学文网细胞自噬篇1
细胞内损伤物质的积累是所有衰老细胞的普遍特征，能导致生命有机体生存能力降低。细胞自噬能够降解受损蛋白质和衰老或损伤细胞器等细胞结构，是细胞内主要的异化途径，参与衰老以及与衰老相关的各种病理过程。近年来研究发现，衰老进程中，细胞自噬活动下调，而对各种长寿突变体的研究表明自噬活动是寿命延长所必需的，多种自噬相关基因或蛋白直接受长寿途径的调节〔1～5〕，这些发现都支持细胞自噬是各种真核生物衰老非常重要的调节机制。
1 衰老进程中自噬活动下调
近年来的研究发现，与年龄相关的细胞自噬活动下降能影响细胞功能，引起各种衰老表现。在哺***动物衰老过程中巨自噬和分子伴侣介导的自噬活动(CMA)下降〔6，7〕，CMA的效率降低，将受损蛋白结合在溶酶体膜上及转运进入溶酶体的活动明显减弱。CMA是通过以热休克蛋白70(HSP70)为主的分子伴侣，特异性的识别结合被降解的蛋白，然后在溶酶体膜上的受体LAMP2A(Lamp2A)作用下，转运到溶酶体内进行降解的过程。研究发现衰老过程中CMA效率的降低是由于溶酶体膜上的受体LAMP2A表达随着衰老进程进行性地减少造成的。进一步的研究表明〔7〕，在转基因鼠中阻止衰老引起的LAMP2A的表达减少，即使在老龄的细胞中，CMA依然保持活跃的功能，尤其重要的是，CMA功能的维持与减低细胞内有害蛋白的积累和改善肝功能密切相关。除了CMA，衰老过程中哺***动物组织细胞的巨自噬活动可能也受到抑制，大量的研究表明，衰老能够影响巨自噬活动，尤其是影响巨自噬对功能缺陷的线粒体的降解〔3，8〕。对线虫的研究发现两种自噬基因沉默的野生型线虫和DAF2突变体的寿命会缩短〔9〕。另外，对其他真核生物，如酵母、果蝇等的研究也观察到了自噬对衰老的调节作用〔10〕。对拟南芥研究发现，剔除自噬相关基因(Atg)Atg7、Atg4和Atg9，植物能正常生长，但是却加速叶片衰老，增强对病原菌和碳饥饿的超敏反应〔11〕。
2 自噬活动增强具有抗衰老作用
细胞自噬通过保证细胞蛋白质组稳定和细胞器更新能阻止或者减缓细胞衰老进程。有研究认为抗脂药物的抗衰老作用可能是基于细胞自噬活动的增强〔12〕。用雷帕霉素或者海藻糖处理增强自噬的降解作用，可能对帕金森综合征等蛋白沉积性疾病模型具有***作用〔13〕。最近研究表明，一种p62蛋白在通过自噬摄取泛素化蛋白聚合物的过程中具有关键作用，p62能与聚泛素化蛋白结合形成聚合物，也能与自噬效应蛋白LC3 （LC3）相互作用，介导自噬对蛋白聚合物的摄取。p62缺乏能引起小鼠肝细胞和神经元细胞蛋白聚合物的沉积〔14〕。
线虫是细胞衰老和长寿研究常用的模式生物之一〔5〕。研究发现，线虫DAF2功能缺失突变能够诱导成虫表现出滞育样的代谢变化，明显延长线虫的寿命。而线虫与哺***类Beclin1基因同源的自噬基因bec1是线虫DAF2功能缺失突变体耐受态形成和寿命延长所必需的，显然线虫耐受态的形成和寿命的延长与自噬率的增加有关〔15〕。***虫或者哺***动物，限制热量都是延长寿命的研究中常用的实验手段。限制饮食的过程中能诱导自噬的发生，抑制自噬对进食充足线虫的寿命没有影响，而影响限制饮食线虫的寿命，自噬对饮食限制的反应受到转录调节。同时还发现，寿命延长除了需要诱导自噬发生，还需一种转录因子DAF16/FoxO的表达，研究者认为自噬为细胞提供新的物质来源，而转录因子DAF16/FoxO负责将这些原材料转化为保护性的蛋白以延长线虫的寿命〔16〕。
另外有研究认为自噬激活的水平对线虫寿命的调节具有重要的作用，在生理水平下，能够促进生存，而低于或者超过生理水平都引起线虫的死亡〔17〕。对线虫的研究还发现，在DAF2突变体中自噬的增加能够增强对β淀粉样蛋白的降解，以对抗衰老过程线虫细胞淀粉样物质积累引起的蛋白毒性〔18〕。
3 长寿途径与自噬的调节
随着在细胞水平上自噬对衰老调节作用的认识，人们开始进一步在分子水平上探讨调节自噬和衰老的信号通路之间是否存在联系。近年来，对于调节自噬降解活动的信号通路有了一定的认识，尤其是mTOR信号通路和Beclin 1的调节作用。而且研究发现调节抗逆境和抗衰老进程的长寿途径，如FoxO3，NFκB，p53 和 SIRT1等对自噬活动也具有有力的调节作用。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，连接胰岛素、生长因子等上游信号对Atg1复合物等下游效应物的作用，是自噬的负调控因子〔19〕。NFκB信号系统是细胞对抗细胞损伤和环境伤害的防御机制诱导的重要信号通路，研究发现，NFκB信号通路通过激活mTOR激酶而抑制肿瘤坏死因TNFα诱导的自噬，或者通过下调Beclin 1和Atg5的表达抑制巨自噬活动。NFκB信号通路与自噬之间存在交叉对话，激活NFκB的上游激酶IKKβ和NIK都是自噬作用的靶蛋白〔20，21〕。
SIRT1是哺***动物的一种沉默因子，是酵母Sir2蛋白的同源物，Sir2蛋白是公认的酵母抗逆和长寿因子，转录因子FoxO家族是调节细胞代谢、增殖和抗逆的重要因素，线虫FoxOs就是调节耐受态形成和寿命极限的主要因素〔15〕。最近的研究发现STRT1和FoxO3相关的信号通路参与对哺***动物自噬的调节。研究表明，在体外培养的细胞或者转基因鼠体内，SIRT1能够激活自噬作用，SIRT1/转基因鼠的一些表型和Atg5/小鼠相似。研究还发现，SIRT1与自噬蛋白Atg5，Atg7 和Atg8的去乙酰化有关，表明长寿基因sir2和自噬降解过程的相关性。最近有研究发现，FoxO3能够诱导LC3和Bnip3等激活自噬活动的蛋白表达，而促进细胞降解作用，维持生物体的能量代谢〔22〕。
机体细胞脱离衰老过程可能会发生癌变，p53是一种抑癌基因，它的失活能引起肿瘤发生。p53对自噬作用跟细胞状态有关，有研究发现，p53能抑制mTOR信号通路诱导自噬发生〔23〕，相反另一研究发现，p53表达下调能够激活细胞的自噬活动〔24〕。对携带p53活性片段的转基因鼠的研究发现，可能是由于细胞自噬的抑制和细胞凋亡诱导而表现出早老症状，而携带完整的p53及其等位基因和Arf的转基因鼠，能够激活p53的表达，使p53表达适度增加，但是却表现出衰老延迟。由此推测可能p53Arf信号通路诱导p53在特定位置表达的适度增加能够抑制mTOR，激活自噬，而p53的过量表达或者乙酰化增加活性增强，却抑制自噬，表现出早老的症状〔25〕。
4 结论与展望
近年来人们开始关注自噬对生物体的生理和病理影响，同时，对于衰老过程的分子调节机制也有了进一步的认识。自噬对于衰老进程以及衰老相关的疾病都具有调节作用，适度激活自噬能够延缓衰老，而且调节自噬和衰老的信号通路之间存在交叉重叠。对于二者相关性的研究有助于延缓衰老，并为蛋白沉积性疾病的***提供了新的***方向。虽然，对于自噬和衰老的相关性有了一定的认识，但是怎样在衰老细胞中诱导适度的自噬活动延迟衰老进程、氧化应激在衰老进程中是否对自噬具有抑制作用、SIRT1是否通过自噬作用延长寿命以及增强自噬活动的药物是否对蛋白沉积性疾病具有疗效等很多问题仍有待于进一步的研究。
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细胞自噬篇2
自噬是一种高度保守的生理代谢途径，双层膜囊泡将其内容物运送到溶酶体进行降解。因此，自噬是哺***动物细胞清除胞内病毒等病原体的一种手段。然而，在病毒感染过程中自噬的角色比较复杂，一些病毒已进化出逃逸自噬依赖性降解的方法，甚至利用自噬为自己的复制而服务。本文主要综述了自噬的基本机制和功能、自噬在病毒感染中的角色以及自噬在人类免***缺陷病毒和T细胞白血病病毒1型等反转录病毒感染过程中的作用。
关键词:
自噬;病毒感染;反转录病毒
细胞自噬是存在于真核细胞的一种生命现象，是细胞体内的自我平衡过程和自我保护机制，并且是与细胞凋亡、坏死并存的一种程序性死亡机制。研究发现，自噬有3种途径:大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬［1-2］。本文主要探讨大自噬在病毒感染(尤其是反转录病毒感染)过程中的作用及其可能机制。
1细胞自噬在机体内的机制及作用
自噬以具有双层膜囊泡结构的自噬小体形成以及随后的损坏或过多的细胞组分的溶酶体依赖途径降解为特征，在维持内稳态方面起重要作用［3-4］。自噬起始于一段***的膜(一般来自于内质网)，自噬小体的形成依赖于自噬相关蛋白(autophagy-relatedgene，ATG)家族［5］。至今已在酵母中发现约40种ATG，并且在哺***动物中发现多种同源物［6］。但是，仅有约50%的家族成员在经典的自噬小体形成中是必要的，包括ATG1、ATG2、ATG3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8、ATG9、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16、ATG17、ATG18、ATG29和ATG31［7］。在经典的自噬信号通路中，有2种类似泛素的结合系统:ATG12结合系统和ATG8脂化系统。ATG12和ATG8均由同一个E1泛素酶类似物ATG7所激活［8］。在ATG12结合系统中，ATG7帮助ATG12结合到ATG5，形成ATG12-ATG5复合物［9］。而在ATG8脂化系统中，激活的I型ATG8转移到ATG3，并最终结合到磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethano-lamine，PE)［10］。ATG8-PE复合物一般称为II型ATG8，是目前自噬方面最被认可的标志物。另外1个比较被认可的自噬标志物是自噬受体p62，其降解可反映自噬溶酶体的活性［11］。自噬在机体内有重要的生理功能。首先，自噬可抵抗代谢压力，在营养物质被剥夺、生长因子缺乏、缺氧等情况下，自噬可被激活而作为一种适应性催化途径存在。自噬体大量降解释放出自由的、可供机体重新使用的氨基酸和脂肪酸分子［12］。其次，自噬可以清除缺陷的蛋白和细胞器，阻止异常蛋白集聚，清除胞内病原体。这些功能使得自噬可以介导机体对衰老、肿瘤、神经退行性疾病及感染的抵抗。虽然这些功能在某些方面与泛素化-蛋白酶体系统重叠，但自噬有其独到之处，其可以降解整个细胞器，比如线粒体、过氧化物酶体以及内质网等［13］。再次，自噬可以限制DNA损伤和染色体不稳定性，但其具体机制尚不完全清楚［14］。另外，自噬也可认为是一种非凋亡的细胞程序性死亡过程［15］。
2细胞自噬与病毒感染
自噬可以清除入侵的病原体，该过程称为异体吞噬，事实上，对于多种病毒感染，自噬可将其在体内的滴度维持在较低的水平［16］。有研究显示，辛德比斯病毒引发的脑炎可被自噬减弱［17］。辛德比斯病毒的衣壳蛋白通过p62招募到自噬小体上，针对辛德比斯病毒的衣壳限制性进行全基因组筛选，鉴别出线粒体的Parkin依赖性降解途径的多个成员，提示病毒和线粒体通过自噬降解存在明显的相似性［18］。该项研究鉴别出泛素连接酶Smurf1是辛德比斯病毒和线粒体自噬性清除中的一个重要组分。Smurf1泛素化辛德比斯病毒的衣壳蛋白并通过自噬降解。这种p62介导的自噬性降解同样发生在切昆贡亚热病毒［19］。但是，自噬对切昆贡亚热病毒的限制只发生在小鼠细胞上。在人类细胞中，切昆贡亚热病毒通过NDP52与ATG8结合，将其复制系统定位在反面高尔基网状结构上，因此，对自噬的抑制反而减弱切昆贡亚热病毒的复制［20］。与切昆贡亚热病毒相似，其他病毒也进化出对抗自噬的策略。疱疹病毒经常携带Bcl-2同源物，可以阻止Beclin-1进行自噬的诱导［21-22］。而A型流感病毒则可以阻止溶酶体和自噬小体的融合［23］。因此，自噬可以抑制一些病毒在细胞内的复制，但是，一些病毒已经进化出针对自噬的逃逸机制。
3自噬与人类免***缺陷病毒1型感染
HIV-1是获得性免***缺陷综合征的病原体，全球HIV病毒感染超过3000万人，每年约300万HIV病毒感染者死亡［24-25］。HIV-1病毒可以感染CD4+T细胞和巨噬细胞，并可在细胞中复制［26-27］。HIV-1病毒进入细胞后，其复制受到自噬降解和宿主细胞限制因子的挑战，如APOBEC3GT-2/tether-in、TRIM5α、SAMHD1和microRNA［28］。然而，HIV-1已进化出多种手段来逃避这些防御机制，从而克服细胞限制。例如，HIV-1病毒通过辅助蛋白Vif来促进降解或排除APOBEC3G掺入病毒粒子;Vpu蛋白可以对抗BST-2/tetherin的影响;Tat蛋白可以调节细胞内miRNA的活性。关于自噬，HIV-1显然逃避了这一细胞防御过程，并使其利于病毒复制。在巨噬细胞中，病毒辅助蛋白Nef通过与Beclin-1结合来抑制自噬的成熟，从而阻止对病毒的破坏［29］。巴弗洛霉素A1是自噬小体与溶酶体融合的抑制剂，用巴弗洛霉素A1处理细胞可增加HIV-1的产生。此外，免***相关的鸟苷三磷酸酶家族M可以与ATG5和ATG10相互作用，Nef也可通过它促进自噬体的积累和HIV-1的产生［30］。研究发现，Nef缺失的HIV-1无法克服自噬性降解，因而复制效率较低［31］。总体而言，目前的研究显示，细胞自噬的早期步骤有助于HIV-1的复制。与此相一致的是，HIV-1Gag蛋白与ATG8丰富的自噬小体共定位;用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理Hela细胞，或用siR-NA沉默Beclin-1或ATG7可显著降低HIV-1的产生，而自噬诱导剂西罗莫司可增加病毒的产生［31］。研究还发现，维生素D可以通过启动和促进自噬的成熟而抑制HIV-1复制，通过巴弗洛霉素A1处理或沉默Beclin-1和ATG5可以降低维生素D的抑制作用［32］，这些结果表明，增加自噬小体与溶酶体融合可能是有效的抗HIV-1***策略。HIV-1感染的人急性T淋巴母细胞白血病细胞MOLT-4及CD4+T细胞对自噬有抑制作用，ATG8或Beclin-1蛋白表达水平降低［33］;这表明在T细胞中，自噬过程对HIV-1复制可能是负性调控［34］。然而，有研究显示，HIV-1感染CD4+T细胞可以诱导自噬，表现为Beclin-1和ATG8蛋白表达水平升高［35］。此外，ATG1、ATG4D、ATG5-ATG12复合物水平在HIV-1或HIV-2感染后升高，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和Beclin-1的siR-NA可以抑制JurkatT细胞中的HIV-1复制［35］。另外，自噬相关基因ATG5和ATG16的稳定沉默也可以抑制人T淋巴细胞系SupT1细胞中HIV-1的产生［36］。这些结果表明，自噬的活化在T细胞中对HIV-1是正性调控。事实上，在T细胞中HIV-1与自噬的关系仍未完全清楚，尚需进一步研究。
4自噬与人类T细胞白血病病毒1型感染
HTLV-1是被发现的第1个与人类疾病相关的反转录病毒，其感染所引发的成人T细胞白血病(a-dultT-cellleukemia，ATL)和强直性下肢轻瘫目前还无有效的***手段［36］。据2005年不完全统计，全世界HTLV-1病毒携带者有1000万至2000万人［37］。目前有研究表明，HTLV-1感染可增加自噬小体的积累，并且这种积累可以促进HTLV-1的复制［38］。HTLV-1的Tax蛋白可以阻止自噬小体与溶酶体融合，减少自噬小体被溶酶体降解，从而增加自噬小体的积累;而胞内自噬小体与溶酶体融合抑制剂巴弗洛霉素A1可增加Tax蛋白的稳定性，提示胞内部分Tax蛋白降解通过自噬完成［38］。T细胞受体信号会导致核因子-κB激酶抑制剂(inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinase，IKK)和磷脂酰肌醇3激酶C1(phosphatidylinositol3-kinaseC1，PI3KC1)的激活并诱导自噬的发生，这对T细胞增殖非常重要，与之相似，Tax蛋白也可激活IKK和PI3KC1［39-40］。HTLV-1转化的T细胞表达Tax蛋白，同时伴有高水平的自噬发生，而无Tax表达的ATL细胞中显示极低水平的自噬发生。Tax蛋白可与自噬信号中的重要分子Beclin-1、PI3KC3及Bax蛋白相互作用因子1(Bax-interactingfactor1，Bif1)相互作用，并将自噬分子隔离到脂筏上，该过程依赖于IKK复合体。在HTLV-1转化的T细胞中，敲掉Bec-lin-1会导致自噬降低及细胞存活率降低。这些结果表明，Tax蛋白将IKK复合物和自噬信号通路偶联起来，促进HTLV-1转化的T细胞的生存和增殖［41］。
5小结
细胞自噬篇3
[关键词] 肝癌细胞HepG2；SN50；自噬；NF-κB；微管相关蛋白LC3
[中***分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）07（a）-0035-03
Effect of NF-κB on autophagy formation of human hepatoma cell
HAO Gaopeng WANG Shiming DONG Xiushan REN Ning FAN Yue LU Yudong
Department of General Surgery, the Affiliated First Clinical Medical School of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To research the effect of NF-κB on autophagy formation of Human Hepatoma Cell HepG2. Methods The human hepatoma cell HepG2 was cultured in vitro and divided into SN50 group and control group, MTT assay was used to test the cell growth dynamically. Western blot analysis was performed to assess the expression of LC3-Ⅱ. The autophagy was observed using fluorescent microscope by monodansylcadaverin (MDC) staining. Results The inhibition ratio of HepG2 cells were (20.45±3.70)%, (31.94±4.20)% and (36.44±4.60)% after treatment of SN50 for 24, 48 and 72 h, the difference was statistically significant than before (P < 0.05). The expression of LC3-II had upregulation and fluorescent staining revealed the activity of autophagy. Conclusion Blocking of NF-κB can significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells in a certain period of time, and the effect may associated with increased cell autophagy.
[Key words] Human hepatoma cells HepG2; SN50; Autophagy; NF-κB; Microtubule-associated protein LC3
迄今的研究显示NF-κB在多种原发肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用[1]。NF-κB通过调节多种基因的转录从而影响肿瘤细胞的增值、凋亡以及肿瘤的发生等过程；而SN50作为NF-κB的特异性抑制剂[2]，已被广泛用于该通路的研究以及以NF-κB为靶点的疾病***[3]。笔者基于已有的知识和研究成果，研究肝癌细胞的自噬活性以及通过使用SN50初步探讨了NF-κB信号通路对肝癌细胞自噬活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HepG2细胞由山西医科大学寄生虫实验室提供，高糖DMEM培养基购自Neuronbc公司，胎牛血清为北京元亨金马生物技术开发有限公司产品，胰蛋白酶和MTT购自美国Solarbio公司，SN50购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自碧云天试剂公司，微管相关蛋白Ⅰ轻链子（LC3）一抗购自BOSTER公司。
1.2 细胞培养
将HepG2细胞置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，每3天传代1次，细胞贴壁达到70%时，以体积分数0.25%胰酶消化，使瓶底细胞都浸入溶液中，倒置镜下观察细胞，在贴壁的细胞逐渐变圆后，但是在尚未漂起时加入5 mL培养液终止消化，用吸管吹打贴壁细胞，然后分到另外的两个培养瓶中，加入新鲜培养基后置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养，取对数生长期细胞进行实验。
细胞自噬篇4
[关键词]人参皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一。迄今，白血病的***仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用甚大，复发率很高，尤其对机体免***与造血系统有极大的损害。因此，可以从传统的中药中寻找天然低毒的药物来***白血病。其中人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统中草药，在肿瘤的***方面具有很高的药用价值[1]。S型人参皂苷单体Rh2[（S）Rh2]是人参中天然活性成分之一，是一种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，其毒性低，相对分子质量小，脂溶性好，具有很强的抗肿瘤活性[2]。
目前大家认为，细胞死亡包括3种类型：即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡，其中，自噬是属于比较热门的Ⅱ型细胞程序性死亡方式[3]。细胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色。自噬在肿瘤细胞起到双刃剑作用，可以保护肿瘤细胞，也可以杀伤肿瘤细胞[4]。作者选取人红白血病K562细胞株作为研究对象，为了进一步弄清楚人参皂苷Rh2对白血病的药理作用，并从自噬途径研究人参皂苷Rh2促进人白血病细胞自噬凋亡机制，为Rh2应用于临床***白血病奠定实验和理论基础。
1材料
11K562细胞株人红白血病K562细胞株购自上海ATCC细胞库。每次取对数生长期的K562细胞以5×108个/L接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养，每2～3 d传代或换液。
12药品Rh2购自成都曼斯特科技有限公司（纯度98%），取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg・L-1原液，-20 ℃冷冻保存。实验前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释成所需浓度。
13试剂胎牛血清，RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；Annexin VPI双标凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制剂（美国Sigma公司）；MAPK通路抗体试剂盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）；Bcl2，Bax多克隆抗体（美国Epitomics公司）。
14仪器超净工作台（Sanyo）；倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus）；低温离心机（Sigma）；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪（BioRad）；二氧化碳培养箱（Thermo）。
2方法
21CCK8 法培养对数生长期的K562细胞，以1×104 个/孔接种于96孔板中。分为空白对照组、药物组和本底对照组，每组设6个复孔，每孔200 μL，（S）Rh2 20～100 μmol・L-1；本底对照组：只加RPMI 1640培养液。培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8检测液，轻轻摇匀，孵育25 h 后，用酶标仪（波长450 nm）检测每孔吸光度（A），并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。
22FCM检测早期凋亡培养对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度分别至5×108 个/L，接种于6孔细胞培养板中。实验分为4组：Ⅰ组为空白对照组，正常培养；Ⅱ组加入（S）Rh2 60 μmol・L-1；Ⅲ组加入5 mmol・L-1的自噬抑制剂3MA；Ⅳ组同时加入（S）Rh2 60 μmol・L-1和3MA 5 mmol・L-1。每孔3 mL培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养24，48 h后，分别收集各组细胞，用预冷001 mol・L-1PBS（pH 72）洗涤2次，4 ℃ 1 200 ×g离心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶（PI） 和Annexin V，置于冰上染色处理30 min，每组细胞2×104个，上流式细胞仪检测，重复实验3次。
23Hoechst染色取对数生长期的K562细胞调整细胞密度为5×108 个/L，接种于6孔培养板。实验分组：空白对照组含01% DMSO的RPMI 1640完全培养液；药物组60 μmol ・L-1的Rh2培养48 h后，收集空白对照组和药物组细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加甲醇乙醇（3∶1）固定液室温固定15 min；离心去除固定液加Hoechst染色液避光、室温染色30 min，PBS洗涤1次，调整细胞浓度，滴片，荧光显微镜下观察。
24吖啶橙染色K562细胞用人参皂苷（S）Rh2 60 μmol・L-1处理24 h后，收集细胞，新选配制的吖啶橙（2 μ・mL-1），37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，调整细胞浓度，取一滴细胞悬液滴到玻片上，待细胞沉积到玻片上时，吸去上层液体，封片置于荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置荧光显微镜下观察、采***，实验重复3次。
25Western blot取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度到5×108 个/L，接种到细胞培养瓶中。实验分组为对照组和药物组（S）Rh2（20，40，60 μmol・L-1），置培养箱中常规培养。提取蛋白并将各组蛋白浓度调成4 g・L-1，沸水中煮沸5 min，蛋白完全变性后，冷却，每个样品取10 μL加入泳道中，保证每孔中有40 μg待测蛋白样品，行SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别加入抗体MAPK信号通路抗体按1∶500稀释；Bcl2，Bax，Caspase3（激活型），LC3A和LC3B按1∶1 000稀释抗体，及Beclin1和βactin按1∶2 000稀释抗体，4 ℃孵育过夜；用TBST漂洗3次，每次10 min置于脱色摇床上；分别加入以1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脱色摇床上；最后在保鲜膜上滴入ECL化学发光液，在暗室进行X胶片曝光，洗片，胶片晾干后。扫描胶片，Quantity One软件定量分析，此实验重复3次。
26RTPCR参照试剂盒说明书进行，Trizol提取细胞总RNA。采用TAKARA反转录酶试剂盒逆转录cDNA。应用TAKARA的SYBRⅡ试剂，PCR反应体系为10 μL。检测自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，用目的基因与GAPDH 的起始拷贝数比值表示目的基因的相对表达量，实验重复3次。
3结果
31CCK8检测细胞增殖抑制能力药物组与对照组比较，人参皂苷（S）Rh2能有效抑制白血病K562细胞增殖，并呈浓度和时间依耐性且K562细胞48 h的IC50为60 μmol・L-1。因此，选择Rh2（60 μmol・L-1）作为实验研究最大浓度，见***1。
32流式细胞术测细胞凋亡Rh2 （60 μmol・L-1） 处理K562细胞24 h 后，FCM检测结果显示加药与对照组比较1）P
组细胞早期和晚期凋亡数量明显增多，其早期凋亡率分别为（1200±260）%，且随着浓度的增高，早期凋亡率增高，分别与对照组（318±052）%相比，差异有统计学意义（P
33Hoechst染色检测细胞凋亡Rh2（60 μmol・L-1）诱导K562细胞48 h后，用Hoechst染色显示，细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象，并且细胞发出蓝色荧光较对照组细胞强，见***2，说明Rh2能诱导K562细胞凋亡。
34MDC染色观察细胞自噬人参皂苷（S）Rh2（60 μmol・L-1）处理K562细胞24 h后，用MDC染色后，观察细胞内绿色荧光强度，见***3，经人参皂苷（S）Rh2诱导后，K562细胞中的酸性自噬小泡均明显增加，对照组绿色的自噬小泡基本看不见，说明人参皂苷（S）Rh2能够增强细胞自噬。
35吖啶橙染色观察细胞自噬人参皂苷（S）Rh2（60 μmol・L-1）处理K562细胞24 h后，用吖啶橙染色后，观察细胞内的自噬体，见***4，细胞内绿色代表酸性自噬小体，红色代表核仁，经人参皂苷（S）Rh2诱导后，K562细胞中的酸性自噬小泡均明显增加，对照组绿色的自噬小泡基本看不见。
36RTPCR检测自噬重要调控基因的表达与对照组比较，K562细胞经60 μmol・L-1的（S）Rh2作用24 h后，自噬相关基因（Atg3，Atg5，Atg7，Atg12）在2种细胞中变化不明显，而自噬重要调控基因Beclin1，LC3A，LC3B的表达却明显上调，差异有统计学意义（P
37Western blot检测自噬重要蛋白的表达与对照组比较，K562细胞经不同浓度的（S）Rh2作用后，Beclin1，LC3A，LC3B蛋白的表达水平明显增高，见***6。人参皂苷（S）Rh2能在分子水平上增加自噬重要的蛋白和基因的表达，进一步确定了（S）Rh2能诱导白血病K562细胞发生自噬。
38（S）Rh2通过自噬抑制细胞增殖作用CCK8检测细胞的增殖能力，发现单独用自噬抑制剂3MA能轻微降低细胞活力，但是无统计学意义；单独使用（S）Rh2能明显降低细胞活力，差异有统计学意义（P
39（S）Rh2通过自噬诱导细胞凋亡用流式细胞术检测细胞凋亡发现，细胞加入自噬抑制剂时，与对照组比较无明显改变；单独使用（S）Rh2时，细胞凋亡明显增加，差异有统计学意（P
310Western blot检测自噬对（S）Rh2诱导细胞凋亡作用的影响单独运用自噬抑制剂3MA后，细胞自噬关键蛋白LC3A/B有下降的趋势，单独运用（S）Rh2后，细胞自噬关键蛋白LC3A/B和激活型的Caspase3表达明显上升，当同时加入自噬抑制剂3MA和（S）Rh2后，细胞的自噬关键蛋白LC3A/B和激活型Caspase3的表达比单独运用（S）Rh2时明显下降，说明抑制自噬后细胞凋亡现象减少，自噬可促进人参皂苷（S）Rh2诱导K562的凋亡作用，见***7。
与对照组比较1）P
311Rh2通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡10，20，40，60 μmol・L-1Rh2 作用于K562细胞24 h后，Western blot结果显示，p38蛋白的表达几乎没变化，pp38的表达增加，提示Rh2可能通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡，见***8。
4讨论
目前，许多研究者认为自然界中有丰富抗肿瘤的天然药物，本课题组前期实验表明人参提取物人参总皂苷和单体能在体外抑制白血病和肝癌细胞增殖，阻滞周期，促进凋亡。其他国内外研究人员也研究证实，人参皂苷单体能抑制各种肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞发生凋亡[56]。因此采用CCK8法研究人参皂苷单体Rh2对白血病细胞K562增殖抑制作用，发现人参皂苷单体Rh2能有效抑制白血病细胞的增长。通过流式细胞术发现人参皂苷单体Rh2能促进细胞发生凋亡，Hoechst染色同样证明了Rh2能诱导细胞凋亡。Western blot检测发现Rh2能够
增加Bax/Bcl2的比例，同时激活Caspase3，说明了Rh2能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。
细胞自噬和凋亡密切相关，凋亡的早期，细胞出现应激反应，会出现自噬。为了探讨人参皂苷（S）Rh2对白血病细胞自噬的关系，运用了吖啶橙和MDC染色。发现加药组早期细胞出现酸性的自噬泡，PCR和Western blot结果显示自噬相关基因和蛋白分子（Beclin1，LC3A和LC3B）的表达均升高，证明了人参皂苷（S）Rh2能诱导白血病细胞发生自噬。 自噬异常与肿瘤的发生发展关系密切，可以从不同生物学行为影响肿瘤的进程，其中有细胞周期、增殖、凋亡、耐药、血管生成及肿瘤的***等方面的调控[7]。文献研究报道，自噬和细胞凋亡的关系存在两面性，维持细胞生存和促进细胞死亡[8]。前面的实验证明了人参皂苷Rh2既能诱导白血病K562细胞凋亡又能诱导其发生自噬，那么细胞自噬和凋亡关系是怎样的呢？实验表明，当同时加入自噬抑制剂3MA和Rh2时，与单独加入Rh2相比，K562的细胞凋亡减少和细胞活力增强。说明抑制细胞自噬，可削弱人参皂苷Rh2对白血病细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，提示人参皂苷Rh2可以通过诱导白血病细胞发生自噬，促进细胞凋亡。
目前，MAPK信号通路能调控自噬和细胞凋亡[9]。作者前期的研究已经证实人参皂苷Rh2诱导细胞自噬，3甲基腺嘌呤（3MA）通过抑制ClassⅢ PI3K 的活性抑制自噬，抑制细胞自噬可以削弱人参皂苷Rh2对K562的抑制增殖和促凋亡作用[10]。为了研究人参皂苷Rh2诱导细胞自噬凋亡的可能机制，作者运用了Western blot检测MAPK信号通路的关键的蛋白p38，发现人参皂苷Rh2分别能够激活p38，发生磷酸化激活。证明了参皂苷Rh2可能能通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡。
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细胞自噬篇5
【摘要】 目的 探讨自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧（OGD）过程中的表达及其意义。方法 将PC12 细胞分为正常对照组、缺糖缺氧1、4和12 h组。MTT法检测细胞存活率，Western印迹法检测各组PC12细胞中BECN1、Bcl2及Bax蛋白的表达水平。结果 与正常对照组相比，OGD 1及4 h组PC12细胞存活率下降（均P
【关键词】 自噬；凋亡；缺糖缺氧；PC12；BECN1；Bcl2；Bax
细胞缺糖缺氧(oxygenglucose deprivation，OGD)损伤是多种临床上常见的缺血性损伤(如脑缺血、心肌缺血)的病理基础。尤其是脑组织缺血时，由于其高能耗低能储的能量代谢特点，一旦组织缺血、缺氧，神经细胞首先出现能量代谢障碍，引发一系列的细胞结构和功能上的改变导致神经细胞的损伤甚至死亡。目前的研究表明，脑缺血缺氧损伤不但与坏死、凋亡有关，而且还与自噬有关，但自噬在其中的作用还存在争议〔1〕。在细胞培养液中同时去除氧气和葡萄糖，即OGD模型，是体外模拟脑缺血的经典模型。肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的OGD模型(体外缺血模型)不仅可以模拟整体水平脑缺血的许多病理生理特征，而且由于在体外可以人工严格控制实验条件，在实验过程中可随时观察细胞状态以及药物作用，因而，成为研究缺血性损伤、评价神经保护药物及研究药物机制的一种重要方法〔2〕。本研究利用连二亚硫酸钠(sodium dithionite)消除培养基中的氧同时培养基缺糖建立PC12细胞“缺血”模型，进一步探讨PC12细胞OGD损伤自噬、凋亡相关蛋白表达的分子机制，为临床***脑缺血疾病提供***靶点。
1 材料与方法
1.1 材料 连二亚硫酸钠购于国药集团化学试剂有限公司，DAB和MTT购自Sigma公司，抗βactin、BECN1、Bcl2及Bax抗体及相应二抗均购自Santa Cruz公司，BioRad Protein Assay购于BioRad公司，细胞蛋白裂解液购于Beyotime（碧云天生物技术研究所）。PC12细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，IMEM培养基购于Hyclone公司。
1.2 PC12 OGD模型的建立及实验分组 PC12细胞用含15%新生小牛血清(Gibco公司)的IMEM培养液，置CO2培养箱(37℃，5% CO2)培养，隔2～3 d传代1次，取对数生长期细胞分组进行实验。根据文献方法〔3〕稍加改进建立OGD模型。将正常IMDM培养液（含15%的新生小牛血清）培养的PC12细胞作为正常对照组；细胞用含2 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液培养的PC12细胞作为模型组，模型组分为缺糖缺氧1、4、12 h组。将培养板置于5% CO2、37℃培养箱中培养相应的时间后观察并测定相关指标。
1.3 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖率 将正常IMDM培养液（含15%的新生小牛血清）培养的PC12细胞用IMDM培养液洗细胞2 次，并稀释至3×105/ml，接种于96孔培养板上，每孔100 μl，作为正常对照组；细胞用含2 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液以同样方法洗涤并稀释至3×105/ml，接种在同一块96孔培养板上，每孔100 μl，作为模型组，模型组分为OGD 1、4、12 h组。实验重复3次，每组实验中相同条件设6个平行孔。细胞活性百分比=实验组OD均值/对照组OD均值×100%。
1.4 Western印迹法检测BECN1、Bcl2及Bax蛋白含量 用细胞蛋白裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，BioRad法测定蛋白含量。取蛋白30 μg作SDSPAGE电泳，将蛋白样本转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。转膜后，膜用5%脱脂奶粉封闭1～1.5 h，PBST洗3次，加入抗BECN1、Bcl2及Bax多克隆抗体，4℃过夜。分别加入过氧化物酶标记的相应的二抗，脱色摇床摇1 h，PBST洗3次，每次5 min。DAB显色，凝胶成像系统成像拍照分析。同时以βactin作为内参，实验重复3次。电泳条带密度值=灰度×面积/参照物值。
1.5 统计学处理 数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间ANOVA分析。
2 结果
2.1 不同时间OGD处理后对PC12细胞的影响 经过1、4、12 h OGD处理，以正常对照组MTT吸光度值为100%，以各模型组吸光度值占对照组的百分比表示存活率。结果显示，与正常对照组相比，OGD组1（70%）及4 h（75%） PC12细胞存活率下降（P
2.2 PC12 OGD模型BECN1蛋白的表达 Western印迹结果表明：与正常对照组（0.64）相比，PC12细胞OGD 1（0.68）及4 h组（0.69）蛋白BECN1明显升高（P
***1 各组PC12细胞BECN1蛋白表达的 MTT检测结果（略）
***2 各组PC12细胞Bcl2和Bax蛋白表达的Western印迹分析（略）
2.3 PC12 OGD模型Bcl2、Bax蛋白表达 Western印迹结果表明，与正常对照组（1.45）相比，PC12细胞OGD1（2.00）及4 h组（1.95）蛋白Bcl2与Bax比值明显升高（P
3 讨论
自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统，其能清除异常构型的蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，对维持细胞的自身稳态有重要意义。在饥饿和新生儿早期，自噬作用明显加强，自噬体显著增多〔4〕；而在新生鼠，如鼠缺失Atg5，自噬过程则不能启动，导致细胞内ATP浓度下降，死于能量缺乏〔5〕。说明在饥饿和新生儿早期，激活的自噬对维持细胞的生存是必需的。Beclinl基因也称BECN1基因，与酵母自噬基因Atg6同源，是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子，参与哺***动物自噬体形成的调控。Beclin1调控自噬的机制主要是与Ⅲ型PI3K形成复合物参与募集胞浆中含FYVE或PX基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成，并引导其他自噬蛋白定位于自噬体膜〔6〕。位点244337缺失的Beclin1不能与PI3K结合，无法促进饥饿诱导的自噬作用〔7〕，因此Beclin1是调控自噬的重要基因。
细胞凋亡是涉及多基因调控的复杂的主动性程序性死亡过程，其中Bcl2家族蛋白在细胞凋亡的调控过程中具有重要作用，Bcl2和Bax是凋亡调解基因Bcl2家族中两个重要成员。Bcl2和Bax通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl2形成异源二聚体时则实现了Bcl2抑制细胞凋亡的功能〔8〕。Bcl2和Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，而且还与Bcl2/Bax的比值有关，当比值增大时，细胞凋亡增多，反之细胞凋亡受抑制。
研究表明，自噬和凋亡存在密切的联系，一方面认为两者是相互促进的，如用甾类物质诱导的果蝇细胞发生进行性细胞死亡时，自噬基因和凋亡基因的表达同时上调〔9〕。一方面认为两者是相互拮抗的，当自噬被阻断时，细胞转向凋亡〔10〕，当凋亡被抑制时，细胞发生自噬性死亡〔11〕。用siRNA干扰Beclin1、Atg5、Atg10、Atg12时，饥饿诱导的细胞凋亡增强，这也说明在营养缺乏时自噬相关基因可能参与凋亡的抑制〔12〕。
本研究的MTT结果显示：缺糖缺氧12 h时，PC12细胞存活率下降更为明显，说明随着缺糖缺氧的延长，细胞损伤逐渐加重。Western印迹结果显示：PC12细胞缺糖缺氧的早期BECN1蛋白的表达明显升高，Bcl2与Bax比值亦明显升高，随着缺糖缺氧时间的延长，蛋白BECN1逐渐下降，蛋白Bcl2与BAX比值亦逐渐下降。说明PC12细胞缺糖缺氧能同时激活自噬和凋亡，在缺糖缺氧的早期，主要激活自噬，占主导地位的自噬作为一种保护性机制拮抗凋亡相关蛋白的表达，对细胞的存活起一定的保护作用，但随着缺糖缺氧时间的延长，凋亡逐渐占主导地位，自噬失去其拮抗凋亡作用，从而促进细胞死亡。因此，进一步阐述自噬与凋亡的相互作用或相互转换机制，为临床***脑缺血疾病提供***靶点具有重要意义。
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细胞自噬篇6
关键词：肿瘤，自噬，抗肿瘤药物
Abstract： Autophagy is the major intracellular degradation system by which cytoplasmic materials （denatured protein， damaged organelles） are delivered to and degraded in the lysosome to maintain homeostasis. Once carcinogenesis rising up， autophagy would be also employed by cancer cells. Autophagy plays an important role in cancer cells both in protecting against cancer as well as potentially contributing to the growth of cancer. However， autophagy can also contribute to cancer by promoting survival of tumor cells that have been starved. The relationship between autophagy and tumorigenesis need to be further researched， which will help humanity better understand and ultimately overcome the cancers.
Keywords： Tumor， Autophagy， Anti-tumor drug
1 细胞自噬的概念
1.1 自噬的基本概念
传统的细胞死亡方式分类包括细胞坏死和细胞凋亡2种，后者又称为程序性细胞死亡，而新近的研究发现，除坏死和凋亡之外还存在其他细胞死亡方式，例如自噬[1] 。
细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体（动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。细胞自噬最早由Ashford和Ponen于1962年用电子显微镜在人的肝细胞中观察到，是细胞中初级溶酶体处理内源性底物的重要过程，同时参与维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定，其在清除废物、结构重建以及细胞生长发育中起重要作用[2]。自噬存在于真核细胞的病理生理过程中，近年随着对自噬研究的不断深入，其在肿瘤中的作用日渐引起广泛关注。目前研究表明自噬功能异常在肿瘤发生、发展中均扮演重要角色[3] 。在生物进化中，细胞自噬是一种保守的过程，从酵母到植物细胞再到哺***动物，都存在这样的过程，并且其中的很多调节因子在多个生物种中都能找到其同源体[4]。
1.2 与自噬相关的重要细胞器――溶酶体
损坏的蛋白或细胞器在体内降解主要有泛素-蛋自酶体途径（UPS）和溶酶体途径（细胞自噬）。UPS和自噬在降解过程、机制、亚细胞定位、降解底物、系统活性等方面均有区别，细胞自噬是UPS受损时的代偿途径，细胞自噬可以在UPS抑制时激活；细胞自噬的长期抑制可导致UPS功能受损，但UPS不能代偿细胞自噬被抑制的功能[5] 。本文主要讨论溶酶体途径。
自噬是细胞对持续性内外刺激的非损伤性应答反应，以维持细胞结构、代谢和功能的平衡。根据底物进入溶酶体途径的不同，可将自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬等三类[9]。巨自噬和微自噬过程都产生自噬体，但是，巨自噬形成的自噬体较大。分子伴侣介导的自噬无自噬体形成[6] 。虽然广义上的自噬包括巨自噬（巨自噬又分为依赖Atg5和Atg7的传统途径及依赖Rab-9的非传统途径两种[7] ）、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种类型，通常所说的自噬即指巨自噬，也是目前研究最多的 [8] 。以巨自噬为例，细胞自噬相关基因主要是指一系列的Atg基因，包括在细胞自噬调节中与自噬小体形成相关的基因，影响溶酶体清除自噬小体的基因，细胞自噬调节所必需的基因，自噬小体隔离、运动、成熟相关的基因，以及调节细胞自噬和其他细胞活动的基因等[9]。
1.3 自噬发生的过程
自噬体发生过程可分为：自噬体的诱导，形成，运输及裂解。[10]其中自噬体的形成依赖于两个泛素样结合系统―Atg12 /Atg5和Atg7 /Atg8系统。[11]并可将自噬过程大致划分为四个主要阶段：a. 分隔膜的形成：在应激或饥饿状态下，内质网膜凹陷形成杯状的双层结构分隔膜，开始在待降解物周围包绕形成自噬体萌芽。b. 自噬体的形成：分隔膜继续延伸，将待降解物完全包绕并与细胞质隔离形成自噬体。c. 自噬体的运输与融合：自噬体形成以后，会将包裹物运输至溶酶体，再与溶酶体相融合形成自噬溶酶体。d. 自噬体的裂解：自噬溶酶体形成后，待降解物先经囊泡酸化，当pH达到所需值后最终被溶酶体中多种蛋自酶降解，其降解产生的小分子物质在细胞内可以被再循环利用。[12]
2.自噬的功能
2.1 自噬的基本功能
细胞白噬的生理功能主要包括四个方面：a. 白噬是细胞对代谢应激和环境变化的适应性反应。代谢应激是营养缺乏、缺氧、生长因子损耗等因素导致的，因能量供应不足而引起的应激反应，此时机体动员自身储备，增加能量和营养供应，同时一些细胞因供能不足或为保护机体可能发生坏死、凋亡等。自噬作用的降解产物氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可进人物质能量循环，满足应激条件下细胞和有机体代谢的需求。例如自噬可以在细胞处于缺血缺氧等饥饿状态时从分解产物中获得能量。大量研究表明增强的自噬促进了细胞在缺血缺氧等饥饿状态下的存活。[13]b. 自噬作为细胞保持稳态的管家机制，有处理废物的功能。它可去除丧失功能的细胞器、大分子以及细胞质内成分，防止异常蛋白质累积，并可去除细胞内病原体，由此对蛋白质和细胞器进行质量控制。这对于对抗衰老、癌变、神经退行性病变、感染等有重要的意义。c. 自噬可能通过处置受损的线粒体和过氧化物酶体而抑制活性氧簇（ROS）的产生，减少DNA损伤和染色体不稳定性，因此，可能具有细胞保护作用。d. 自噬作为程序性细胞死亡的一种，可在细胞无法继续维持自身生存时诱导细胞主动性死亡。[14]
自噬桥接了先天和适应性免***系统，自噬功能障碍与炎症，感染、神经退行性病变和癌症等均有关联。[2]
2.2 自噬与肿瘤
近期的研究发现，自噬作用在肿瘤的形成中起着重要作用[15]。 正常生理情况下，细胞自噬利于细胞保持自稳状态；在发生应激时，细胞自噬通过：a. 限制染色体不稳定性，从而减少致癌突变的积累；b. 限制氧化应激；3.减少瘤内坏死及炎症等途径来达到防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器物质积累的目的[16]，从而抑制细胞癌变（最近报道的自噬和衰老之间的联系提供了一个额外的自噬的肿瘤抑制作用的基础[17]）。自噬介导的肿瘤抑制功能可以清除受损的已氧化细胞器，从而防止因积累有毒的氧自由基而导致的基因组不稳定。[18]然而，肿瘤一旦形成，细胞自噬为癌细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长，尤其在当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。同时，自噬为线粒体的分隔可防止促凋亡因子，如细胞色素和凋亡诱导因子的扩散。此外，自噬可以清除电离辐射时受损的大分子或细胞器（如线粒体），保护肿瘤细胞免受电离辐射的作用，从而逃避凋亡而存活下来。当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损的DNA赢得时间和条件。[19]因此，在肿瘤的发生发展过程中，细胞自噬的作用具有两面性，自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素；肿瘤一旦形成细胞自噬可促进肿瘤生长。[20]目前为止，由于我们仍无法根治肿瘤，许多挑战拭待解决。最重要的是，应该澄清自噬的双重角色，并且应该根据肿瘤的细胞类型，发展的不同阶段及肿瘤生存的不同微环境来决定我们采取的应对方式。[21]
3.自噬与肿瘤
3.1 自噬与肿瘤发生发展密切相关
据报道，鼠的肝癌发生与发展过程中伴随着自噬现象进行性减少，癌前病变期肝细胞自噬活动降低到正常细胞的50%，在肝癌细胞中自噬更是降到正常时的20%。在肿瘤晚期，实体瘤内部细胞营养缺乏情况下自噬很可能被激活，维持肿瘤细胞生存。根据自噬与肿瘤基因的关系可将肿瘤基因分为三类。第一类是自噬执行基因，表现为肿瘤抑制功能，Beclin1就是这类的典型。第二类是参与自噬调节的基因，通过促进细胞死亡来抑制肿瘤。第三类是癌基因和抑癌基因，它们在细胞自噬途径中协同作用、相互抵制，癌基因和抑癌基因的突变可能导致肿瘤发生。这一类基因包括mTOR，p53等。[22]
3.2 自噬的参与者
目前调节自噬的分子中起关键作用的是mTOR复合体和Beclinl复合体及p53基因。自噬是一个动态过程，包括一系列的步骤，这都是由Atg蛋白控制的。迄今为止，在酵母中已发现30多种Atg，而且很多都与哺***动物同源。
3.2.1 mTOR mTOR作为A tg蛋白上游调节分子被广泛研究。早期研究发现mTOR激酶抑制剂一一雷帕霉素可以诱导自噬的发生，作为生长因子、营养和能量的感受器，[23]它的激活与蛋白合成、细胞生长和自噬抑制有关，提示mTOR在自噬调控中发挥重要作用。[24]目前mTOR激酶复合体可根据对雷帕霉素的敏感性分为：对雷帕霉素敏感的mTORCl和不敏感的mTORC2。mTORC 1主要调节细胞生长、能量代谢和自噬，而mTORC2则主要参与细胞骨架的重组和细胞存活。[25]
3.2.2 Beclin1复合体 Beclin1复合体是由Bcl-2， Beclinl（ Beclinl基因也称BECN1和UVRAG和Vps34基因组成。1998年Liang等在致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠中发现一种相对分子质量为60 000的蛋白质，与bcl-2基因产物相互作用能抑制Sinbis病毒的复制，减少中枢神经系统的凋亡，并可能在宿主的抗病毒防御上起作用，他们将编码这种蛋白质的基因命名为Beclinl[26]）。Beclin1不依赖caspase的裂解酶通过Bec1-C片段压制激活自噬并促进细胞凋亡，Bcl-2/Bcl-XL通过特殊的交互抑制作用充当抗自噬和抗凋亡的双重角色。[27] 在研究酵母时发现：Beclinl复合体在自噬形成的早期阶段发挥重要作用，其主要通过两种方式来对自噬进行调控：（1）Bcl-2， UVRAG、死亡相关蛋白激酶DAPK（death-associated protein kinase，DAPK）和CDK分别发挥对该复合体的抑制与活化作用，从而达到对自噬的调节；（2） Vps34产生的PI3P可促进自噬相关蛋白Atg结合到膜上，形成前自噬结构，促进自噬。[28]
3.2.3 p53 p53对自噬的调控具有双向性。一方面，细胞核内的p53通过激活自噬相关基因的转录而诱导自噬；另一方面，胞质中的p53对自噬则起抑制作用，后者的具体作用尚待研究。[29]
4 自噬途径抗肿瘤药物概况
目前，针对自噬开发抗肿瘤药物正日益受到关注。通过对自噬机制的深入研究，可能会帮助人们发现新的肿瘤***潜在靶点。目前针对自噬主要有以下几种药物开发策略：a. mTOR激酶抑制剂；b. 酪氨酸激酶抑制剂；c. Bcl-2抑制剂；d. 肿瘤新生血管生成抑制剂；e. 雌激素受体拮抗剂；f. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；7＼g. 法尼基转移酶抑制剂[30]。其中最常见的为mTOR激酶抑制剂，自噬可以抵消化疗及放疗对肿瘤的抑制作用，因此，如果抑制自噬作用将会提高抗肿瘤药物的疗效，这类自噬抑制剂包括Lys05，3-MA（3-甲基腺嘌呤，是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断自噬中自噬体的形成，被广泛用作自噬的抑制剂。）， CQ （氯喹）和 BA（巴伐洛霉素A1）等。[31]其中Lys05是二聚体的氯喹，相比氢化氯喹，可以更多地沉积在溶酶体中来阻断自噬，在活体内外多种人类癌症细胞系中均能更有效地产生抗肿瘤作用。[32]
5 自噬抗肿瘤面对的问题
5.1 自噬与凋亡
目前研究发现，自噬与凋亡之间的关系大致为3种：a. 自噬为凋亡所需，b. 自噬抑制凋亡保护细胞，c. 自噬与凋亡共同促进细胞死亡[33]。凋亡和自噬是参与维持机体正常的生理平衡和内环境稳定重要机制，与正常生长发育以及肿瘤等多种疾病发展过程都有着密切的联系。对于肿瘤的***，传统的方法是诱导肿瘤细胞凋亡，然而，肿瘤细胞中凋亡抗性的出现成为肿瘤***的主要障碍。自噬作为另外一种细胞程序性死亡方式与凋亡一样有着复杂的分子机制和调控机制，它们之问存在密切的联系，并且存在许多相同的调节蛋白，因果关系尚需要深入解析。[34]
5.2 自噬与抗肿瘤药物的关系
自噬是一种生理机制，它在抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的过程中也会发生。抗肿瘤药物引起肿瘤细胞发生自噬与药物的种类、肿瘤细胞的类型、药物的浓度、药物作用细胞的时间等因素有关。由于自噬的特点，药物诱导肿瘤细胞产生自噬后会出现两种不同的结果：一种是保护细胞防止周围环境带来的损害；另一种是启动细胞主动性的II型细胞死亡程序，目前，对于这两种不同结果的产生还没有发现特定的规律[34 ]。抗肿瘤药物在引起肿瘤细胞产生自噬的同时可能还会导致凋亡。抗肿瘤药物与自噬的相关因素，以及自噬与凋亡之间的密切联系都有待于进一步研究。能够找到靶向于自噬分子机制的抗肿瘤药物对于肿瘤的分子***具有重要的意义。如何使抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞产生自噬，继而引起细胞死亡？如何来消除自噬对肿瘤细胞的保护作用？如果这些问题被解决，那么药物诱导肿瘤细胞的自噬对于肿瘤的***将能起到一个积极的作用[35] 。
6 发展与展望
自噬在肿瘤***中起的作用可成为一个新的手段，但是，由于癌症作为一个系统性疾病的复杂性，肿瘤细胞的命运不是由任何单一信号路径决定的，[36]大量的自噬互联通路在系统层面需要进一步澄清；另一方面，从***的角度看，掌握自噬是否有必要、时机及如何利用自噬用于对抗肿瘤细胞仍具有挑战性。[37]也因此自噬***肿瘤进入临床还需要进一步探索和努力。[38]
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细胞自噬篇7
细胞感染模型制作参照预实验结果，按感染复数（multiplicityofinfection，MOI）为50∶1（细菌∶细胞）将培养至对数生长期的ST6、ST6－ΔpRST98、ST6－c－pRST98加入细胞，100g离心10min，继续在5％CO2、37℃条件下共培养1h。弃上清液（此时定为0点），加入含100mg／L的AMK培养液作用2h，以杀死胞外菌，在0h和2h收集细胞进行检测。1．2．5自噬蛋白LC3和p62的检测分别在0h和2h收集细胞，用于检测自噬相关蛋白LC3和p62。用预冷的磷酸缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗1次，100g离心5min，小心吸除上清液。在细胞中加入裂解液，超声裂解细胞，4℃13200g离心20min，吸取上清液后用二羧基二喹啉酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。取60μg样品上样，进行10％十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfate－polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS－PAGE）（浓缩胶70V，30min；分离胶90V，70min），将蛋白转移至硝酸纤维素膜（300mA，70min），5％脱脂奶粉室温封闭1h；加入鼠抗β－actin（1∶3000稀释）、兔抗LC3（1∶1000稀释）和兔抗p62（1∶1000稀释），4℃孵育过夜。次日室温孵育1h，用含Tween20的Tris缓冲液（Trisbuff－eredsalineandTween20，TBST）洗3次，每次5min；加入鼠二抗（1∶3000稀释）、兔二抗（1∶3000稀释），室温孵育90min，TBST洗3次，每次5min；化学发光法显影，检测LC3和p62蛋白的表达。mRFP－GFP－LC3质粒转染后荧光显微镜观察自噬体和自噬溶酶体变化应用脂质体转染法将与单体红色／绿色荧光蛋白（monomericredfluo－rescentprotein－greenfluorescentprotein，mRFP－GFP）偶联的自噬蛋白LC3真核细胞表达载体mRFP－GFP－LC3质粒导入巨噬细胞。取对数生长期的THP－1细胞，接种于铺有小圆玻片的24孔板，2×105个／孔，PMA诱导分化成熟。转染时，细胞融合度为80％～90％。弃去孔内含10％胎牛血清的RPMI1640，用无血清RPMI1640洗2次，每孔加500μl无血清RPMI1640，37℃、5％CO2培养1h。用50μl无血清RPMI1640稀释0．8μg质粒DNA，轻轻吹吸3～5次混匀。用50μl无血清RPMI1640稀释2μlLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3～5次混匀，室温静置5min。混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3～5次混匀，室温静置30min。将转染复合物缓慢滴加至24孔板中，100μl／孔，前后轻摇细胞板混匀。1．3统计学处理用SPSS17．0进行统计学数据处理，多个实验组均数间两两比较采用LSD－t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
CQ阻断THP－1细胞自噬的浓度确定用WB和MTT法确定CQ工作浓度。p62作为自噬的底物蛋白，主要在自噬溶酶体中降解。CQ可通过破坏溶酶体中酸性水解酶的活性，使p62无法正常降解而累积。WB结果显示，30μmol／LCQ作用细胞6h后，p62已明显累积；40μmol／LCQ作用细胞6h后，累积程度达饱和（***1A、1B）。结合MTT法检测CQ对细胞活性的影响，30μmol／LCQ作用24h后，细胞存活率为58．58％；而40μmol／LCQ作用24h后，细胞存活率仅为46．03％（***1C）。细菌OD值测定结果表明，30μmol／LCQ对ST6、ST6－ΔpRST98和ST6－c－pRST98菌量无明显影响，因此将30μmol／L作为CQ的工作浓度。伤寒沙门菌质粒对THP－1自噬蛋白LC3Ⅱ与p62表达的影响WB结果显示，细菌与THP－1作用0h，CQ处理组LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值明显高于对照组，其中突变株ST6－ΔpRST98LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值的增加量均高于野生株ST6（***2A、2B、2D）。细菌与THP－1作用2h，CQ处理组LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值较对照组明显上升，但突变株ST6－ΔpRST98的上升量仍显著高于野生株ST6（***2A、2C、2E）。mRFP－GFP－LC3质粒转染后荧光显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的变化转染mRFP－GFP－LC3质粒的细胞，自噬体为红绿叠加后形成的黄色点状聚集物，因溶酶体的酸性环境会淬灭绿色荧光而对红色荧光无影响，使自噬溶酶体表现为红色点状聚集物。若自噬活性上升，可观察到黄色自噬体和红色自噬溶酶体的点状聚集物均增多；若自噬体与溶酶体的融合被阻断、自噬溶酶体的生成减少，仅表现为黄色自噬体点状聚集物增多。结果显示，0hCQ干预组突变株ST6－ΔpRST98感染细胞的点状聚集物数量高于对照组，而野生株ST6和回补株ST6－c－pRST98感染细胞的点状聚集物数量无差异。2hCQ干预组3株菌感染细胞的点状聚集物数量均高于对照组，其中突变株ST6－ΔpRST98上升量显著高于野生株ST6及回补株ST6－c－pRST98（***3）。
自噬是不同于凋亡的一种细胞死亡方式，自1962年提出后已成为当前研究热点。自噬主要是通过细胞内的双层膜结构包裹需降解的细胞器、蛋白质或外来异物形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在自噬体内利用溶酶体水解酶降解其所包裹的内容物，以实现细胞内的稳态和细胞器的更新［8］。在细胞自噬与感染性疾病关系的研究中，自噬被视为机体对抗病原体入侵的一种方式，不仅可通过自噬溶酶体途径清除细菌发挥天然免***应答效应，还参与病原菌的抗原呈递过程，对细胞的生存起至关重要的保护作用［9，10］。目前，在酵母和其他真核生物中已发现许多自噬相关基因（autophagy－relatedgene，ATG），其中微管相关蛋白1轻链3（microtubule－associatedprotein1lightchain3，MAP1－LC3）是酵母Atg8在哺***动物细胞中的同源物。在自噬过程中，LC3Ⅰ经类泛素化酶催化其C端并与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶联后转变为LC3Ⅱ［8］。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3Ⅱ即被溶酶体中的水解酶降解。LC3Ⅱ是目前发现的唯一定位于自噬体膜上的自噬相关蛋白，其含量多少与自噬泡数量成正比［11］。因此，WB检测细胞内LC3Ⅱ含量变化或激光共聚焦法检测细胞质内LC3点状结构，即可实现对自噬体形成的检测［12］。p62能结合泛素化的蛋白与LC3偶联，参与自噬体形成［13］。自噬发生时，随着蛋白质不断降解，p62水平逐渐降低；而在自噬缺陷细胞中，可观察到p62累积［14，15］。因此，p62也被作为检测自噬活性的一个标记蛋白，其表达水平与自噬活性呈负相关。CQ作为一种自噬阻断剂，通过提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶失活，导致自噬溶酶体无法分解底物［16］，造成位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3Ⅱ和p62不能及时降解，致使蛋白累积。
细胞自噬篇8
人类，生活在一个充满激烈生存竞争的环境里。在每个人周围，几乎都有成千上万个细菌和病毒在每时每刻的侵犯人体。人所以能够健康地生活，是因为自己有着一个完整的有力保卫系统，即免***系统。免***系统里配备着各种负责保卫工作的细胞，如淋巴细胞、浆细胞，巨噬细胞、肥大细胞；以及抗体和补体等大分子化合物。它们分工合作、密切配合，共同完成抵御人体最凶恶的敌人一细菌和病毒的免***任务。
疯狂的巨噬细胞 在免***保卫系统中，巨噬细胞是一员大将。第一个和他相识的人是1882年俄国的麦契尼柯夫。麦氏首先发现了他们对细菌的吞噬作用，表彰了他们保卫人体的功劳。巨噬细胞简直是免***系统里的巨灵神，他的直径比红血球要大4－7倍，表面长有许多小突起，在***1电子显微镜下拍到的照片里可以看到，他一次同时吞噬两只红血球根本不犯难。这位巨灵神分布于全身各处，比较集中的大本营则扎在肝、脾、淋巴结等内。他幼年时期的名字叫单核细胞，单核细胞已有吞噬能力但不很强。以后进入其它组织或器官发育长大而成巨噬细胞，具有了较多的溶酶体和较强的吞噬能力。以后，一旦发生细菌或病毒侵犯的信号，在淋巴细胞分泌物的通知下，他迅速再长大，吞噬消化能力更猛烈增强，被称为活化的巨噬细胞(***2)。活化的巨噬细胞与细菌、病毒搏斗的激烈、活跃场面，令目睹的科学家们大为震动，有些人因此而称这些巨灵神为“疯狂的巨噬细胞”，由此可见他的威力。
游走和吞噬 人体内绝大多数细胞是固定不动的，只有少数细胞如淋巴细胞和巨噬细胞能够活动。巨噬细胞凭借血管和淋巴管作为交通线，游出血管后还能以阿米巴运动的方式在器官和组织内的细胞间隙里游走。因此它们能集中到病菌侵入人体的部位，并主动向病菌接近和吞噬这些细菌。吞噬本是低等动物的一种进食和营养方式。目前原虫中的阿米巴和腔肠动物中的水螅还以吞噬的方式进食。我们高等动物则已采取胃肠道内消化，待食物消化后再通过肠上皮吸收营养的方式了。至于体内具有吞噬功能的细胞，其意义已不是进食和营养，而是为了消灭细胞和清除体内的废物。体内具有吞噬功能的细胞主要为嗜中性粒细胞和巨噬细胞。嗜中性粒细胞有些像快速部队，细胞较小，直径约比红血球略大，寿命短，约一天左右，每一细胞约能吞噬25个细菌。它们主要参与炎症反应，在脓及伤口分泌物内常含有它们的大量尸体，称为脓细胞。巨噬细胞则是主力***，细胞大，寿命长，还具有能***增生的能力。巨噬细胞不但能吞噬细胞和异物；还担负着清除体内各种废物的重要功能，如清除衰老的红血球和血小板，清除崩解或死亡的组织和细胞的碎片、抗体抗原复合物和失效的大分子结构等；它们在结缔组织的修复和更新中也有重要的作用。原来这些人体的卫士在体内同时还是勤勤恳恳的清洁工呢。
激烈的搏斗 健康人的体内环境总是维持恒定的。当细菌侵入以后，由细菌产生的代谢产物和毒素向四周扩散，破坏了某一局部原有的恒定状态。于是，位于附近的巨噬细胞以及毛细血管内的单核细胞就受到了刺激，它们依照这些刺激的方向集中，逐渐向瘸菌蔓延的区域靠拢，开始从四面八方围剿这些细菌。吞噬的开端是巨噬细胞膜和被吞噬的细胞之间发生接触和粘着。如果不能粘着即不能吞噬。粘着以后，巨噬细胞着于细菌附近的细胞质渐渐形成一套筒状的伪足，从四周包围细菌(***3)。最后，此一套筒在顶端汇合，形成一个有膜包绕的小囊称为吞噬体，细菌即被吞入巨噬细胞体内。整个过程约需1分钟。必须指出，吞噬过程的完成并不能肯定即巨噬细胞的胜利。有少数细菌，如结核杆菌和麻疯杆菌等，在人体对它尚未产生免***力之前，即使被巨噬细胞吞噬也不易将它们杀死，有时在巨噬细胞体内还能存活很长时间，甚至能进行增殖导致巨噬细胞的死亡。这就是为什么有些病能长期潜伏和难以痊愈的原因之一。巨噬细胞用以杀菌的武器很多，如产生过氧化氢、超氧离子、***酸杀菌，或使用溶酶体酶等。消化的过程则主要依靠溶酶体。溶酶体呈小颗粒状，内含数十种不同的水解酶，当吞噬体形成后，溶酶体即将酶释放入吞噬体内，将其中的细菌逐步分解，使之变成各种氨基酸、单糖和脂肪酸等营养物质，吸收到巨噬细胞质内加以利用。消化吸收后的残渣一般很少，可以用多层膜包围起来保留于巨噬细胞体内，称为残余体，也可以排放到细胞外。
最后，必须指出，巨噬细胞的吞噬威力也要依靠免***疾系统其他成员，如淋巴细胞、浆细胞等的互相合 作，才能很好发挥，如果人体整个免***力低下，巨噬细胞的保卫能力也会大大降低。
细胞自噬篇9
目的观察野生灵芝与人工栽培灵芝对小鼠巨噬细胞吞噬能力的作用效果，研究野生与人工栽培灵芝对小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用有无差别，为临床选择应用灵芝和研究开发人工栽培灵芝提供依据。方法给予小鼠灌胃两种灵芝水提液，6 d后进行腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，并测定吞噬百分率和吞噬指数。结果两种灵芝水提液组促进巨噬细胞吞噬功能作用强度：与正常组相比有显著差异（P0.05）。结论两种灵芝水提液均具有良好的促进巨噬细胞吞噬功能的作用，在增强免***功能方面，可以选择使用来源广泛、价格低廉的人工栽培灵芝，并可大力推广、研发人工栽培灵芝，人工栽培灵芝具有良好的市场运用前景。
【关键词】 灵芝 巨噬细胞 吞噬作用
灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，具有抗肿瘤、免***调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等广泛的药理作用。由于灵芝是一种腐生性真菌，自然野生的灵芝又喜欢生于湿气较重的山林中，并多生于梅树、乐树的枯木上，而且在10万株枯木中只有两三株有灵芝生长，所以野生灵芝显得非常珍稀贵重［1］。20世纪50年代末我国用科学方法人工栽培灵芝取得成功后，研究开发人工栽培灵芝工作得到医药工作者重视。本研究采用给予小鼠灌胃野生灵芝和人工栽培灵芝水提液，6 d后进行腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，并测定吞噬百分率和吞噬指数方法，观察比较野生灵芝与人工栽培灵芝对小鼠巨噬细胞吞噬能力的作用，以了解人工栽培灵芝在增强免***功能方面与野生灵芝有无差异，为临床选择使用灵芝和研究开发利用人工栽培灵芝提供依据。
1 材料与仪器
野生灵芝，批号：080701，购自广州致信中药饮片有限公司，测得含灵芝多糖为0.75%；人工栽培灵芝，批号：080701，购自广州致信中药饮片有限公司，测得含灵芝多糖为0.68%。上述两种灵芝均产自云南，由广州中医药大学中药鉴定教研室谭树辉教授鉴定。SPF级昆明小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证:粤监证2008A03。含台朌蓝染料的淀粉肉汤；5%鸡红细胞悬液；Hank's液。OLYMPUS倒置显微镜，日本奥林巴斯IX－71型。
2 方法
2.1 动物分组及处理小鼠30只，雄性，20～25 g，分为3组：正常对照组，正常饲养，实验第3天腹腔注射无菌淀粉肉汤1ml/次；人工灵芝***组：实验第3天腹腔注射无菌淀粉肉汤1ml/次，每日1次灌胃给予灵芝水提浓缩液1 ml，连续6 d；野生灵芝***组：实验第3天腹腔注射无菌淀粉肉汤1 ml/次，1次/d灌胃给予灵芝水提浓缩液1 ml，连续6 d。两种灵芝给药剂量均按成人（70 kg）每日服用50 g标准，以10倍于人与小鼠等效剂量1.3 g/kg小鼠灌胃给药。
2.2 吞噬功能检测注射5%鸡红细胞悬液1 ml于小鼠腹腔内，并轻揉腹部使鸡红细胞均匀分散至腹膜腔各处。30 min后小鼠颈椎脱臼处死后，腹腔注射Hank's液1 ml/只，轻轻按揉腹部数次，以充分洗出腹腔巨噬细胞。沿正中线将腹部皮肤剪开，暴露腹壁，提起腹壁剪开一小口，用吸管吸取1 ml腹腔洗液于24孔培养板内。于40×光镜下观察，各组腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况见***1～3，并计算吞噬百分率和吞噬指数［2，3］。表1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率与吞噬指数（略）
2.3 统计学方法数据以±s统计，各组间比较以SPSS11.0软件进行方差分析。
3 结果
两种灵芝水提液均具有良好的促进巨噬细胞吞噬功能的作用，与正常对照组相比，作用强度统计学均有显著差异（P
4 讨论
在本实验中，以巨噬细胞吞噬异物（鸡红细胞）功能检测反映机体的细胞免***功能。巨噬细胞能非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，并具有抗原提呈作用，参与机体的免***防御、免***自稳、免***监视功能。常用细胞型抗原如鸡红细胞、白色念珠菌、酵母细胞等与巨噬细胞孵育，检测巨噬细胞的吞噬能力。
本实验结果表明两种灵芝水提液均具有良好的促进巨噬细胞吞噬功能的作用，作用强度无统计学差异。实验结果提示通过合理调整灵芝栽培营养基所培育出的人工栽培灵芝，可以达到与野生灵芝相近的增强免***功能，具有良好市场开发运用前景。
参考文献
［1］王爱成，李柏.灵芝［M］.北京：北京科学技术出版社，2002：152.
细胞自噬篇10
自噬（autophagy）是真核细胞内的一种降解途径，能通过溶酶体使细胞内受损的细胞器及蛋白质等成分降解，广泛存在于人体的正常细胞和恶性肿瘤细胞中。自噬与恶性肿瘤的关系是近年生物医学领域的研究热点，多数研究采用不同的方法探讨二者的关系，而研究结论偏向于自噬在恶性肿瘤中起着促进与抑制的双重作用，但针对这些研究方法的文献综述较少。本文针对自噬在恶性肿瘤中常用的研究方法及其优缺点进行综述，以期为恶性肿瘤研究工作中自噬研究方法的选择及结果解释提供帮助。
1自噬与恶性肿瘤
自噬的概念最先由比利时科学家ChristiandeDuve提出，它是真核细胞内的一种降解途径，能通过溶酶体使细胞内受损的细胞器及蛋白质等成分降解。自噬性降解是机体内的一种病理生理过程，这一过程主要包括隔离膜（isolationmembrane）或吞噬泡（phagophore）的形成及延伸、自噬体（autophagosome）的形成、自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），最终胞内物质降解，产生的降解产物如氨基酸、脂肪酸等可被细胞再利用。自噬现象的出现是以实现细胞的稳态和细胞器的更新为目的，对细胞来说是一种有利的修复与防御机制。Meijer等[1]的研究表明，哺***动物细胞有着基础的自噬来降解并回收损伤的细胞器及蛋白质，同时，自噬降解后的产物可为细胞提供生存所必需的能量。而Gozuacik等[2]的研究提出了一些恶性肿瘤的发生伴随有自噬水平的抑制。自噬与恶性肿瘤的关系吸引了众多研究人员的关注，成为国际学术界的研究热点。大量研究发现，自噬与恶性肿瘤的耐药、复发和转移相关[3]，而自噬相对恶性肿瘤的发生、发展来说是一把“双刃剑”[4]，既可起到促进的作用又可表现出抑制的效果。作者认为这除了与自噬本身的复杂性和其作用于恶性肿瘤的方式、途径及分子机制不尽相同相关外，还与研究自噬所采用的方法相关。
2自噬的人工干预和调节
正常情况下培养的细胞自噬活性很低，而一些恶性肿瘤的自噬水平又是受抑制的[2]。这不利于自噬现象的观察，对自噬进行人工干预和调节就显得很有必要。研究中常用工具药实现，有时根据研究目的，使用到一些遗传学技术，可以在基因的分子水平上对自噬进行干预。2.1工具药自噬的工具药可分为与自噬相关的抑制剂和诱导剂2种。常用的自噬抑制剂有3-甲基腺嘌呤（3-MA）[5]、巴弗洛霉素A1[6]及氯喹[7]，而常用的自噬诱导剂有西罗莫司、氯化锂[8]及构造营养缺乏的环境[9]。工具药可以根据不同的原理干预和调节自噬，例如，3-MA可抑制ClassⅢ磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路来抑制自噬体的形成，以此阻断自噬发生的步骤，而西罗莫司可抑制mTOR通路，以此诱导自噬活性增强。因此，工具药的选择应根据研究目的而定。2.2遗传学技术自噬的遗传学技术包括RNA干扰（RNAi）技术与近年发展起来的CRISPR-Cas9技术[10]（最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术）。RNAi是指利用与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）可诱导特异性基因沉默的一种现象，因此RNAi技术可用于沉默或直接敲除目标基因的表达，同时具有较高特异性的特点，该技术目前普遍用于基因分子水平上的研究。通过RNAi技术沉默恶性肿瘤中与自噬相关的基因，观察自噬活性的变化，从而得出自噬与恶性肿瘤间的联系，可以为恶性肿瘤的靶向***提供新思路[11]。CRISPR-Cas9技术被称为接近目标基因组编辑的最终工具包，因其在基因组编辑中所体现出的超高的效率和简易的技术而吸引着众多科研工作者，同时被认为是在体细胞基因分子水平***上的一个新机遇[12]。Kim等[13]通过CRISPR-Cas9技术成功敲除自噬相关基因ATG5[14]，用以研究敲除ATG5后的黑色素瘤细胞中自噬抵抗BH3模拟棉酚所起的保护作用。CRISPR-Cas9技术开启了自噬与恶性肿瘤关系研究方法上的新篇章，而对于通过自噬相关分子及基因***恶性肿瘤，更是提供了无限的可能与巨大的探索空间。综上，遗传学技术相比工具药特异性更强，二者相互结合，可以更好地使研究者根据研究目的对自噬进行人工干预和调节。
3自噬的检测方法
自噬在体内是一个随时间不断变化的过程，自噬发生的步骤犹如一条“流水线”，先是隔离膜或吞噬泡的集结和延伸，接着自噬体形成，形成的自噬体与溶酶体融合，最后自噬性底物降解，产物就会被输送至细胞质中为细胞提供能量。为了保证细胞快速适应恶劣环境的变化，这一“流水线”的过程就会非常快，使自噬现象的检测比较困难。目前，自噬的检测方法主要基于这条“流水线”中的某一“时空点”或者某一“时空段”，相对自噬这一动态过程，这些检测方法本质上均是静态的。3.1基于“时空点”的检测该类检测常用的有透射电子显微镜、LC3免***印迹及LC3单荧光检测，这些均基于自噬体的直接或间接检测原理。3.1.1透射电子显微镜透射电子显微镜主要通过观察自噬性结构[15]的形成及数量来判断自噬的发生，所观察的自噬性结构中最主要的是自噬体，因此是自噬体的直接检测方法[16]。透射电子显微镜检测结果的准确性基于观察者对自噬体在镜下结构的准确判断，这就不可避免地存在一定的主观性，同时，样本的制备也可影响观察者的判断。例如，脂质双分子层受制备过程所用试剂的影响而发生改变，影响对自噬体膜的判断，也可因不同切面自噬体数量不一而在推算整个细胞的自噬情况时结果出现误差。由此可见，透射电子显微镜探索自噬现象是基于形态学的观察，同样存在着不足的地方，使用时应结合其他检测来相互验证。3.1.2LC3免***印迹LC3为自噬体膜上多功能标记蛋白[17]。自噬形成时，弥漫于细胞质中的LC3（即LC3-Ⅰ）与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶联，转变成LC3-Ⅱ附着于自噬体膜上，当自噬体向溶酶体呈递后方才降解消失。因此，通过免***印迹检测LC3-Ⅱ的表达或测定LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值可以从一定程度反映自噬体数量的多少[18]，这种检测即是基于自噬体间接的检测原理。这一方法的缺陷在于LC3抗体对LC3蛋白的2种类型亲和力不相同，对LC3-Ⅱ有更高的亲和力，因此会出现较高的假阳性率。3.1.3绿色荧光蛋白（GFP）-LC3单荧光检测该方法的检测原理也是基于LC3在自噬形成过程中与PE偶联并锚定于自噬体膜上的现象，利用GFP与LC3融合，根据荧光显微镜下绿色荧光斑点来示踪自噬形成[19]。自噬没有发生时，GFP-LC3融合蛋白弥漫分布于细胞质中，而当自噬发生之后，GFP-LC3融合蛋白就会集结且锚定在自噬体膜上，此时使用荧光显微镜即可观察到相对明显的绿色荧光斑点，而这些斑点代表的就是自噬体，再通过计数斑点数，就可以估测自噬体的数量。3.2基于“时空段”的检测该种检测有别于“时空点”检测。“时空点”检测得出的结果大多解释为自噬体数量的多少，而这可能由于自噬某一通路受阻使得自噬体数量多少与自噬活性强弱不相符[20]。“时空段”的检测包含了自噬形成的多个步骤及自噬降解过程的检测，因此可检测到自噬流（autophagicflux）[21]，这使得在形态学检测基础上进一步进行功能学检测成为可能，可在一定程度上得知自噬活性的强弱，但仍旧无法实时地监测自噬现象所发生的全部过程。“时空段”常见的检测方法有红色荧光蛋白（RFP）-GFP-LC3双荧光检测、LC3动态检测、长寿命蛋白降解检测。3.2.1RFP-GFP-LC3双荧光检测在GFP-LC3单荧光指示体系的基础上，增加RFP，利用GFP在酸性环境下其绿色荧光会发生淬灭而RFP对酸性环境不敏感及其红色荧光不会发生淬灭的原理进行自噬活性的检测[22]。结果判读时，通过显微镜成像后红绿荧光融合，融合后出现的黄色斑点即是自噬体，红色斑点是自噬溶酶体。因此，可通过计数不同颜色的斑点来反映自噬流的强弱。这种检测方法的缺点在于不能反映出自噬降解的过程，同时，溶酶体酶的活力及其pH值也可影响信号的检测。3.2.2LC3动态检测从自噬体形成、自噬体向溶酶体呈递，到自噬性底物降解，这些步骤的发生均伴随着LC3量的不断变化。通过LC3动态检测，即可将这个变化的过程反映出来，从而反映自噬活性的强弱。LC3动态检测所采用的技术手段有免***印迹，也可通过流式细胞仪检测，也有研究通过加入一种溶酶体抑制剂来比较LC3-Ⅱ前后的差别，得出加入溶酶体抑制剂后LC3-Ⅱ表达增多的那部分，代表的即是被溶酶体所要降解的自噬体[23]。3.2.3长寿命蛋白降解检测哺***动物体内蛋白质的降解可通过蛋白酶体ATP依赖的泛素降解和溶酶体ATP非依赖降解2种途径，蛋白酶体主要负责降解短寿命蛋白，而长寿命蛋白则主要通过溶酶体途径降解。根据溶酶体降解长寿命蛋白并在自噬诱导后与自噬体相融合的特性，将同位素标记法应用于细胞培养基，细胞合成的蛋白就会被同位素标记，而后把细胞转移至不含同位素的普通细胞培养基，使被标记的短寿命蛋白优先降解，随后开始自噬诱导，诱导后自噬活性增强，长寿命蛋白随之降解，此时测定上清液的放射活度，即反映出细胞经由自噬来降解底物的能力[24]。
4自噬在体内的研究方法
自噬在体内的研究方法已有先例，Mizushima[25]已成功构建GFP-LC3转基因小鼠，使得体内实时监控自噬成为可能。但目前有关自噬在体内的研究方法的文献不多，因此，使用GFP-LC3转基因小鼠进行体内自噬研究时，要结合体外自噬的检测方法，以避免单一方法的局限性。
5小结与展望