将该细胞悬液稀释240倍，分别加入0.035 ?mol/L丹酚酸B和不同剂量的黄芪甲苷（6、0.6、0.06 ?mol/L），种入24孔板。共设5组（对照组、丹酚酸B组及黄芪甲苷高、中、低剂量组），每组4孔。常规培养4 d后对神经球进行计数（包含细胞≥5）。
3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，采用方差分析。P
4 结果
4.1 神经干细胞培养及增殖鉴定
对传代NSCs进行Nestin染色，细胞胞浆呈棕黄色，为阳性（细胞阴性对照未黄染），表明本实验所培养细胞为NSCs，见***1。对传代NSCs进行BrdU标记后染色，与BrdU阴性对照比较，NSCs细胞核被黄染，表明经传代后NSCs依然具有体外***增殖能力，见***2。
4.2 不同剂量黄芪甲苷对神经干细胞增殖作用的影响
第1次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组神经球生成数目均显著增加（P
5 讨论
NSCs源于胚胎干细胞和成年干细胞，具有自我更新、多潜能分化、低免***原性，以及具有迁移功能等生物学特征。正常情况下NSCs通常处于静息状态，仅表现较低的再生能力，在一定的病理刺激下被激活。在神经退行性病变或中枢神经系统受到损伤的情况下，病变部位潜在的内源性干细胞可被激活，进行增殖、分化并取代死亡的神经元或胶质细胞[7]。利用NSCs***神经退行性病变以及修复中枢神经系统损伤存在巨大潜力。目前对NSCs的研究，一是在体外分离培养NSCs，并移植入受损的中枢神经系统内[8]；二是在体内诱导内源性NSCs的增殖和分化而获得自我修复[9-10]。由于具体的移植细胞的数量以及最佳的移植时间窗仍没有统一的标准，同时由于伦理学等因素的影响而使供体来源受限，因此寻找药物，尤其是天然植物药对内源性NSCs的增殖、分化的影响，将有巨大的价值。
Reynolds等[11-12]研究发现，可以通过NSCs形成神经球的能力来反映NSCs的自我更新能力。并且，对于神经球的培养技术已经被广泛应用，成为衡量NSCs自我更新能力的标准方法。本研究以无血清的培养基观察黄芪甲苷对神经球形成的影响。在添加EGF和bFGF的无血清培养基中，分离得到的大鼠胚胎NSCs能够增殖形成神经球。随着培养时间的延长，在含有不同浓度黄芪甲苷的药物培养基中，神经球的增殖水平有所提高。黄芪甲苷在0.06～6 ?mol/L的剂量范围内，培养板中神经球的数目显著增加。说明黄芪甲苷能够显著提高NSCs的增殖活性，并且有望在更低的剂量范围内表现出促进NSCs增殖的作用。
黄芪是常见的补气中药，有效成分主要有皂苷类、黄酮类及多糖等。曲氏等[13]研究发现，黄芪注射液使大鼠组织神经细胞的Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增强，抑制脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。李氏等[14]研究表明，黄芪总苷和黄芪甲苷对氢化可地松诱导老前期大鼠衰老具有延缓作用。本研究结果表明，黄芪甲苷具有明显的促进NSCs增殖作用。今后将继续对黄芪甲苷对大鼠胚胎NSCs增殖作用机制进行深入探讨和研究，为开发具有神经保护作用的药物提供依据。
参考文献：
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[12] Reynolds BA， Welss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of themammalian central nervous system[J]. Science，1992，255（5052）：1707-1710.
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胚胎干细胞篇7
一、 热点题型分析
热点题型1 对比体内、外受精及其早期胚胎发育过程，解答胚胎工程原理题
例1 下列有关哺***动物和卵细胞的发生以及受精作用的叙述中，正确的是（ ）
A. 采集到的和卵细胞相遇即可发生受精作用
B. 排卵就是排出成熟卵细胞的过程
C. 卵细胞形成时的***过程均在卵巢内完成
D. 受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间观察到两个极体
解析 本题考查、卵细胞的形成及体外受精的知识。熟记、***及受精过程是正确解答该题的关键。采集到的必须经获能处理后才能受精，采集的卵细胞若是通过冲卵取出的，则不需要培养直接就可与获能的受精，若从卵巢取出的卵细胞则需要培养成熟后才可以与获能的受精；排卵排出的可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞，而不是成熟的卵细胞；哺***动物卵细胞形成的场所，未排卵之前是在卵巢进行的，排卵之后减数***的继续完成则是在输卵管中。
答案 D
例2 下***表示蛙的受精卵发育至囊胚过程中，DNA总量、每个细胞体积、所有细胞体积之和、有机物总量的变化趋势（横坐标为发育时间）。其中正确的是（ ）
A. ①② B. ①③
C. ②④ D. ③④
解析 本题考查的是动物早期胚胎发育过程中物质及细胞结构变化情况。熟悉胚胎的早期发育过程是正确解答该题的关键。受精卵发育成囊胚的过程中，需要通过细胞的有丝***，使细胞数目增多。该过程中每个细胞DNA含量不变；所有细胞中总DNA量为2N・2N，呈指数函数形式增长；囊胚的总体积不变，但由于细胞数目增多，故每个细胞的体积减小。细胞有丝***过程需要消耗能量，能量由细胞呼吸过程中有机物氧化分解产生，故有机物总量在减少。
答案 A
例3 请回答下列与哺***动物和***发生有关的问题：
（1） 精细胞经变形后，高尔基体发育形成的顶体，顶体内含有的_______能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。
（2） 某动物排卵时，减数第一次***尚未完成，此时***处于_________卵母细胞阶段。当该细胞发育至减数第二次***______期时，才具备受精能力。若在卵黄膜和透明带之间看到两个极体，则表明_________过程已完成。
（3） 动物的早期胚胎移植到同种且____
________与供体相同的动物体内，使之继续发育为新个体的技术叫做胚胎移植。为了获得更多的早期胚胎，常用______________激素对供体进行处理，其目的是获得更多的___
___________，经人工授精后可得到早期胚胎。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是活细胞膜_______________。
（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体，可对发育到桑椹胚或囊胚阶段的早期胚胎进行______________处理，再植入到受体内。若要对早期胚胎进行长期保存，应将其置于______________条件下。
解析 本题考查受精作用过程。熟记具体受精过程是正确解答该题的关键。（1） 顶体内含有的顶体酶能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。（2） 动物排卵时处于减数第一次***的细胞称为初级卵母细胞，减数第二次***中期的细胞才具备受精能力，受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间看到两个极体。（3） 胚胎移植时受体的生理状态要和供体一致，才能保证胚胎成活。为了获得更多的早期胚胎，常用促性腺激素对供体进行处理，其目的是获得更多的卵母细胞。细胞膜具有选择透过性，活胚胎细胞不能被染色，原因是细胞膜对染料的吸收具有选择性。死细胞会被染色，因为细胞膜失去选择透过性。（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体的常用方法是胚胎分割，要注意胚胎一定要分割均匀。生物学中常采用液氮冷冻的方法保存早期胚胎和生殖细胞。
答案 （1） 顶体酶
（2） 初级 中 受精
（3） 生理状态 促性腺 卵母细胞 对物质的吸收具有选择透过性
（4） 胚胎分割 冷冻（或液氮）
题型攻略
【知识储备】和***的发生过程的几个重点问题分析：
（1） 哺***动物***的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的，这是和***在发生上的重要区别，但不是唯一的区别，如发生场所、过程及结果也不相同。
（2） 的发生中两次减数***是连续的，是在的曲细精管内进行的。***的发生中两次减数***是不连续的，减数第一次***在卵巢内完成，产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，在与的结合过程中完成减数第二次***，产生一个成熟的***和第二极体。当原核融合时，第一极体完成***，形成2个第二极体。有的哺***动物的第一极体不再***。
（3） 不同种动物的形态相似，大小略有不同，但与动物的体型大小无关。
（4） 哺***动物卵巢、***和***的关系。
卵巢是***形成、***存在的场所，内部包含许许多多不同发育阶段的***，而成熟的***中可释放出***，其中***的外面有辅助结构――透明带，由卵丘细胞（***细胞）形成放射冠，而***外面的胞膜即卵黄膜。排卵指***从***中排出，而非***从卵巢中排出。
【易错指导】
（1） 对卵裂阶段，细胞的物质含量和体积大小的变化模糊不清：
① 误认为卵裂阶段的细胞***方式包括减数***，实际上在该过程中只进行有丝***。
② 误认为卵裂阶段细胞中有机物、DNA的含量要增多，细胞体积要增大。受卵膜制约，从受精卵到囊胚阶段总体积不变或略有减小，所以每个细胞体积减少；伴随细胞***，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中DNA含量保持相对稳定；该过程中有机物总量减少，因为一直通过呼吸消耗，但不能从外界吸收。
（2） 不能对胚胎发育与胚胎工程中的有关概念进行正确的区分
① 对、***的发生、发育和结合场所不熟；发生场所――曲细精管；***的发生场所――卵巢和输卵管；受精场所――输卵管；发育场所――输卵管和子宫；发生时间及特点――初情期后，两次***连续进行；***发生时间及特点――胚胎性别分化以后，两次***不连续。
② 不能正确区分受精的标志和受精完成的标志。看到两个极体是受精的标志，雌雄原核膜融合是受精完成的标志。
③ 对囊胚和桑椹胚在胚胎发育过程中所处的阶段、特点和在胚胎工程中的应用没有完全掌握；胚胎发育过程中开始分化的阶段是囊胚，可以移植或分割的阶段为桑椹胚和囊胚。
④ 忽略“透明带反应”和“卵黄膜的封闭作用”在受精过程中的生物学意义；两者构成了防止多精入卵的两道屏障。
⑤ 体外受精易忽视“获能”和“***成热”问题。
热点题型2 关注胚胎工程的应用趋势，解答胚胎工程应用题
例4 胚胎干细胞研究在医学上有重大应用价值。通过移植胚胎干细胞期望可以***的疾病是（ ）
①糖尿病 ②血友病 ③唐氏综合征（21三体综合征） ④老年痴呆症 ⑤白化病
⑥肝衰竭 ⑦镰刀型细胞贫血症
A. ①②⑤⑦ B. ②③④⑥
C. ①②④⑥⑦ D. ②③④⑤
解析 本题考查胚胎干细胞的应用。理解胚胎干细胞的特点、弄清题目所给疾病的病因是正确解答该题的关键。糖尿病、老年痴呆症和肝衰竭分别是胰岛B细胞、神经细胞和肝细胞受损或衰老引起的疾病，有望通过移植胚胎干细胞的方法加以***。血友病和镰刀型细胞贫血症虽然是由于遗传物质改变引起的疾病，其致病基因只在血细胞中表达，只影响血液的功能，有望通过移植造血干细胞的方法加以***。唐氏综合征（21三体综合征）和白化病也是遗传物质改变引起的疾病，但影响范围大，不能用移植胚胎干细胞方法进行***。
答案 C
例5 自然情况下，牛的生育率很低，通过现代科技手段，可以实现良种牛的快速繁殖。请按照提示，回答下列问题：
（1） 使一头良种雄性黄牛，在一年内繁殖数百头后代，最简便的方法是__________。
（2） 现有一头良种雌性黄牛，采用胚胎移植的方法，可使这头良种牛一年生下数十头自己的后代。其操作过程中需要用激素对该良种母牛（供体）和代孕母牛（受体）进行__
________处理；还要用激素使供体母牛_____
_____。胚胎收集的过程也叫做__________。用于移植的胚胎应发育到__________或____
______阶段。
（3） 采用试管动物技术还可以使普通雌性黄牛产下奶牛、良种肉牛等不同品种小牛。该技术中首先要做的是体外受精和_______。体外受精主要包括__________、__________和__________等几个主要步骤。
解析 本题要求运用胚胎工程的技术手段，快速繁殖良种牛。熟记胚胎工程的技术手段是正确解答该题的关键。（1） 通过人工授精的方法，可以在短时间内大量繁殖优良品种。（2） 胚胎移植进行前，首先要对供体母牛和代孕母牛进行同期处理，同时还要用激素处理供体母牛使其超数排卵；人工收集发育到桑椹胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。（3） 试管动物技术包括体外受精和胚胎早期培养，体外受精又包括的采集和获能、卵母细胞的采集和受精三个阶段。
答案 （1） 人工授精
（2） 同期 超数排卵 冲卵 桑椹胚 囊胚
（3） 早期胚胎的培养 卵母细胞的采集
的采集和获能（的获取） 受精
例6 克隆羊的成功不仅奠定了疾病克隆性***的基础，又解决了器官移植中供体不足的问题，同时也给人类带来了一些过去尚未遇到的问题。下***为人类对克隆羊技术的拓展***和应用。请据***回答问题。
（1） ***中所涉及的现代生物技术有____
____________________等。（至少写三个）
（2） （多选）下列有关胚胎移植的叙述中，正确的有（ ）
A. 冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出***
B. 只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C. 供体和受体要进行免***检查，防止发生免***排斥反应
D. 不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四细胞阶段进行
（3） ***中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人基本相同，这说明_____
_______具有全能性。
（4） 使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入___________等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的__________和__________；早期胚胎发育在__________阶段以前的细胞是全能细胞。
（5） ***中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用_________处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行__________和__________。
（6） 在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官？__________为什么？____________
_________________。
解析 本题考查胚胎工程的应用及胚胎干细胞的培养与应用，熟记核移植、胚胎移植、胚胎分割等相关过程和胚胎干细胞等相关概念是正确解答该题的关键。
（1） 获得重组细胞，主要采用核移植技术。重组细胞到早期胚胎，涉及到细胞培养。胚胎进入代孕母体，则采用胚胎移植。早期胚胎分为胚胎1和2，通过胚胎分割。
（2） 大量研究表明，受体对移植入子宫的外来胚胎基本上不发生免***排排斥，这是能够进行胚胎移植的生理基础之一。
（3） 2个婴儿的遗传物质主要来自供核的亲本，将来与供核的亲本外貌很相似。
（4） 由于人们对细胞所需营养物质还没有全搞清楚，因此在在使用合成培养基时，通常加入血清、血浆等天然成分。桑椹胚细胞还没有出现分化，因此认为是全能性细胞。
（5） 胰蛋白酶能使细胞分散开来。
（6） 通过胚胎干细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官。但胚胎干细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。
答案 （1） 核移植、胚胎移植、细胞培养
（2） ABD
（3） 动物体细胞核
（4） 血清 温度 pH 桑椹胚
（5） 胰蛋白酶 细胞*** 细胞分化
（6） 不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
题型攻略
【知识储备】 试题出现的与“胚胎工程”高频知识点总结：
（1） 胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能直接移植受精卵。
（2） 移植胚胎来源及生殖方式：核移植后进行早期胚胎培养（无性生殖）；体外受精后进行早期胚胎培养（有性生殖）；体内受精冲卵胚胎移植（有性生殖）。
（3） 促性腺激素两次处理：①同期处理；②超数排卵。
（4） 两次检查：①收集胚胎检查；②移植后是否妊娠检查。
（5） 对囊胚进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【易错指导】
（1） 误认为胚胎移植过程中的冲卵冲出的是***；应该是早期胚胎，而不是冲出***。体外受精过程中的冲卵冲出的是***。
（2） 误认为高等哺***动物的***就是成熟的、已经完成减数***的卵细胞；实际上能和结合的***的主要部分是处于减数第二次***中期的次级卵母细胞，在与的结合过程中完成减数第二次***。
（3） 因为胚胎干细胞的***能力强、分化程度低，误认为胚胎干细胞的体积也较大；实际上胚胎干细胞的特征是体积小、核大、核仁明显。
巩固训练
1. 下列关于哺***动物胚胎发育和胚胎工程的叙述中，正确的是（ ）
A. 胚胎干细胞具有发育全能性，它可发育成新个体
B. 滋养层细胞发育成胎膜和胎盘是在囊胚期
C. 诱导胚胎干细胞分化的培养基中不需要加入饲养层细胞
D. 胚胎工程的操作对象是受精卵，而不是生殖细胞
2. “试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育成早期胚胎，再将胚胎移入女性子宫内发育成胎儿。它不仅使一部分不能生育的男女重新获得了生育的机会，也为人类的优生开辟了新的途径。“试管婴儿”所涉及的技术和原理不包括（ ）
A. 克隆技术 B. 细胞膜融合
C. 细胞培养 D. 胚胎移植
3. 在试管牛的生产过程中，不是必需的操作是（ ）
A. 卵母细胞的采集和培养
B. 受精卵中导入抗病毒基因
C. 的采集和获能
D. 胚胎的早期培养和移植
4. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是
（ ）
A. 表皮细胞是高度分化的细胞
B. 类胚胎干细胞能够分化成多种细胞
C. 表皮细胞和类胚胎干细胞具有相同的基因组
D. 表皮细胞在形成过程中丢失了某些基因
5. 哺***动物的下列四种生理活动发生的顺序是（ ）
①透明带反应 ②透明带破裂
③顶体反应 ④卵黄膜封闭
A. ①②③④ B. ③①④②
C. ④③②① D. ①③②④
6. 高等哺***动物受精后不久，受精卵开始进行细胞***。经桑椹胚、囊胚、原肠胚和组织器官的分化，最后发育成一个完整的幼体，完成胚胎发育的全过程，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 右***是胚胎发育过程中囊胚期示意***，①、②、③依次称之为透明带、滋养层、内细胞团
B. 高等哺***动物胚胎发育经历的时期是受精卵卵裂期桑椹胚囊胚期原肠胚期幼体，其中最关键的时期是原肠胚期
C. 高等哺***动物胚胎发育中的细胞分化开始于囊胚期，终止于生命结束
D. 进行胚胎分割时，应选择原肠胚期的胚胎进行
7. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是
（ ）
A. 类胚胎干细胞与人体表皮细胞相比，功能有差异，形态、结构也有差异
B. 类胚胎干细胞和表皮细胞中的DNA、mRNA和蛋白质都完全相同
C. 表皮细胞在形成过程中基本上没有丢失基因
D. 人体表皮细胞的质核比（细胞质/细胞核的比值）比类胚胎干细胞的大
8. 为了加快优良种牛的繁殖速度，科学家采用了以下两种方法：
请根据***示信息回答：
（1） 试管牛和克隆牛的培育过程中均用到的工程技术有________、________等。
（2） 用来促进B牛多排卵的激素可能是________分泌的促性腺激素。对D牛要进行________处理。此外受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生________反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；判断***是否受精的标志是________。在受精的过程中，首先发生________反应释放出有关的酶直接溶解卵丘细胞之间的物质。防止多精入卵的生理反应有________。E牛的性别是________。为了确保得到所需性别的试管牛，往往需要对移植前的胚胎进行性别鉴定，请举出两种对早期胚胎进行性别鉴定的方法（只需写出名称或简要原理）____________。
（3） 产生F牛的理论依据是________，其生殖方式属于________。请再举一例克隆牛的培育技术________。
（4） 要培育高产奶率的转基因牛，如建立的生产生长素的生物反应器，即：科学家将________重组在一起，通过_________等方法，导入牛的__________中，转基因牛***细胞中含有较多的参与分泌物加工的________等细胞器。
9. 请回答下列有关细胞工程和胚胎工程的问题：一对健康夫妇生下一男婴，1岁时脑出血死亡，2年后女方怀孕6个月时，经羊水及脐带血诊断为男孩且患血友病，遂引产。于是夫妇俩到广州中山医附属一院做试管婴儿。医生培养7个活体胚胎，抽取每个胚胎1~2个细胞检查后，选两个胚胎移植，最后一个移植成功，出生了一健康女婴，她是我国第三代试管婴儿。请回答：
（1） 试管婴儿技术作为现代生物技术和母亲正常怀孕生产的过程的相同之处是____
________，不同点在于____________。
（2） 医生抽取活体胚胎的1或2个细胞后，可通过观察____________判断早期胚胎的性别，你认为医生应选用______性胚胎进行移植，应用现代生物技术，现在人们已能够选取最理想的胚胎，其基因型应该是_______
_____。自然状态下，出现这样的胚胎的概率是____________。该实例体现了现代科学技术应用于社会和人类生活的重要意义。
（3） 供体器官的短缺和排斥反应是制约器官移植的两个重要问题。而***性克隆能最终解决这两个问题。下***是***性克隆的过程***解：
Ⅰ. 请在上***中横线上填上适当的术语：①____________；②____________。
Ⅱ. 上***中的③④表示的生理过程是__
__________。
10. 胚胎移植的基本程序如下***，据***回答下列问题：
（1） 对供体母牛、受体母牛进行的①处理是_________。处理的方法是_________。
（2） 在哺***动物的受精过程中，有哪些机制可以防止多个入卵受精__________
_________________________________。
（3） 在输卵管内，次级卵母细胞的减数第二次***是在___________________过程中完成的。判断***是否受精的重要标志是____________________________。
（4） 冲卵之后要进行质量检查，这时的胚胎应发育到____________阶段。
（5） 哺***动物排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体_____
_____________是相同的，这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。供体胚胎移入受体后可与受体子宫建立___________，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中_____________________。
（6） ②处理是_____________。
（7） 在胚胎工程中通过任何一项技术，如________________________等技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。
参考答案
1. C 2. A 3. B 4. D
5. B 6. D 7. B
8. （1） 动物细胞培养 胚胎移植
（2） 垂体 同期 免***排斥 在透明带和卵黄膜间有两极体 顶体 透明带反应和卵黄膜封闭作用 雌性或雄性 DNA分子杂交技术（利用基因探针鉴定），分析胚胎细胞的染色体组型
（3） 动物细胞核的全能性 无性生殖
胚胎分割
（4） 生长激素基因与***蛋白基因的启动子等调控组件 显微注射法 受精卵 内质网、高尔基体、线粒体
9. （1） 双亲生殖细胞都融合为合子 试管婴儿是体外受精，胚胎移植的产物 （2） 性染色体形态 女 XBXB 1/4 （3） Ⅰ. ①细胞核 ②内细胞团细胞 Ⅱ. 细胞分化
10. （1） 同期 用促性腺激素处理
（2） 透明带反应、卵黄膜封闭作用
（3） 和卵细胞结合 在卵黄膜和透明带的间隙里可以观察到两个极体
（4） 桑椹胚或囊胚
（5） 生殖器官的生理变化 正常的生理和组织联系 不受任何影响
胚胎干细胞篇8
外源性基因导入受体动物有不同的方法，同时，由于有不同的受体动物，因此要根据实际情况采用不同的方法对动物进行转基因。大致而言，动物转基因的方法有：逆转录病毒法、显微注射法、胚胎干细胞介导法、载体法和体细胞核移植法（体细胞克隆介导法）等。
通过逆转录病毒转移基因
研究人员早就发现，逆转录病毒常常能侵入宿主细胞并整合于细胞中的DNA，因此逆转录病毒被用来当成载体以进行外源性基因的转移。一般做法是，把外源性基因插入到逆转录病毒，再由逆转录病毒感染受体动物的胚胎。此后将感染的桑椹期胚胎导入动物子宫，就可发育成携带外源性基因的子代动物。
具体的原理是，逆转录病毒的核酸在逆转录酶作用下会反转录为双链DNA，然后整合到受体细胞核基因组中。由于逆转录病毒DNA的长末端重复序列（LTR）区域具有转录启动子活性，如果把外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，加入到动物早期胚胎的培养液中，或与胚胎共同培养，或注入囊胚腔中，携带外源性基因的逆转录病毒DNA就可以整合到宿主染色体上，达到外源性基因转移到受体动物胚胎的目的。
2001年，美国哥伦比亚大学的帕克等人利用逆转录病毒将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转入猪的成纤维细胞和耳上皮细胞，然后用这些细胞的细胞核进行核移植，获得了能发出绿色荧光的转基因猪。与此同时，其他研究人员利用这种方法培育出转基因猴。
但是，逆转录病毒作为载体具有潜在的致癌性，而且载体的构建较为复杂，容纳外源性基因的大小也有限，因此这项技术的应用受到一定限制。
显微注射法转移基因
动物转基因的显微注射法又称受精卵原核显微注射法，是用直径约0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受体动物的受精卵的细胞内，将外源性基因注入细胞中，然后通过受体动物基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等，使外源性基因嵌入受体动物的染色体内，最后这样的胚胎移植到代孕母体子宫内并发育成子代个体。
1980年美国的戈登等人首先用显微注射法创造了转基因小鼠。他们把小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的细胞中，然后将受精卵输入代孕母鼠的子宫内，最终发育成转基因小鼠。此后研究人员相继把人的珠蛋白基因和胰岛素基因转入小鼠体内。
显微注射法的优点是，动物的任何外源性基因都可转入受体动物体内，而且用这种方法已经获得转基因小鼠、鱼、大鼠、兔子以及转基因牛、羊、猪等。但是，这种方法转移外源性基因到受体动物的染色体时是随机整合的，因而难以控制其整合率。另外对外源性基因能否稳定整合于受体基因组的检测必须等到子代个体出生后才能进行和确认，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。
胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞（ES）是从哺***动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期研究人员就开始利用胚胎干细胞进行动物转基因。方法是，将外源性基因直接导入胚胎干细胞，经体外培养筛选后再注入到受体胚胎，与其中的胚胎细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。
此后，这种胚胎可发育成嵌合体的转基因动物，这种动物体内有一部分组织来源于整合有外源性基因的供体胚胎干细胞。在嵌合过程中，从胚胎干细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将转入的外源性基因传递到子代。
研究证明，胚胎干细胞介导法可使受体动物细胞中外源性基因整合率达50%，其中生殖细胞中外源性基因整合率可达30%。但是，建立胚胎干细胞系比较困难，现在只建立了小动物的胚胎干细胞系，猪、羊、牛等大型动物的胚胎干细胞系尚未建立。
载体法
早在1971年，研究人员就发现，外源性基因可以进入动物。后来，研究人员将反复冷冻或经化学物质处理后与外源性基因共同孵育，使外源性基因与结合，通过人工授精获得转基因个体。
1989年，意大利研究人员拉维特拉诺将小鼠附睾与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起在37℃下孵育30分钟，再用这种对成熟***进行体外授精，这样得到胚胎移植入受体鼠的子宫孕育，通过受体鼠孕育产出250只小鼠，以CAT基因为标记进行检测，发现有30%的小鼠成为转基因鼠。
目前研究人员通过载体法已获得了12种转基因动物，如转基因牛、猪、家兔和小鼠等。但是，这种方法进行动物转基因的成功率不高，效果也不稳定，还有待进一步研究和发展。其中，必须弄清楚和外源性基因结合的分子机制，外源性基因在和受精卵内的复制机理，以及促进结合外源性基因的方法和途径。
体细胞核移植法
体细胞核移植法又称体细胞克隆介导法，原理是，将外源性基因导入动物体细胞染色体中，然后通过显微操作技术将转入了外源性基因的细胞核移植到去核的卵母细胞中构成一个重建***，然后用人工方法让这个***发育，形成胚胎，再把胚胎移植到受体动物中，经妊娠、分娩后获得转基因克隆动物。
利用体细胞核移植法是目前动物转基因中的高级技术，1997年世界上第一个转基因绵羊（克隆羊）多利就是用这种方法产生的，是英国PPL公司与罗斯林研究所率先应用体细胞核移植法获得的成果。
多利诞生的过程和原理可以详细解释体细胞核移植法进行的动物转基因。
研究人员先从一只6岁的芬兰多塞特雌性白面绵羊（简称A）的***中取出***细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止***，这个细胞称为供体细胞。此后，研究人员从一头苏格兰黑面雌性绵羊（简称B）的卵巢中取出未受精的***，并将细胞核去除，使这个***成为一个无细胞核的卵细胞，也称为受体细胞。
然后，研究人员利用电脉冲方法让供体细胞和受体细胞融合，在这个过程中A细胞的细胞核融入B细胞中并像受精卵一样产生细胞***、分化，从而形成胚胎。最后将这个胚胎移植到另一只苏格兰黑面雌性绵羊（简称C）的子宫内，胚胎正常发育，足月孕育后绵羊C娩出小绵羊多利。
胚胎干细胞篇9
关键词：异种核移植；人：山羊；卵母细胞
中***分类号：Q813；R329
文献标识码：A
文章编号：1007―7847(2006)01―0050―05
***性克隆(Therapeutic ccloning)是指以患者 的体细胞作为供核，移入去核的卵母细胞内，将重 构胚培育至囊胚，从内细胞团中分离出胚胎干细 胞，为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细 胞或器官，用于患者疾病的***。目前，***性 克隆存在的问题主要有：核移植总体效率很低、卵 母细胞来源及质量不稳定、供核细胞种类的选择、 操作水平、体外培养条件等。由于人类卵母细胞来 源非常有限，且受到法律、伦理等多种因素的限 制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研 究，异种核移植技术的出现为解决这一难题提供 了可能，目前已建立了使用兔卵母细胞的异种体 细胞核移植胚胎干细胞，但胚胎发育率较低。本 研究旨在对山羊成熟卵母细胞能否支持人体细胞 核的重编程，并使重组胚获得一定程度的发育进 行初步探索，以便为将来利用动物卵母细胞来获 取***性克隆所需的胚胎干细胞奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 胚胎组织
胎龄5-9周人工终止妊娠的废弃胚胎，要求 胚体完整，无严重污染，废弃胚胎由第四 ***医大学唐都医院妇产科提供．使用前征得患者 同意，签署知情同意书，并获得学校医学伦理委员 会的批准。
1．1．2 山羊卵巢
采集于陕西省西安市屠宰场．采集的卵巢置 于20-30℃含0.32g／L硫酸庆大霉素的生理盐 水中，6~8 h运回实验室。
1．1.3 主要试剂
DMEM培养液、M199培养液、SOF培养液、胎 牛血清(FBS)购自GIBCO公司；二甲基亚砜 (DMSO)、离子霉素(10nomycin)、6－二甲氨基嘌呤 (6-DMAP)、Hoechst33342、细胞松弛素B(CCB)、 透明质酸酶、胰蛋白酶、EDTA、聚乙烯吡咯酮 (PVP)、矿物油购自Sigma公司；磷酸缓冲液 (PBS)自配。
1．1，4 仪器设备
细胞培养箱(Heraus，西德)、实体显微镜 (Olympus)、显微操作仪(Nikon)，
1.2 方法
1，2，l 山羊卵母细胞的体外成熟
将卵巢系膜剪去，用温生理盐水冲洗后置于 含10mg／L肝素的PBS液中，用切剖法采集卵斤 卵母细胞复合体(cumlllus-oocyte complexes， COCs)，在实体显微镜下检查回收，将收集的 COCs在PBS中清洗3次，再H―M199 (M199+10％FBS+10 mg／L FSH+20 mg／LLH) 洗1次后置于H―M199中进行体外成熟培养，培 养条件为38．5 t、5％CO2、饱和湿度．
1.2.2 成熟山羊卵母细胞的去核
体外成熟培养18～20 h后，将COCs置于 0．2％透明质酸酶中消化，轻轻吹打，使卵母细胞 周围的卵丘细胞脱落，选择排出第一极体的卵母 细胞在H―M199中清洗3次，置于含5 mg／L CCB 和10％FBS的PBS微滴中，38．5℃、5％C02、饱 和湿度孵育10 rain，在显微操作仪下用持卵针固 定卵母细胞，使第一极体在镜下位于2点至4点钟 的位置，用外径为20～30μm的去核针吸取第一 极体及其周围1／4--1／3的细胞质进行去核。去核 后的卵母细胞用1 mg／L Hoechst33342染色15 rain，然后在荧光显微镜上检查去核情况，挑选出 完全去核的卵母细胞作为核移植受体，见***1。
1.2.3 人胚胎成纤维细胞的分离培养
用含青链霉素的PBS浸洗胎儿3―5次，实 体显微镜下去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部 组织以PBS冲洗充分除去红细胞后剪碎至I mm3 大小，0．25％胰蛋白酶-0．04％EDTA混合消化 液室温下作用3-5 min，加入等量DMEM+10％ (v／v)FBS培养液终止消化，800~--t 000r／min离 心3-~5 min，弃上清液，加入前述培养液悬浮细 胞，调整细胞密度在105～106／mL，置于37℃、 5％CO2、饱和湿度培养箱中培养30min，等部分 成纤维细胞首先贴壁后，将培养液与未贴壁细胞 一同吸出，加入培养液继续培养。约2～3 d后， 胚胎成纤维细胞约80％铺满瓶底，可进行传代培 养，或冷冻保存备用，见***2。
1．2．4 供体细胞的准备
取第5―7代对数生长期人胚胎成纤维细胞， 在DMEM+0，5％(v／v)FBS培养液中血清饥饿培 养3～5d。核移植前2h用0．25％胰蛋白酶消 化，制备成单细胞悬液，待用。
1．2．5 重组胚的构建
将供体细胞悬于含10％PVP和5mg／LCCB 的PBS操作微滴中，在显微操作仪下用内径为 12～15μm的注射针反复吸吐供体细胞，使其细 胞膜破裂成为核胞体，再用注射针将核胞体直接 注射到去核卵母细胞的细胞质内。
1．2．6 重组胚的激活及体外培养
将注核后的重组胚在H-M199培养液中培养 3―6h后进行激活。用含5μmol／LIonomycin的 培养液处理4min，然后在含2 mmol／L 6-DMAP 和5mg／LCCB的培养液中作用4h，用培养液洗 3次后转移到SOFaa培养液(SOF+2％必需氨 基酸+l％非必需氨基酸+1 mmol／L谷氨酰胺+ 8g／LBSA)微滴中，与颗粒细胞单层在38．5℃、 5％C02、饱和湿度下进行共培养，每48h换液1 次。第72h加10％(v／v)FBS继续培养，每天 观察，记录胚胎发育情况，见***3。
2 结果
实验结果证明，山羊成熟卵母细胞可以支持 人体细胞核完成重编程，人-山羊异种体细胞核 移植重组胚可在体外完成其早期发育，2-细胞胚 胎的发育率可达51．33％，但发育至桑椹胚阶段 的胚胎数目大大减少，桑椹胚发育率仅为 9，73％，且目前尚未能获得囊胚发育，见表1，
3 讨论
目前，核移植胚胎干(nucleartransferredem― bryonicstem，ntES)细胞的建系效率还很低，理论上 一个ntES细胞系平均需要666个卵母细胞[5)．如果 使用人卵母细胞进行***性克隆，用于人类疾病的 ***，这样的代价是非常大的。解决这一问题的关 键是用新的策略获得卵母细胞。多数研究证实，某 些哺***动物(如牛、羊、兔)的卵母细胞具有接受异 种体细胞核的能力，异种体细胞核在这些动物的卵 母细胞中可以发生去分化和重编程。由于羊的 卵母细胞容易获得，而且西北农林大学在体细胞克 隆羊研究方面积累了丰富的研究经验和方法， 因此，我们首次探索用山羊卵母细胞来支持人体 细胞核的发育。
在本实验中，我们首次将人胚胎成纤维细胞 核移入山羊卵母细胞，2-细胞胚胎的发育率可达 51．33％，但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减 少，桑椹胚发育率仅为9．73％。低胚胎发育率是 哺***动物异种核移植胚胎发育存在的一个共同问 题，由于影响核移植胚胎发育的因素很多，包括供 核细胞类型、卵母细胞去核的方法、体外培养条件 等，大量的实验证明，以胚胎干细胞和胎儿 成纤维细胞作为核供体比成年体细胞作为核供体 所得异种重组胚的发育率要高。我们在进行人― 山羊异种重组胚的发育实验中选用人胚胎成纤维 细胞作为供体核，也基于此考虑。
核质相容性是影响异种核移植胚胎发育的另 一重要因素。当体细胞核移入去核卵母细胞后， 首先在母源性RNA和蛋白质因子的控制下进行 去分化和重编程，只有在母源性RNA和蛋白质消 耗完之前，细胞核能够正确启动某些基因的转录， 并合成相应的蛋白质和酶，胚胎的发育才能进行 下去，否则，发育将停滞。这一过程被称为“母胚 转换”(maternfil to embryonic transition，MET)。能 否正确地进行MET是影响异种重组胚发育的重 要因素，而顺利进行MET取决于异种核质间的亲 和性或排斥性。与山羊同种核移植的囊胚发育率 (17％―20％)相比较，本研究人―山羊异种重 组胚的桑椹胚发育率仅为9．73％，且尚未能获得 异种核移植囊胚，不能排除人―山羊异种间核质 存在排斥性。
此外，选择合适的体外培养体系亦是影响重 组胚发育的关键因素。本实验采用的SOFaa培养 基为山羊胚胎体外培养的常用培养基，可以支持 山羊卵胞质的发育，但可能对人―山羊异种核移 植胚胎发育产生不利影响。本实验中囊胚发育率 低与体外培养体系也可能有一定关系。
胚胎干细胞篇10
此前，为了研究未经批准的干细胞系，研究人员不得不建立***的、私人融资性质的实验室，然后还要经过一系列繁琐的会计程序，以确保联邦拨款的每一分钱都不会用在干细胞研究中。但这样的情况不会再继续下去了。取消禁令“将给这一领域和其他领域的研究人员大开方便之门。”旧金山加利福尼亚大学的干细胞研究人员阿诺德 克里格斯汀作如上表示。
乔治・Q・戴利博士在波士顿儿童医院研究儿童血液病，他说，他利用私人资金进行研究，已获得15条人类干细胞株，如今他首次可以向美国国立卫生研究院(NIH)申请拨款来研究这些干细胞。
奥巴马总统支持胚胎干细胞研究的时机正与世界干细胞研究取得重大进展的背景不谋而合，日本生物学家山中伸弥在2007年发现，成体细胞能够重新编程回到胚胎状态，其容易程度令人惊讶。这项技术“有可能最终使得胚胎干细胞用于***和诊断的技术变得相形见绌。”干细胞用于***的前景虽然还很遥远，但如果能用病人自己的身体细胞进行***，可避免免***排斥问题。
美国一些国会议员和其他一些倡导与疾病作斗争人士一直看好人类胚胎干细胞研究，认为它是快速治愈一些顽固性疾病的可靠途径。
但在私下里，许多研究人员的胚胎干细胞研究目标定得还是比较实际，他们主要的兴趣在于从一些特定疾病的患者那里获得胚胎干细胞系，通过跟踪观察这些细胞在试管内的生长情况了解疾病如何发展的基本知识。
尽管美国杰龙生物医药公司利用人体胚胎干细胞医治脊髓损伤病人的试验已在今年1月获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，许多科学家还是认为，把干细胞衍生的组织移植到患者体内还有很长的路要走。胚胎干细胞有其自身缺陷，它们易产生肿瘤，从干细胞中分离出来的成体细胞有可能会受到患者自身免***系统的排斥。此外，无论是什么样的疾病过程造成了病人组织细胞的死亡，也同样有可能杀死外来移植的细胞。所有这些问题也许都有可能得到解决，但至今为止还没有一个得到解决。
克林顿总统曾过允许NI H给研究员提供资金研究人体胚胎干细胞的设想，但一直没实行这项***策，直到2001年8月才开始有了这方面的研究，当时的美国总统布什寻求以一种不同的方式同避国会对干细胞研究的限制，规定研究人员可以使用在此之前获得的干细胞系进行研究。
奥巴马将克林顿当年提议的***策付诸实行，但美旧国会的限制依然存在。研究人员仍然禁止使用联邦资金来获得新的人类胚胎干细胞系。不过，他们将被允许对私人投资实验室里培养出来的新的干细胞系进行研究。