细胞分化10篇

细胞分化篇1

1、细胞的分化是在一定条件下，可以分化成多种功能的APSC多能细胞。细胞的分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态，结构和生理功能上向着不同方向稳定变化的过程。那些形态的相似，结构相同，具有一定功能的细胞群叫做组织

2、细胞的分化是一个非常复杂的过程，也是当今生物学研究的热点之一。由一个受精卵发育而成的生物体的各种细胞，在形态，结构和功能上会有明显的差异，这和细胞的分化有关。

（来源：文章屋网 ）

细胞分化篇2

高度分化的细胞有：红细胞、白细胞、血小板、叶肉细胞、根尖成熟区细胞、浆细胞、效应T细胞、神经细胞、卵细胞、***、肌肉细胞等等。

细胞的分化是一个非常复杂的过程，也是当今生物学研究的热点之一。由一个受精卵发育而成的生物体的各种细胞，在形态，结构和功能上会有明显的差异，这和细胞的分化有关，细胞的分化是在一定条件下，可以分化成多种功能的APSC多能细胞。细胞的分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态，结构和生理功能上向着不同方向稳定变化的过程。那些形态的相似，结构相同，具有一定功能的细胞群叫做组织。

（来源：文章屋网 ）

细胞分化篇3

【关键词】  间充质干细胞  免***调控

     endothelial cells derived from mesenchymal stem cells harbor immunoregulatory effects

    jiang xiaoxia*, chen jinsong*1, su yongfeng, liao can1, liu bing, mao ning

    institute of basic medical sciences, academy of military medical sciences, beijing 100850, china; 1guangzhou cord blood bank, guangzhou maternal neenatal hospital, guangzhou 510180, china

    abstract     this study was purposed to investigate the immunoregulatory effect of endothelial cells derived from mesenchymal stem cells (msc). the human msc was induced to differentiate into endothelial cells for one week. the phenotypes were evaluated by flow cytometry,  the cell morphologic feature was observed by invert phasecontrast microsoope and analysis of capillary formation was performed by using the in vitro angiogenesis kit. the immunoregulatory effect was detected by  lymphocyte transformation test.  the result indicated  that during the differentiation cells grew fast and there was no significant change in the phenotypes, i.e.  cd73，cd105，hlaabc were positive  and cd34, cd80, cd86, hladr, cd31 were negative. immunofluorescence analysis showed typical expression of the von willebrand factor. differentiated mscs formed capillarylike structure. endothelial cells derived from msc also revealed  immunosuppressive effect on t cell proliferation in a dosedependent manner. it is concluded that endothelial cells derived from msc also harbor immunoregulatory effect  on t lymphocytes.

    key words    mesenchymal stem cell; endothelial cell; immunoregulatory effect

    j exp hematol 2007; 15(1):175-178

    间充质干细胞(msc)起源于中胚层，免***原性低, 移植后无免***排斥反应，对多种免***细胞具有调控功能［1］，且在体外可大量增殖培养。若将msc定向诱导，分化为血管内皮细胞，在体外构建成理想的血管移植物，在血管组织工程和再生医学领域必将有广阔的应用前景。

    为了研究成体msc向血管内皮细胞分化的能力，摸索msc体外诱导分化为内皮细胞的实验条件，以及探讨msc分化为内皮细胞后应用于血管损伤修复方面的可行性，我们分离纯化骨髓msc后，选取合适的条件，将msc诱导分化为内皮细胞，并观察其对t淋巴细胞的免***调控能力。

    材料和方法

    msc分离培养及鉴定

    msc分离培养  取正常人骨髓以肝素抗凝，用pbs稀释后，密度梯度离心(percoll 比重 1.077 g/ml)分离单个核细胞，按2×105/cm2加入含10%胎牛血清(hyclone公司产品) 的dmemlg培养液的75 cm2培养瓶中，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养48小时后去除非贴壁细胞，并更换新鲜培养体系，继续培养，待细胞90%融合时，用0.05%胰酶消化，按5 000 cells/cm2的密度传代培养，取第3代至第7代的细胞进行实验。

   间充质干细胞分化而来的内皮细胞具有免***调控能力msc表面标志测定  用0.05%胰酶消化收获细胞，用流式细胞术按常规测定以下指标：cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr(pharmingen 公司产品)。间接免***荧光染色法测定vwf(一抗是鼠抗人vwf抗体，novocastra laboratories 公司产品；二抗是fitc标记的羊抗鼠igg，southern biotech公司产品)。vwf标记前细胞首先用4%多聚甲醛固定10分钟，再用0.5%triton100透膜处理10分钟，然后与一抗(1∶100)孵育60分钟，离心洗涤后二抗孵育30分钟，再次洗涤后在荧光显微镜下观察细胞，并设立阴性对照样品(细胞只加二抗孵育)。

    msc多向分化潜能鉴定  msc以0.5×104/well接种于24孔板，用含10% fbs的dmemhg培养液，加入地塞米松0.1 μmol/l、β磷酸甘油10 mmol/l、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/l，以诱导分化成成骨细胞，每3天半量换液体，7天后碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成； 与此同时，msc以1.7×104/well接种于24孔板,加入地塞米松1 μmol/l、胰岛素10 μg/ml、ibmx 0.5 mmol/l、消炎痛200 μmol/l，以诱导分化成脂肪细胞，油红染色鉴定脂滴形成。

    msc向内皮细胞诱导分化及鉴定

    诱导培养  诱导培养体系是含5% fbs的dmemhg加细胞因子vegf(20 ng/ml， r&d公司vegf121), msc接种于75 cm2的培养瓶，其密度为3 000 cells/cm2，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养7天，每2天半量换液，收获的细胞一部分用于检测鉴定，另一部分加入淋巴细胞转化实验的反应体系中，观察其对淋巴细胞的免***调控作用。

    流式细胞术检测  对向内皮细胞诱导7天后细胞的免***表型： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr，用间接免***荧光技术标记vwf，方法同前。

    体外血管生成实验  用体外血管生成模型试剂盒(chemicon公司产品)，观察在半固体matrigel上诱导后的细胞形成毛细血管样网状结构的能力。将matrigel置于4 ℃冰水浴中融化，按30  μl/well铺于96孔板，在37℃培养箱放置1小时后，加入诱导分化内皮细胞7天的细胞，5×103/well，2小时后开始在倒置显微镜下观察细胞形成管状结构的形态。

    诱导后细胞的免***调控能力

    细胞接种  诱导后的msc细胞分别按0.2×104/well、0.4×104/well、2×104/well接种于96孔板，即内皮细胞与t淋巴细胞（2×105/well）比例分别为1∶100， 1∶50和1∶10。每组细胞设5个复孔。待细胞贴壁后再加入t淋巴细胞。

    淋巴细胞转化  淋巴细胞采自健康成人的外周血，用ficoll(比重1.077 g/ml)离心分离单个核细胞，用磁珠(miltenyi公司产品)分离纯化cd3+t细胞。t淋巴细胞重悬于含20% fbs的rpmi 1640 培养液，以2×105/well加入已经铺有贴壁细胞的96孔板，并加入终浓度为10 μg/ml植物血凝素(pha)，刺激t淋巴细胞增殖。以单纯t细胞加pha作为对照组。细胞于37℃、5% co2、饱和湿度孵育84小时后,加3h标记的脱氧胸腺嘧啶苷(3htdr， 中国科学院原子能研究所提供)1 μci/well，标记12小时后，收集细胞，用液体闪烁计数仪(wallac公司产品)检测cpm值，观察msc诱导对淋巴细胞转化的作用。

    结    果

    msc诱导分化为内皮细胞

    本实验所采用的骨髓msc经过鉴定，具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。流式细胞术检测msc表面抗原： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、hladr、vwf为阴性，cd73、cd105、hlaabc为阳性，3代以后的细胞纯度超过95%，将第3到第7代间的msc用于内皮细胞诱导。

    向内皮细胞诱导分化7天的msc在显微镜下呈现形态无明显改变。在诱导体系中，msc的生长速度比普通培养条件下稍快，3天可形成致密的贴壁细胞层。

    免***荧光标记诱导7天后的细胞显示，vwf为阳性(*** 1)，对照组msc细胞为阴性。细胞其它表面标记无明显改变，即cd73、cd105、hlaabc仍为阳性；cd34、cd45、cd80、cd86、hladr、cd31仍为阴性。

    向内皮诱导7天后的msc具有在半固体matrigel胶上形成毛细血管样网状结构能力。相差显微镜下观察发现，用胰酶消化下来的细胞接种在matrigel上，2小时后开始伸出丝状触突(*** 2)，4小时后相邻的细胞通过触突互相连通，并逐渐通过管状结构联成网状。随后细胞缓慢聚集，形成粗管状结构。而对照组未诱导的msc不能形成这种管状结构。

     msc诱导分化的内皮细胞对淋巴细胞转化的影响

    经过pha刺激后t淋巴细胞增殖迅速， cpm值为(16.13±1.83)×103(*** 3)，表明加入msc诱导分化的内皮细胞对t淋巴细胞的增殖有抑制作用。当加入细胞量分别为200、400、2 000，即与t淋巴细胞的比例从 1∶100增加到1∶50 和1∶10，其抑制效应逐渐增强， cpm值分别是(14.22±1.67)×103、(12.36±1.08)×103和(0.83±0.09)×103（***3）。由此可见，msc向内皮细胞诱导分化以后，仍然具有免***调控能力，其抑制效应与加入的内皮细胞浓度有关。

     讨    论

    研究表明，出生后人体内一直存在有内皮干细胞，参与新生血管形成。有研究人员从骨髓、外周血、脐血等组织分离出内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, epcs)［2-4］，其特征为cd133+、cd34+、kdr+或cd14+。也有研究人员从骨髓msc诱导分化出内皮细胞［5］，msc在小鼠体内也被发现能分化为内皮细胞［6］，甚至有报道指出，msc与肿瘤血管形成有关［7］。msc本身具有部分内皮细胞的表型：表达cd105(内皮糖蛋白endoglin)，endoglin主要分布在内皮细胞，与血管的发育有关； 表达黏附分子vcam1、icam1、integrin  β3以及内皮细胞特异性的血管内皮生长因子受体vegfr2(kdr/flk1)等。

    无论是用cd34+细胞，还是用cd34-的msc体外诱导的内皮细胞，vegf都是主要的诱导因子 ［ 8,9 ］。本实验采用人骨髓msc，在含vegf(20 ng/ml)的分化诱导体系中培养7天，获得了内皮样细胞，特异性表达抗原vwf，在半固体matrigel上能形成毛细血管样管状结构。但是，直至将细胞诱导培养14天仍然未检测到cd31表达，诱导的细胞不能吞噬dilacldl，其原因可能与内皮细胞分化阶段有关。

    引人注意的是，msc诱导分化成为内皮样细胞后，仍然具有免***调控功能，正如msc分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞后仍保持原来的免***调节功能［10］。从实验结果来看，其抑制作用依赖于细胞的剂量，当其与t淋巴细胞比例为1∶10的时候，抑制率可达56%。由msc诱导来的内皮细胞的这种特性使其在血管组织修复的应用中呈现良好的前景，低免***原性及免***抑制功能有利于血管移植物的植入和生长，能维持血管腔长期通畅。同时作为干细胞来源的msc又具有取材方便、适合体外大量培养扩增的优点，能很好地解决临床应用中如何大量获取干细胞来源问题，因而可以广泛地应用于心血管疾病的***及组织器官移植。

【参考文献】

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5oswald j, boxberger s, jorgensen b, et al. mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. stem cells, 2004; 22:377-384

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细胞分化篇4

关键词：组织工程骨；脂肪干细胞；成骨诱导；成骨分化

中***分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2680-02

Inducing Human Adipose-derived Stem Cells Into Osteoblasts Directionally And

Identification of Their Osteogenesis Characteristics

LIU Bo, ZHU Jintu, CAO Yi, GAO Shousong, YU Tu-gen

(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To study the method of inducing human adipose-derived stem cells (ADSCs) into osteoblasts directionally and to identify osteogenesis characteristics. Methods: ADSC was isolated from liposuction aspirates using digestion method by I type collagenase and passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing 0.01μM dexamethasone, 10 mMβ-glycerophosphate, 50μM ascorbate-2-phosphate and 10mM 1,25-dihydroxyvitamin D3.The induced cells were chosen to check osteogenesis characteristics, including alkaline phosphatase quantitative assay, osteocalcin, osteopontin and collagen_I assay by immunoflurorescence,and calcium nodes assay with Alizarn Red staining. RT-PCR was used to assay alkaline phosphatase and osteopontin. Results: The expression of AKP is positive at several detecting times, and the osteopontin,collagen_I, and osteocalcin were positive by immunoflurorescence method in experimental group after induced 14 days, and calcium nodes were seen by Alizarn Red staining in induced cells. AKP and OPN expression or experimental group were detected by RT-PCR method. Conclusion: The induced human ADSCs had typical osteogenesis characteristics.

Key words:tissue engineering bone; adipose-derived stem cells; osteogenic induction; osteogenic differentiation

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收稿日期：2011-07-30

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2080180）

作者简介：刘波（1978-），男，山东诸城人，主治医师，硕士，研究方向：脂肪移植***的基础与临床研究。种子细胞的来源是组织工程的基本问题。众多学者一直在寻找具有强大的体外增殖力和多向分化潜能的干细胞，现已成功获得骨髓间充质干细胞（BMSCs），并证明其能向多种中胚层组织细胞分化，极大推动了组织工程学的发展。近年有学者注意到，在某些病理情况下脂肪中有异位骨形成，这表明脂肪组织中可能存在某些细胞可分化为其他组织细胞。2002年，Zuk\[1\]从脂肪抽吸物中分离到具有多向分化潜能的干细胞，以后的学者将其命名为ADSCs(Adipose -derived stem cells)。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。本文旨在探讨人脂肪干细胞体外成骨的特性。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 脂肪抽吸物均来自浙江省中医院整形外科门诊行脂肪抽吸术的患者；DMEM低糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco公司产品；β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸及1,25-(OH)2VitD3均为Sigma公司产品；OPN、OCN、I型胶原一抗为CHEMICON公司产品，二抗为Santa Cruz公司产品。

1.2 脂肪干细胞培养与传代 无菌条件下将脂肪抽吸物用PBS反复冲洗，尔后移入离心管，加入等体积的0.075%的I型胶原酶消化，37℃、1h,加带血清培养液终止消化，离心1380r/min，10min，弃去上清，用100目细胞滤器过滤，再离心1380r/min，5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清DMEM低糖培养液混匀细胞，以2×104/cm2接种于100mm培养皿中培养。24h后，可见梭型细胞贴壁，每3天更换培养液一次，待细胞融合至80％～90％时进行传代，传代密度为1×104/cm2。扩增到第2代后，换成骨诱导液。

1.3 AKP定量检测 将底物 40mg(1粒)溶解于10mL去离子水中备用；取5支15mL离心管分别标记空白等，各放入0.5mL缓冲液和0.5mL底物水溶液，37℃水浴10min；每盘细胞PBS冲洗后，加入3mL Tris (ph7.4)，将细胞刮下，吸入离心管，超声震荡粉碎（90s,间隔9s, 4℃）；取01mL混合震荡液加入已标记的离心管中，空白组加入0.1 mL去离子水，继续37℃水浴15min；加入10mL 0.05N NAOH终止，405nm分光光度计测光密度值（吸光度），以空白对照组进行调零。（0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol p-nitrophenol/h）。

1.4 细胞免***荧光分析OPN 、OCN 及I型胶原表达 细胞爬片经PBS冲洗两遍，每次5min，加入95％丙酮固定10min，PBS适当冲洗，10％羊血清封闭30min，加一抗（OPN、I型胶原为兔抗人多克隆抗体，OCN为鼠抗人单克隆抗体）4°C过夜，PBS适当冲洗，二抗（OPN、I型胶原FITC标羊抗兔多克隆抗体，OCN为FITC标羊抗鼠多克隆抗体）37°C孵育30min，PBS适当冲洗，1∶ 1000稀释PI(Sigma公司)37°C孵育10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察。

1.5 Alizarn Red 染色-检测钙结节形成 以未诱导组作为阴性对照。诱导28天，4％多聚甲醛固定30min，PBS适当冲洗，加入0.1％Alizarn Red-Tris-Hcl 溶液（pH83），室温，10min。PBS适当冲洗，干燥封片。

1.6 RT-PCR检测AKP、OPN表达 分别收集对照组和实验组在培养和诱导14天后细胞，加入Trizol抽取mRNA，进行逆转录反应，得到的cDNA进行PCR扩增,反应条件94°C变性，55°C退火，35个循环。引物序列。

1.7 统计学方法 结果数据以均数士标准差(±s)表示，组间采用Student-Newman-kewls方法进行比较。P＜005认为有显著性差别，统计软件包为SAS Ver.6.12。

2 结 果

2.1 AKP定量检测 AKP在第3天开始出现，14天达高峰，随后下降。自第3天起各个检测点（诱导3、7、14、21、28天）诱导组与对照组差异具有统计学意义（P

2.2 细胞免***荧光分析OCN、OPN 及I型胶原表达 诱导14天,实验组细胞OCN表达阳性，胞浆内出现黄绿色荧光见插页Ⅲ***2A，OPN表达阳性见插页Ⅲ***2B，I型胶原表达阳性见插页Ⅲ***2C。

2.3 钙结节Alizarn Red 染色 诱导14天，实验组细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节见插页Ⅲ***3。

2.4 RT-PCR检测AKP、OPN AKP（14天） RT-PCR检测结果：显示大约400bp与500bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组未见阳性表达。OPN（14天）检测，大约300bp与400bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组也有表达，但明显弱于诱导组，见插页Ⅲ***4。

3 讨 论

骨组织工程研究的重要内容之一是寻找具有取材容易、体外扩增能力强、易定向诱导分化等优点的种子细胞。2002年国外学者Zuk从脂肪抽吸物中分离到脂肪干细胞，体外证明具有多向分化潜能以来。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。

研究发现，ADSCs在含地塞米松、β－磷酸甘油、维生素C、1,25(OH）2VitD3的诱导下，能够向成骨细胞分化。其中地塞米松在成骨分化早期以促进基质合成为主，调控分化细胞中基因表达，提高AKP活性，促进向成骨细胞转化，后期以促进钙化为主，是体外人间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的必需成分。β-甘油磷酸钠可以提供骨组织在体外培养体系中发生沉淀所需的磷离子，从而加速结节的钙化细胞\[2-3\]。维生素C的作用主要是促进体外培养细胞合成胶原、形成钙化，同时可调节AKP活性，而AKP在成骨细胞体外钙化中起决定性作用\[3\]。成骨细胞有1,25-(OH)2VitD3的受体，1,25-(OH)2VitD3的主要作用是直接作用于细胞膜的受体，调节细胞对钙离子的转运，促进钙磷代谢，在诱导培养液中加入1,25-(OH)2VitD3能促进间充质干细胞向成骨细胞表型转化，同时抑制软骨细胞的分化，并维持成骨细胞的分泌与代谢活动，这是重要的诱导条件之一\[4\]。

检测细胞是否分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(AKP)活性增强和细胞外基质钙化是两个重要标志。AKP是成熟成骨细胞标志酶之一，目前普遍认为，AKP在体外钙化中起着关键的作用。如果没有AKP活性，钙化就不会发生，其主要机制在于AKP能够水解有机磷酸酶，使局部PO-43浓度升高，结合钙，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化\[5\]。AKP定量检测表明在我们以上诱导条件下，AKP在第4天开始出现，14天达高峰，随后下降。RT-PCR也证实了诱导后AKP基因水平的表达。AKP活性增强与钙沉积是不同步的，AKP活性增强是钙化出现的前提。诱导14天，细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节。

成骨细胞分泌的蛋白以I型胶原为主，是骨组织的支架，实验表明成骨诱导前后，免***荧光都检测到其表达。OPN和OCN都是成骨过程中的重要蛋白质，能够促进成骨过程钙磷沉积。然而OPN并不特异，其他细胞也有表达，但RT-PCR显示诱导组较非诱导组表达增强。OCN是成骨细胞特异的蛋白质，诱导14天后，免***荧光显示其表达。以上实验表明我们应用以上诱导培养液能够将第二代的脂肪干细胞诱导为成骨细胞。

对脂肪干细胞的研究才刚刚开始，各实验室的结果也不尽相同，进一步的研究还有待于深入进行。但现有的研究资料已经预示了ADSCs广泛的应用前景。

参考文献

［1］ Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells\[J\]. Mol Bio Cell,2002,13:4279 4295.

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细胞分化篇5

[关键词] 骨髓基质干细胞；成骨细胞；诱导分化

中***分类号：R681 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-035-04

前 言

骨髓基质干细胞作为干细胞的一种，具自我更新和多分化潜能，具备成为种子细胞[1-2]的可能，在组织工程发展的热潮中引起科学工作者关注，但围绕骨髓干细胞的相关研究尚处于起步阶段[3-4]。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可以通过跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体RET激活细胞内多巴胺（DA）神经信号，从而促进神经细胞存活和分化过程。aDA-2006是本实验者在实验中筛选、发现的一种易透过细胞膜、无细胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本实验具体分析DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的机制，为骨组织工程的临床应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：选择南京青龙山的3周龄新西兰大白兔（雄性）。实验试剂与相关仪器：Trizol（美国Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式会社），反转录试剂盒（日本Toyobo株式会社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（维森特生物技术有限公司）、细胞孵育箱（赛默飞世尔科技中国有限公司） 、超净工作台（浙江安泰医药有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 脱颈处死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔胫骨结节0.5-1cm处分别抽取骨髓1.5mL，同时加入等体积的DMEM培养液，将液体移至50mL离心管中，1400rpm/min转速离心5-10min，吸去上清及脂肪层，然后在离心管中添加10%FBS的DMEM培养液4 mL，进行颠倒混匀20次，按1×106个细胞/cm2的密度，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于饱和湿度孵箱（37℃、5%CO2）中培养。经48h细胞培养后，换液50%，去除未贴壁细胞、红细胞等，以后每72h进行一次换液。原代培养9-12d后细胞达80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后传代[2]。

将第2代细胞分3组进行培养，诱导组A采用诱导培养液[4]（普通培养液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C），诱导组B采用含1?LMDA-2006的普通培养液。对照组采用普通培养液。

1.2.2 检测方法 （1） PCR检测标志基因的表达：取传至第3代BMSCs细胞，吸弃培养液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mLEP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR试剂盒说明书进行。应用Primer Premier 5.0的软件设计、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技术有限公司），其特异性利用融解曲线进行分析验证。

cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。

反转录结束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。

3步法进行Q-PCR扩增，反应条件如下表1。

表1 Q-PCR扩增条件

温度（°C） 时间（S） 循环次数

95 10 1

92 15 45

60 20 45

72 35 45

（2）MTT法测生长率：各组细胞， 经胰酶消化后， 进行计数， 以2.5*103/L接种于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3组均处于37℃、5%CO2 条件下进行培养，在检测前，每孔加入4mg/mLMTT25L，继续培养3h， 吸弃培养液， 每孔添加150?L DMSO，振荡10min， 利用酶联免***检测仪，在490nm 波长进行检测各孔吸光光度值，每日检测3孔， 进行均值计算。

观察不同组别不同时期细胞的形态学，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线，进行生长率的判断与计算。同时观察不同组别的ALP、OC、OPN基因表达情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用x±s显示，组间差异比较，用两样本的均数t 检验，P

2 结果

2.1 细胞形态学情况

细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见***1），细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。

***1 传代第3代骨髓基质干细胞（×100）

2.2 生长率情况

该实验分为诱导组A，即诱导培养液组，诱导组B，即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见***2）

3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低（B组相比于A组，F=0.152，P=0.453），说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。

***2 骨髓基质干细胞生长曲线***

2.3 成骨分化标志基因表达情况

标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见***3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。

***3 骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况

3 讨论

当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞***和基因***方面的价值[6-7]。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因***方面有更多优势[8-10]，例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。

经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]。操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。

多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低，而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]。

人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶（LAP）作为成骨细胞表型的标志物之一[16，17]，可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与OC的表达水平显著上调。本文结果显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A。可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。

总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研究发现在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化情况较强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。

参 考 文 献

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细胞分化篇6

【关键词】 星形胶质细胞;神经干细胞;分化;比例

a selection of optimized ratio of the protoplasmic and fibrous astrocytes to the directional differentiation of neural stem cell

li min,zegn lin,liu yuan,et al.

(state key laboratory of trauma,burns and combined injury,department 3,institute of surgery research,daping hospital,third military medical university,chongqing 400042,china)

abstract: objective through culturing nsc with pas in various ratios，we try to find the best ratio in which maximum amounts of neurons can differentiate from nsc.methods by coculturing of nsc with pas in the ratio of 3:1 or 2:1 or 1:1 or 1:2 for 10 days, immunohistochemisty with dapi was taken to calculate the proportion of neurons within 100 cells in 20 fields of vision chosen randomly.the data were analyzed statistically.results the percentage of neurons differentiated from nsc in the ratio of 2:1(65%) was much more than that in the other groups.the groups of 1:1 and 3:1(61% and 59%) were lower than the group of 2:1,the group of 1:2(57%) was the lowest group.conclusion in vitro coculture of nsc and pas in a ratio of 2:1 may be more advantageous for nsc in differentiating into neurons.

key words:astrocyte;neural stem cell;differentiation;ratio

本室在实验中观察到原浆型星型胶质细胞(protoplasmic astrocyte，pas)与纤维型星型胶质细胞(fibrous astrocyte，fas)相比更有利于神经干细胞(neural stem cell，nsc)向神经元的分化[1]。但不同比例条件下nsc向神经元分化的情况可能存在差异，为此本实验将nsc与pas以不同比例进行体外共培养，观察nsc的定向分化的差异，筛选出有利于向神经元分化的最佳方案，为体内实验提供依据。

材料与方法

1 实验动物

孕13～14天的大鼠和新生2天的大鼠。

2 试剂与材料

10%胎牛血清(fbs，hyclone)，2mmol/l l谷氨酰胺(sigma)，0.6%葡萄糖，dmem/f12培养基(hyclone)，多聚赖氨酸，0.25%胰蛋白酶 (sigma)，10mmol/l lleucinemethylester(sigma)，0.15mmol/l edta，hanks液(自备)，兔抗大鼠igg(gfap,sigma)，小鼠抗大鼠igg(nf200,sigma)，羊抗小鼠tritc(igg荧光控制体，北京中山公司)，0.4%tritonx100，甲醇，30%h2o2，0.01m pbs(北京中山公司)。

3 实验方法

3.1 pas的培养 新生2天的sd大鼠，无菌条件下剔除软脑膜及血管，取大脑皮层组织，剪碎，0.25%胰蛋白酶37℃消化30分钟，培养液(10%胎牛血清，2mmol/l l谷氨酰胺，0.6%葡萄糖，dmem) 吹打成细胞悬液，接种于培养瓶，孵育30分钟，翻转瓶子吸出细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，密度为1×106个/ml，孵箱中培养，每3～5天换液1次。培养至14天后，向培养基中加入10mmol/l lleucinemethylester并孵育1小时以杀死小胶质细胞，用新鲜培养基洗2次，孵育2小时，37℃摇床上以180r/min振荡16小时，o2a前体细胞被摇起，瓶中所剩的一层即为pas。

3.2 pas的鉴定

固定pas细胞，用0.5%h2o2/甲醇灭活内源性过氧化物酶，0.4%tritonx100孵育，滴加正常山羊血清封闭，加入gfap抗体37℃孵育2小时，羊抗小鼠tritc荧光抗体igg显色后dpx封片，激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm，呈红色。

3.3 nsc的培养和鉴定 参见刘媛等[2]建立的方法。

3.4 nsc和pas共培养

3.4.1 分组 根据nsc与pas的比例分为4组：3:1组;2:1组;1:1组;1:2组，共培养10天。

3.4.2 nsc分化情况鉴定 经dapi标记的nsc分化10天后，用nf200对分化神经元进行标记，用tritc显色，方法同3.2部分。激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm阳性细胞，呈红色。dapi标记为蓝色，激发波长为380nm。

3.4 统计学处理 在显微镜下随机选取20个视野，每次计数100个细胞，计算神经元在nsc中所占的比例。实验数据用spss 10.0软件处理，结果以±s表示，组间差异采用单因素方差分析。

结果

1 pas的鉴定结果分析

pas外观扁平，胞体较大，折光性好，突起宽而扁，似荷包蛋样，分支较少(见***1)。

2 nsc与pas共培养后分化比例分析

结果观察到nsc:pas 2:1组分化得到的神经元数量最多，与分化的胶质细胞比例为65%:35%;而1:1组、3:1组稍低一些，比例分别为61%:39%和59%:41%;1:2组比例最低为57%:43%(见表1，***2、3)。

表1 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)

与2：1组比较：##p<0.01;与1：1组比较：p<0.01

***1 pas组化鉴定共聚焦显微镜观察(gfap红色荧光标记，胞体较大，圆盘状，突起宽而扁，分支少，形似绒球)(略)

***2 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)

a.nsc:pas 3:1时分化神经元染色( ×100);b.nsc:pas 2:1时分化神经元染色( ×100);c.nsc:pas 1:1时分化神经元染色( ×100);d.nsc:pas 1:2时分化神经元染色( ×100);dapi(蓝色)标记nsc核;nf200(红色)标记神经元;b组分化神经元比例最高

***3 nsc与pas在不同比例下共培养10天神经元分化的情况(略)

讨论

星型胶质细胞(astrocyte，as)能分泌多种细胞因子，调控nsc分化，在神经发育及损伤再生中具有重要作用[3,4]，分为pas和fas两种类型。本室已在实验中观察到pas比fas更有利于nsc向神经元的分化[1]，但nsc与pas以什么样的比例共培养才能更有利于nsc向神经元分化，进而满足脊髓损伤修复的要求?因此，筛选出nsc与pas的最佳比例显得尤为重要。本实验结果显示，nsc:pas比例为2:1时分化得到的神经元比例最高，而3:1组、1:1组、1:2组分化得到的神经元比例均明显低于2:1组。这可能是在2:1条件下pas细胞培养液所提供的营养成分及生物活性分子的量最有利于nsc向神经元的分化，3:1条件下可能是由于nsc数量相对过多而pas相对较少，使其能够分泌产生的ngf、bdnf、tgfβ等利于nsc向神经元分化的细胞因子相对不足而使这一分化过程受到了一定程度的抑制，在此情况下更利于nsc向胶质细胞方向的分化[5-7]。而1:1组、1:2组表现为神经元分化比例的递减趋势，说明细胞在共培养条件下可能存在竞争性生长抑制，特别是pas生长代谢旺盛会大量消耗培养液中的营养成分，同时会产生更多的代谢产物，成为nsc增殖分化的不利因素，虽然pas分泌促进nsc向神经元分化的细胞因子也会增加，但不足以完全抵消不利因素的影响，而且高比例的pas分泌产生的cntf、egf以及高浓度的bfgf都促进了nsc向胶质细胞的分化，导致神经元分化比例降低。

nsc与pas以2:1共培养条件下，pas分泌产生的神经营养因子及细胞生长因子的有效剂量促进了nsc向神经元方向的分化，而向胶质细胞的分化途径受到了一定程度的抑制，使神经元的分化比例达到了65%。该结果和以往单一因子以及as诱导nsc分化的国内外相关研究相比[7]，神经元分化比例较高，且本研究所采用的细胞调控方式更接近于在体的细胞生存状态。此外，pas来自中枢更适应脊髓组织的微环境，它所诱导的脊髓源性nsc分化的神经元能更好地满足损伤脊髓的修复要求。这种细胞联合移植可能会对sci的结构和功能修复产生积极作用。

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细胞分化篇7

中***分类号：R392.5 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672－1349(2007)08－0721－02

干细胞能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，实现组织的更新和修复。丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效。近年许多实验证实丹参在诱导干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，选择性采用神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)、神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、βⅢ微管蛋白(βⅢTubul{n)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行鉴定，结果显示阳性，表明中医药在干细胞研究的道路上迈出了新的一步。

1 干细胞的概念及生物学特性

干细胞(stem cell，SC)是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。目前公认的干细胞应具备的几点主要细胞生物学特点有：①具有自我更新能力与维持能力，也就是说它可以***，***后的子细胞与母细胞一样保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地***下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义；②具有多向分化的能力(多能性或全能性)，可以分化发育成各种胚层组织的细胞，或可以分化成为本系统各谱系的细胞(特定组织干细胞，如造血干细胞)；③既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等；④干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境(nitches)，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将胚胎细胞种植人小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。

2 干细胞的分类

干细胞存在于早期的胚胎、骨髓、脐血和部分成年人的细胞中。在一定条件下可以分化为多种功能细胞。

2．1 按分化潜能的大小分类可分为3种：一是全能性干细胞，它具有分化成人体内各种细胞的潜能，如胚胎干细胞；另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可以分化出至少12种血细胞，还可以分化出造血系统以外的其他细胞；还有一类为单能干细胞(也称专能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的肌原细胞或叫卫星细胞。

2．2 根据干细胞生存阶段分类可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞是来源于哺***动物早期胚胎内细胞团中的一种二倍体细胞，一般可从植入子宫内膜前的囊胚中分离出来。这种细胞是能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有全能性或多向性分化潜能。它们能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞。它们的基本特性是具有发育的全能性，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料、不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的胚胎干细胞(ES)细胞系和畸胎瘤干细胞(Ec)细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。成体干细胞也称为特定组织干细胞，多能干细胞继续向前分化则成为定向祖细胞(committed progenitor)，持续停留在某种组织中，被称为特定组织干细胞。它们在特定的条件下，可以对称地***为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地***成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化与器官保持生长和衰退的动态平衡。它们具有自我更新和产生本系统后续细胞的增殖细胞，如造血干细胞(hernatopoietic stem cell，HSC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cdt，MSC)、神经干细胞(neural stem cdl，NSC)、肌肉干细胞、表皮层干细胞、肝干细胞，最近我国已成功培养心肌干细胞等。传统的观点曾认为成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成与其组织来源一致的某种特定的组织细胞。然而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这一规律。在实验中分离出小鼠的肌肉干细胞，经过体外培养7 d后，将它与小量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化成为各种造血干细胞系。这种现象被称为干细胞的可分化性H]。迄今对成体干细胞研究较多的是造血干细胞和骨髓间充质干细胞；其次神经干细胞的研究也较多，以及成肌干细胞和皮肤干细胞。也许是人们渴望找到一种对于神经系统退行性疾病的有效***方法，近年来对于神经干细胞的研究颇多也颇深入，并且已经有实验表明神经干细胞的移植可以治愈帕金森病。事实上可能各种成体组织中均含有***能力的干细胞。当组织受到外伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化产生新的组织来代替，以保持机体平衡。

3 丹参与千细胞的相关实践基础

干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，才能实现组织的更新和修复。关于干细胞分化的调控机制目前还不十分清楚，大多数的观点认为与微环境的调控密切相关。干细胞通过与邻近细胞、细胞基质和细胞因子的相互作用，而影响其分化进程。丹参(Slvia miltiorhiza Bge)在临床广泛应用于心、脑、肝缺血／再灌注损伤的保护、调节免***应答、抗感染等，其在诱导干细胞增殖和分化上亦显示出巨大的潜力。其成分包括：丹参酮I、IIA、IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮、原儿茶醛、丹参素等。丹参注射液具有活血化瘀、理气止痛的功效，是临床***冠心病、心绞痛的常用中药。近年发现丹参注射液有细胞诱导作用，孟凡刚等用丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞，分别于诱导后5h，24h，72h进行免***细胞化学染色，结果显示巢蛋白(Nesfin)和βⅢ一微管-蛋白(BⅢTubulin)均呈阳性表达。杨立业等用丹参注射液诱导鼠间充质于细胞分化为神经样细胞。项鹏等用丹参注射液诱导成人骨髓间质干细胞，为进一步确定MSC是否分化为神经元，采用神经元标志物神经元特异性烯醇化酶、NF、神经干细胞标志物巢蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAD)进行鉴定。结果显示，丹参诱导5h后，多数细胞表现为NSE阳性，棕黄色染色，细胞形态多样，出现简单的双极细胞和复杂的多极细胞。NF是神经元特异性中间纤维，是神经元胞质主要结构之一，NF免***组化结果与NSE类似，部分细胞体与突触皆为阳性。诱导5h后多数细胞巢蛋白染色阳性，证明该细胞具有神经干细胞。GFAP免***组化染色显示无阳性细胞，证明本研究诱导MSC分化为神经元而非星形胶质细胞。马廉等用丹参注射液诱导人的脐血MSCs后细胞形态发生明显改变，细胞表达3类神经细胞的相关标记，少量细胞表达神经干细胞标记兔抗巢蛋白抗体，40％－50％细胞表达神经元标记鼠抗BⅢ微管蛋白和鼠抗神经微丝抗体。余氏等已经证实丹参素、丹参酮可在体外成功诱导人MSC为神经元样细胞。Nestin，NSE，NF-M染色呈强阳性(棕黄色)，而未分化的MsC为阴性(蓝色)。原清涛等用隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞行神经元标志物NSE，NF的鉴定，结果显示，用隐丹参酮诱导的细胞可以呈现NSE，NF阳性，证明已经诱导为神经元样细胞。夏文杰等用隐丹参酮诱导成人骨髓间质干细胞，结果显示隐丹参酮诱导5h后，大多数细胞Nestin阳性，7h后多数细胞NSE染色阳性部分神经元拉成网状，诱导5d后NF－H染色阳性。

4 小结与展望

源于胚胎组织的神经干细胞曾被认为是***中枢神经系统疾病的希望，但它的利用因来源的缺乏和伦理道德的约束受到明显的限制。目前使用的神经干细胞大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在着明显的种属差别，骨髓间质干细胞和脐血干细胞因其来源丰富、采集容易而备受医学研究者们青睐。神经干细胞的诱导、分化和进一步迁移的机制有待进一步研究。

细胞分化篇8

分析近年来各地的高考试题不难看出，本部分的考点相对单一，主要就是“细胞的分化、癌变、衰老和凋亡”的主要特征、形成机理及其在生产生活、医药卫生中的应用；而设置新情境，结合遗传学和选修三知识背景，要求解释生产生活中的生物学现象，如癌细胞的发生、控制、***、衰老现象的产生，细胞分化、衰老、凋亡与基因表达的关系等，则是本部分内容在命题时的一个显著特色。

【基础盘点】

考点一、细胞分化

1.概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。

2.过程：受精卵细胞组织器官系统生物体。

3.结果：形成形态、结构和功能都有很大差别的组织和器官。

4.特点：持久性、稳定性与不可逆转性。

思考：如何理解不可逆转性与脱分化？

已经分化为根的细胞，就不可能再分化为茎细胞，即为不可逆转性，其前提是要在自然条件下；而在人工条件下，借助现代科技，分化的细胞能脱分化，从而再回到分化前的状态，乃至发育为一个完整植株（脱分化是指使已分化的细胞重新回到未分化状态的过程）。

5.原因：各种细胞具有完全相同的遗传物质，即携带有本物种的全部遗传信息。

6.实质：细胞中基因的选择性表达。遗传信息的执行情况不同，但细胞内的遗传物质不变。

7.畸形分化：极少数细胞由于致癌因子的作用，引起基因突变，导致细胞内遗传物质改变，细胞连续恶性增殖，最终引起癌变。

8.细胞的全能性：高度分化的植物细胞具有全能性，如由胡萝卜的韧皮部细胞可培养得到完整植株；高度分化的动物细胞全能性受到抑制，到目前为止，从未由一个高度分化的动物细胞（生殖细胞除外）培养得到一个动物体；高度分化的动物细胞的细胞核仍具全能性，如克隆羊的培育。

考点二、细胞癌变

1.癌细胞特征：不受机体控制、形态结构发生改变、细胞表面发生变化，易分散转移。

2.癌细胞形成：致癌因子激活原癌基因，从而使正常细胞畸形分化为癌细胞。

3.癌细胞防治：远离致癌因子；手术+放疗+化疗。

思考：放疗与化疗对身体有哪些不良影响？怎样处理既可杀灭癌细胞，又可保护正常细胞？据你所掌握的知识，你认为最具发展潜力的抗癌方法可能是什么？

放疗是利用激光与射线直接杀灭癌细胞；化疗是利用化学药物阻止癌细胞DNA分子的复制，达到抑制癌细胞增殖的目的。这些过程抑制癌细胞的同时，都不可避免地杀死正常细胞，对身体的影响非常大。如果用细胞工程制备的单克隆抗体制成的生物导弹处理癌细胞（癌细胞可看成抗原），由于抗原与抗体的特异性，抗体可“直奔”抗原，而抗体上又带着抗癌药物，这样，就不会影响正常细胞。癌症是由原癌基因突变引起，所以，如能阻止原癌基因的表达，则可从根本上达到抗癌目的。

考点三、细胞衰老与凋亡

1.细胞衰老的特征。

“一大”：细胞核变大，染色质固缩、染色加深；“一小”：细胞内水分减少，萎缩变小、细胞代谢减慢；“一多”：细胞内色素逐渐增多。

2.个体衰老与细胞衰老的关系。

对单细胞生物来说，个体衰老就是细胞衰老；对多细胞生物来说，细胞的衰老不等于个体的衰老，如幼年个体中每天也有细胞的衰老；机体的衰老也不等于细胞的衰老，如老年个体每天也有新的细胞产生。当个体衰老时，组成个体的细胞往往表现为普遍衰老的现象。

3.细胞的凋亡。

（1）概念：由基因决定的细胞自动结束生命的过程。

（2）意义：对于多细胞生物体完成正常发育，维持内部环境的稳定，以及抵御外界各种因素的干扰都有非常关键的作用。

（3）细胞死亡：包括细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是细胞程序性死亡，是正常死亡；细胞坏死是细胞在外界因素作用下的死亡，是非正常的细胞死亡。

【误区剖析】

一、细胞***与细胞分化的区别

在生物体中，高度分化的细胞一般不再进行细胞***，而分化程度较低的细胞具有一定的***再生能力。只有具备***能力的细胞中才可出现染色体，否则是以染色质的形式存在；只有具有大液泡的成熟的植物细胞才可发生质壁分离。根尖分生区细胞分化程度低，细胞***能力强，而鳞片叶细胞为成熟的植物细胞。

二、细胞分化与细胞全能性的区别

三、细胞凋亡与细胞坏死的区别

神奇的干细胞

干细胞是指生物体生命进程中出现的一类未分化或未完全分化的细胞，一旦需要，它可以按照发育途径通过***而产生分化细胞。动物胚胎干细胞即为未分化的一类细胞，应在受精卵之后，卵裂与囊胚之前获得，因为原肠胚期细胞已经开始分化，成为专能干细胞。如原肠胚外胚层细胞将来发育为表皮及其附属结构、神经系统和感觉器官。现代医学上可运用胚胎干细胞增殖动物器官或组织，***人类疾病。

【典例剖析】

例1.（2013・安徽安庆师范高中模拟卷）研究发现，线粒体促凋亡蛋白Smac是细胞中一个促进细胞凋亡的关键蛋白。在正常的细胞中，Smac存在于线粒体中。当线粒体收到释放这种蛋白质的信号时，就会将它释放到线粒体外，然后Smac与凋亡抑制蛋白（IAPs）反应，促进细胞凋亡。下列有关叙述不正确的是（）

A.Smac从线粒体释放时需消耗能量

B.癌细胞中Smac从线粒体释放可能受阻

C.癌细胞的无限增殖，可能与癌细胞中IAPs过度表达有关

D.Smac与IAPs在细胞凋亡中的作用相同

【解析】Smac属于大分子物质，以类似胞吐的方式排出线粒体，因此需消耗能量。由题意可知，Smac从线粒体中释放出来后与IAPs反应才能促进细胞凋亡，所以在癌细胞中Smac从线粒体中释放可能受阻。IAPs过度表达可能与癌细胞的无限增殖有关。Smac是线粒体促凋亡蛋白，而IAPs是凋亡抑制蛋白，所以二者在细胞凋亡中作用相反。

造血干细胞幼红细胞排出细胞核网织红细胞丧失细胞器成熟红细胞凋亡

A.成熟红细胞在细胞呼吸过程中不产生二氧化碳

B.网织红细胞仍然能够合成核基因编码的蛋白质

C.造血干细胞与幼红细胞中基因的执行情况不同

D.成熟红细胞衰老后控制其凋亡的基因开始表达

3.细胞与器官衰老是一种正常的生命现象。无论是细胞或器官，在衰老过程中不会出现的是（）

A.蛋白质合成停止

B.细胞内某些酶的活性减弱，细胞内呼吸速度减慢

C.动物细胞内色素增加

D.植物体的衰老器官比幼嫩器官含钾量高

4.下***为人体某细胞所经历的生长发育各个阶段的示意***，***中①～⑦为不同的细胞，a～c表示细胞所进行的生理过程。下列叙述正确的是（）

A.与①相比，②③④的***增殖能力加强，分化能力减弱

B.⑤⑥⑦的核基因相同，细胞内的蛋白质种类和数量也相同

C.②③④的形成过程中发生了基因分离和自由组合

D.进入c过程的细胞，酶活性降低，代谢减慢继而出现凋亡小体

5.近年来，有关肿瘤细胞特定分子的靶向***研究进展迅速。研究发现，蛋白X是细胞膜上的一种受体，由原癌基因X编码，在一些肿瘤细胞中，原癌基因X过量表达会持续激活细胞内的信号传导，启动细胞DNA的复制，导致细胞异常增殖。利用动物细胞融合技术制备的单克隆抗体，可用于诊断和***原癌基因X过量表达的肿瘤。请回答下列问题：

（1）同一个体各种体细胞来源于受精卵的***与分化。正常情况下，体细胞核遗传信息相同的原因是。

（2）通过检测原癌基因X的和可判断其是否转录和翻译。检测成人多种正常组织后，发现原癌基因X只在***、呼吸道等上皮细胞中有微弱表达，这说明。

（3）根据以上信息，可推测原癌基因的主要功能是。

（4）制备该单克隆抗体时，免***动物的抗原可以是。B淋巴细胞识别抗原并与之结合，之后在适当的信号作用下增殖分化为和。

（5）用该单克隆抗体处理原癌基因X过量表达的某肿瘤细胞株，发现其增殖能力明显下降。这是因为。

6.BAK基因是近年来发现的一种促凋亡基因，癌细胞内的BAK基因表达异常。

（1）细胞凋亡是由决定的细胞自动死亡的过程，对于多细胞生物体的正常发育具有重要意义。

细胞分化篇9

摘　要：介绍人脐血干细胞的生物学特性、体外定向分化为神经元样细胞及体内移植应用现状。阐述中药诱导脐血干细胞分化为神经元样细胞的思路和方法，主要有中医理论指导及中药的选择、中药诱导方法的优化、神 经元样细胞功能的检测及在移植中的应用和主要风险。

关键词：干细胞；分化；神经元；中药

中***分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1403－04

干细胞(stem cells)是指具有增殖和分化潜能的未分 化的原始细胞，根据组织来源，干细胞可分为造血干细胞 (hematopoietic stem cells，HSCs)、问充质干细胞(Mesencby- real stem cells，MSCs)、神经干细胞(neural stem cells，NSCs) 和内皮干／祖细胞等。MSCs最早发现于骨髓中，亦称做骨 髓间充质干细胞，此外，在脐血、外周血和胎肝中均存在，这 是一类具有高度自我更新和分化能力的多能干细胞，在神 经系统疾病的***中有着良好的应用前景，需要纠正的是 很多文章将骨髓来源的骨髓间充质干细胞与骨髓间充质干 细胞混为一谈。近来大量研究表明，在一定的诱导条件下， 如运用单味中药，中药有效成分，中药复方，化学诱导剂、生 长因子、或者二者联合等，脐血中的部分细胞在体外培养或 体内移植后可分化为神经元样细胞，并可促进动物神经功 能受损恢复。现就中药诱导脐血干细胞分化为神经元样细 胞的研究思路和方法试作阐述。

1 人脐血干细胞的生物学特性

脐血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿侧血管内血 液，脐血内干／祖细胞含量丰富，占有核细胞的0.98％， 是造血、间充质、神经等多种干／祖细胞的丰富来源。实验 研究和临床移植表明，脐带血干细胞比骨髓和动员的外周 血来源的干细胞更原始，更具有自我更新、增殖分化和体外 扩增潜能。此外，脐带血中的淋巴细胞未接受外界抗原刺 激，免***原性较弱。Gang等，将来源于人的新鲜脐血单个 核细胞分离培养，发现传至第2代时即可见大量均一的成 纤维状贴壁细胞，大约86％的细胞处于GO／G1期。其与造 血有关的表面抗原CD14、CD34、CD45均为阴性，上皮细胞 标记抗原CD31、CD106亦为阴性，而与MSCs相关联的抗 原CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CDg0、AMSA、SH2 (CD105)、SH3(CD73)均为阳性。不表达HLA－DR。 RT －PER分析发现脐血MSCs表达IL－6、SCF和SDF21等细 胞因子，而不表达IL－3。研究发现人脐血单个核细胞来 源的干细胞有向神经细胞分化的潜能，在适当的诱导条 件下还可以分化成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和骨骼肌 细胞。Erices等，将体外扩增培养的人脐血MsCs输入到裸 鼠体内，不久在裸鼠骨髓、心肌、牙齿、脾内均检测到人 DNA。Lee等，将冻存了0.5－1年的47份脐血和40份骨 髓单个核细胞进行分离扩增培养，发现6代以前的脐血 MSCs增殖能力大于骨髓来源的MSCs，脐血来源MSCs早期 增殖能力强可能与脐血具有较多更原始的干细胞有关。

2　人脐血干细胞体外定向分化为神经元样细胞及移植应 用

脐带血干细胞在体外扩增迅速，在适宜的条件下其在 体外和体内均可以分化为神经元样细胞。研究者们尝试了 各种手段以期能找到效率较高的诱导方法，包括几种化学 诱导剂联合，生长因子之间配伍，化学诱导剂与生长因子联 合，单味中药，中药有效成分，中药复方，或应用接近生理状 态条件的培养基等。对于脐血MSCs体外定向分化为神经 细胞的研究(见表1)，运用不同的诱导剂组合，还是选取合 适的单一表型细胞群作为细胞来源，亦或是二者结合是否 能更有效的提高诱导分化效率，仍需要深入研究。

中枢神经系统损伤后的自身修复能力是比较有限的， 因此细胞移植替代***成为近年来神经科学领域研究的热 点之一。 2001年Chen等，研究发现，大脑中动脉栓塞大 鼠尾静脉注入经维生索A衍生物处理过的人脐血细胞后。 动物的行为能力有所改善，NSS神经系统损伤严重程度评 分(MSS评分)高于模型组，14天时脑内可见鼠抗人单克隆 抗体1281标记的阳性细胞。部分移植细胞在损伤侧大脑表 达神经元特异性标志物MAP－2，NeuN及星形胶质细胞标 志物GFAP。2002年Lu等，经静脉注射脐血干细胞来减 轻实验鼠脑创伤造成的神经功能缺损。注射1个月后，部分 脐血干细胞迁移到脑，并表达神经元核心蛋白，MAP－2。 GFAP，***后与对照组相比运动功能明显改善。2003年 Willing等，运用经颅内直接移植和静脉移植脐血干细胞 两种方法都使脑卒中动物模型的神经功能受损症状显著改 善，并发现这两种方法的效果没有显著差异。2005年王革 生等通过局部注射人脐血MSCs的方法***脊髓损伤 大鼠，发现人脐血MSCs移植到宿主损伤脊髓后可以存活、 向损伤部位迁移，并向神经元样和星形胶质细胞分化，人脐 血MSCs移植***组较磷酸盐酸缓冲液组有明显的神经功 能恢复。

3　中药诱导脐血干细胞分化为神经元样细胞的思路和方 法

3．1 中医理论指导及中药的选择虽然目前中医药诱导 干细胞分化的相关试验研究已大量开展，但是总的来说，中 医理论指导相对不足。可以将中医整体观念和辨证论治的 思想运用于中医药诱导干细胞分化为神经元样细胞的研究 之中。张进等认为中医学的“精”在内涵上与干细胞有 很大的相关性，“先天之精”与干细胞的属性基本相似，补 肾法可以促进干细胞之间的相互转换，并提出干细胞具有 先天之精属性，是先天之精的存在形式。这或许可以为我 们进一步研究中药对干细胞的诱导作用以及寻找合适的中 药提供一个思路。同时，在干细胞诱导分化为神经元样细 胞的研究方面，目前研究较多的中药有丹参、黄芩、黄芪、 当归、人参等，中药复方有参芪液(***参和黄芪)，脑溢安 (钩藤、生地黄、牡丹皮、三七、地龙等)等，但诱导机制尚 不十分明确，一般认为可能与它们的抗氧化或者刺激多种 细胞因子的表达与生成有关。在庞大的中药宝库中，以上 中药仅仅是非常小的一部分，进一步探讨其他中药和具有 更复杂作用的中药复方的诱导作用，以至筛选出诱导分化 效率高的中药或中药复方或许是我们今后的研究方向之。

3．2 中药诱导方法的优化 目前，对于脐血干细胞定向 分化为神经元样细胞的研究，虽然不同的诱导方法都起到 了一定诱导的作用，但是如何更有效的促进干细胞的增殖 与存活以提高诱导分化效率，仍需要探索。中医药作为我 国重要的医药资源，其参与脐血干细胞诱导分化为神经元 样细胞的研究显示出了良好的效果。近年来的研究主要包 括几种化学诱导剂联合，生长因子之间配伍，化学诱导剂与 生长因子联合，单味中药，中药有效成分，中药复方，或应用 各种条件的培养基等。如马廉等用丹参诱导人脐血原 代细胞和脐血来源的MSCs向神经元样细胞分化，发现可 表达神经干细胞标记Nestin，神经元标记β－微管蛋白－ Ⅲ、NF和神经胶质细胞标记GFAP，与NGF和神经节苷脂 (GM1)的诱导作用比较，细胞形态类似，表达相同的神经 细胞标记，丹参的诱导速度较快，诱导后细胞表达神经元标 记的比例较高。然而，中药复方的研究尚不够深入，中药与 化学诱导剂或者与生长因子联合诱导方面的研究尚不多， 它们的联合能否取得更好的诱导效果尚需要进一步探讨。 脐血含有多种类型的干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干 细胞等，而这些细胞有各自不同的免***表型，目前的研究多 集中在对未经纯化的干细胞群进行。在改进诱导条件的同 时，我们尚需要探索选择单一表型的细胞群作为实验对象 是否能有效地提高诱导效率。

3．3 神经元样细胞功能的检测在移植中的应用及风险 目前人们多是根据细胞形态和细胞特异性表面标志物如 Nestin，MAP－2，GFAP，β－微管蛋白－Ⅲ等来判断脐血干 细胞是否分化成了神经元样细胞，但是还没有充分的证据 表明这些分化细胞也具有相应的特定功能以及如何保证它 们在体内发挥正常的作用。神经细胞的主要功能是接受刺 激和传递信息，而其功能的实现又是通过神经冲动的方式来 实现的，神经冲动的主要表现形式是动作电位的产生(由细 胞膜内外离子的移动形成)，因此，用膜片钳技术测定神经干 细胞的离子通道，可以作为检测诱导后的神经干细胞功能的 一种方法，而相关的研究还有待进一步开展。

细胞分化篇10

【摘要】 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。

【关键词】 人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性

［Abstract］ AIM: 　To study the effect of human nuclear distribution C （hNUDC） on human megakaryocyte proliferation and differentiation from cord blood CD34+ cells in vitro. METHODS: 　 Human CD34+ cells were isolated using the Dynal CD34 Progenitor Cell Selection System from umbilical cord blood. The CD34+ cells were then cultured in serum free methylcellulose semisolid media， the morphologic aspects and number of small， medium and large CFUMK colonies were observed and scored on the day12 by microscopy analysis. The CD34+ cells were cultured in serum free liquid media， cells were removed on day 10 and formation of CD41+ in human megakaryocyte and its DNA polyploidization of nuclear were analyzed on a FACsort flowcytometer. RESULTS: 　hNUDC supported the formation of small and medium CFUMK colony in serum free semisolid media. Furthermore， hNUDC induced a remarkable increase in expression of the megakaryocyte cell surface marker CD41+ and stimulated the CD41+ DNA polyploidization more effectively than TPO. CONCLUSION: hNUDC may play an important role in megakaryocyte proliferation and differentiation.

［Keywords］hNUDC; Megacaryocyte; DNA polyploidization

［摘 要］ 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。

［关键词］人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性

血小板生成素（thrombopoietin， TPO）在体外具有调节巨核细胞增殖、 成熟和血小板形成的功能［1］。但研究发现TPO基因敲除小鼠的血小板计数虽然比正常小鼠降低了85%， 但这些小鼠并没有发生出血现象， 仍具有形态正常的巨核细胞和血小板［2］。因此推测， 很可能存在有其他因子， 与TPO一起参与巨核细胞和血小板生成的调控过程。核迁移蛋白C (nuclear distribution C， NUDC)在核迁移中起着关键的作用， NUDC与其家族成员相互作用［3］， 和微管一起参与细胞增殖［4］、 正常的造血、 神经迁移和脑发育。在增生的细胞中可以观察到NUDC强烈的免***标记， NUDC的水平在红系祖细胞中最高， 在正常人骨髓中， 早期骨髓祖细胞和红系祖细胞中， 人核迁移蛋白C （hNUDC）和mRNA有高水平表达。我们使用重组hNUDC 蛋白， 成功制备了 hNUDC单克隆抗体（mAb）， 前期实验结果表明， hNUDC 蛋白呈点状分布于人巨核细胞、 巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的细胞膜与细胞核中， 而且hNUDC可以特异地与血小板生成素受体（Myeloproliferative leukemia， Mpl）特异地结合， 对于小鼠的巨核细胞系和血小板的生成， 具有与TPO类似的生物活性［5］; 表明hNUDC很有可能是巨核细胞增殖分化调控中一个重要的因子。为进一步确证并检测hNUDC蛋白是否具有参与巨核细胞和血小板生成调控的生物活性， 我们选择正常人脐带血的造血干细胞， 在体外实验观察hNUDC对造血干细胞增殖、 分化的作用， 为脐血巨核系定向扩增的基础研究和临床应用摸索条件， 提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 材料 Dynal CD34 祖细胞分选系统购自 Dynal Biotech公司; 造血干细胞无血清培养液StemSpan H2000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液购自Amersham Biosciences公司; IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末购自Gibco公司。青霉素和链霉素、 rhTPO、 甲基纤维素均购于Sigma公司。FITC标记的抗人CD41抗体、 抗人IgG抗体购于Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 免***磁珠分离法体外分离人脐血CD34+ 细胞 每份脐血均取自广东省造血干细胞库， 样品经产妇正式同意后来自足月分娩的胎儿。 脐血平均采集量为50～80 mL， 用分离缓冲液将肝素抗凝的脐血1∶4稀释， 淋巴细胞分离液 FicollHypaque (JPrep) 水平离心机密度梯度离心， 收集界面层单个核细胞， 用相同体积的分离缓冲液悬浮混匀细胞， 500 g离心20 min; 用分离缓冲液重悬沉淀细胞， 300 g离心20 min; 取沉淀， 将细胞用冰预冷的分离缓冲液重新悬浮至4×1010～4×1011/L， 总体积至少到1 mL。按照Dynal CD34祖细胞分选系统操作说明进行脐血CD34+细胞分选， 得到纯化的CD34+细胞， 细胞计数后用流式细胞仪定量分析分离前后样品中CD34+细胞表达率， 计算纯度和回收率。

1.2.2 hNUDC蛋白的表达、 纯化以及实验分组设计 hNUDC蛋白的表达、 纯化的具体方法参考文献［5］。实验设正常对照组、 TPO 阳性对照组（终浓度为50 μg/L）和 hNUDC 蛋白不同浓度组（终浓度为 50、 100、 500 μg/L）。正常对照组为 pET28大肠杆菌表达系统空载体， 经过与表达 hNUDC 和组氨酸亲和柱纯化hNUDC相同的处理过程， 最后溶解于含1 g/L BSA 的 PBS 缓冲溶液中。

1.2.3 hNUDC对CFUMK集落形成的影响 使用9 g/L甲基纤维素无血清半固体培养， 每毫升培养体系为含5×103个CD34+细胞、 常规剂量链/青霉素以及各种浓度的rhTPO 或hNUDC蛋白， 接种在35 mm 培养皿， 每组重复3个培养皿， 每个培养皿1.5 mL。置37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中培养12 d后计算CFUMK集落数， 根据每个CFUMK集落中包括的巨核细胞数目， 将CFUMK集落分为3类。(1)CFUMK小集落（small CFUMK colony）: 包括3～20个巨核细胞; (2)CFUMK中集落（medium CFUMK colony）: 包括21～49个巨核细胞; (3)CFUMK大集落（large CFUMK colony）: 包括≥50个巨核细胞。倒置显微镜下分别计算大、 中、 小集落数。本实验重复3次。

1.2.4 hNUDC对CD41+细胞阳性表达率的影响 5 mL的无血清培养液体系中含1×104人脐带血CD34+细胞， 无血清培养基StemSpan H2000， 不同浓度的hNUDC蛋白、 TPO和相同体积的对照液体PBS。 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养， 每3～4 d半量换液1 次。培养10 d后收集细胞， 用PBS缓冲液洗3次后， 加入FITC标记的抗人CD41抗体， 同时用FITC标记的抗人IgG抗体作为阴性对照， 4℃孵育30 min， 用PBS缓冲液洗3次后， 用-20℃预冷的乙醇固定细胞， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞阳性表达率。

1.2.5 hNUDC对CD41+细胞的DNA含量和倍性的影响 细胞收集与标记方法同上， 用-20℃ 预冷的乙醇固定细胞并透膜后， PI (propidium iodide)染色， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞的DNA含量和倍性。

1.2.6 动态观察脐血CD34+细胞液体培养体系中 CD41+细胞形态和数目 倒置显微镜下， 在培养第7、 10天动态观察hNUDC与TPO对CD34+造血干细胞形态学的影响。培养第10天收集培养的细胞进行吉姆萨染色观察。

1.2.7 统计学分析 实验数据以x±s表示， 所有数据均采用SPSS/PC11.5软件分析， 统计方法为单因素方差分析LSD法， 其中CD41+细胞的表达率及其DNA含量的比较先行平方根反正弦变换（Y=arcsinx ）变换， 以P

2 结果

2.1 体外分离脐血单个核细胞和CD34+细胞 每次采集的抗凝处理后脐血在40～ 60 mL之间， 经淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞。去黏附细胞后得(0.98±0.33)×108的单个核细胞 ［(0. 7～1. 3)×108 ］， CD34 +细胞比例为(1.20±0.33)% ［(0. 8～1. 7)%］。流式细胞术测定分离前后样品中CD34+百分含量分别为3.2%和95.3%。本次实验中应用的免***磁珠分离系统一次吸附过滤的CD34+干细胞的平均纯度达到88%。从1×108个界面细胞， 平均可以分离获得1×106 CD34+干细胞。

2.2 hNUDC对CD34+细胞增殖分化为CFUMK集落的作用 对照组只有小型CFUMK集落生长， hNUDC在50 μg/L时即能促进CFUMK小集落生长， 与对照组比较差异有统计学意义(P

2.3 hNUDC对CD34+细胞分化为CD41+细胞的作用 人脐带血CD34+细胞与不同剂量组的hNUDC液体培养10 d后， 对照组CD41+细胞百分含量仅为5.43%; 50 μg/L和100 μg/L剂量的hNUDC组的CD41+细胞百分含量分别34.03%和43.56%， 明显高于对照组 (P

2.4 hNUDC对CD41+细胞DNA倍性的作用 单独经过50 μg/L和 100 μg/L hNUDC培养后细胞的DNA含量明显高于对照组 (P

2.5 hNUDC培养不同时间对CD41+细胞形态的作用 使用hNUDC蛋白单独培养人脐带血CD34+细胞后的第7天， 可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 在第10天达到最多， 大部分细胞成为成熟巨核细胞， 部分细胞还伴随有前血小板的形成。100 μg/L hNUDC剂量组的效果最好， 500 μg/L hNUDC剂量组的“巨大细胞”数量低于50 μg/L和100 μg/L hNUDC剂量组。TPO单独使用后， 在第5天就可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 并随着培养时间延长增多变大。在第10天， 收集各组细胞进行吉姆萨染色 (***1)， 可见单独经过100 μg/L hNUDC培养后， 倍性为四倍体、 八倍体的巨核细胞所占比例较多， 并且部分细胞已经进入前血小板状态。TPO组中的大部分细胞的细胞核为二倍体和四倍体， 进入前血小板状态的细胞很少见到。对照组中的细胞几乎全部为不成熟的原始干细胞， 表现为淋巴母细胞样的祖细胞形态， 细胞核多为深染的单核细胞， 部分为二倍体细胞， 但体积很小。***1 hNUDC对人CD34+细胞培养10 d后形态学的影响

3 讨论

血小板的形成极其复杂， 是多水平调控的生物学过程。包括多潜能造血干细胞向巨核细胞分化、 增殖。在巨核细胞趋于成熟时细胞核经数次***成为多倍体， 但胞体不***， 在产生血小板之前细胞呈不规则形状， 细胞伸出细长的微管， 微管的顶端连着突起的胞质， 胞质膨大后脱落即成血小板。这一过程又称前血小板(proplatelet)生成过程［6］。然而前血小板生成以及血小板释放的过程目前仅仅是假设， 几十年来一直是人们关注的课题。TPO是血小板形成中一个最重要的细胞因子［1］， 但是研究表明TPO并不是必不可少［2］， TPO受体mRNA表达量的增加并不受TPO的影响［7］。另有实验证明， TPO只作用于巨核细胞的增殖及早期成熟时期， 对巨核细胞后期成熟尤其对前血小板的生成没有明显的促进作用［8］。本实验以TPO作为阳性对照， 其结果与以往研究的报导结果一致。

为研究hNUDC促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用， 本实验在无血清甲基纤维素培养系统中加入不同浓度的hNUDC蛋白， 结果显示在hNUDC存在条件下， 生长的CFUMK集落主要为包括3～50个巨核细胞的CFUMK 中小集落。而TPO 在 50 μg/L时对大、 中、 小型CFUMK都有明显的促进生长作用， 主要产生的集落为包括≥50个巨核细胞的CFUMK大集落。一般认为， CFUMK大集落生长来源于较原始的巨核祖细胞， 而中小型的CFUMK集落生长来源于较成熟的巨核祖细胞。我们发现不同剂量组的hNUDC均能促进CFUMK小集落形成， 因此说明hNUDC能够在体外直接作用于较成熟的巨核祖细胞， 促进巨核祖细胞细胞分化增殖形成集落， 对巨核细胞具有促进增殖和分化的作用。

在无血清液体培养系统中添加hNUDC蛋白， 纯化后的CD34+细胞向着巨核系细胞分化， 并表达巨核系细胞特异的表面标志物CD41。随着CD34+ CD41+巨核系定向祖细胞向成熟的巨核系细胞分化， CD41 抗原表达明显增加， 并且细胞的DNA含量高于对照组。值得注意的是CD41+细胞的DNA倍性分布中， 二倍体、 四倍体和八倍体的比例与TPO组相近， 但16倍体和32倍体的分布则明显高于TPO组。吉姆萨染色进一步确证了hNUDC培养后的人脐带血分化后细胞形态学变化， 巨核细胞倍性增加， 细胞质更加成熟， 其效果明显优于TPO。

本实验结果提示， hNUDC对巨核细胞活性的作用可能主要集中于巨核细胞的后期成熟阶段， 尤其是巨核细胞的多倍体化与胞质成熟阶段或者血小板生成的阶段。 hNUDC很可能是促进造血干细胞向巨核系分化及诱导成熟的晚期作用的重要因子。但是对于其重要作用机制以及与其他调控因子的相互作用还需要进一步深入研究。

参考文献

［1］ Zheng C， Yang R， Han Z， et al. TPOindependent megakaryocytopoiesis［J］. Crit Rev Oncol Hematol， 2008， 65(3): 212-222.

［2］ Bruno S， Gunetti M， Gammaitoni L， et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex vivo expanded cord blood cells: Rapid and transient megakaryocyte reconstitution［J］. Haematologica， 2003， 88(4): 379-387.

［3］ Gocke CD， Osmani SA， Miller BA. The human homologue of the Aspergillus nuclear migration gene nudC is preferentially expressed in piding cells and ciliated epithelia［J］. Histochem Cell Bioll， 2000， 114(4): 293-301.

［4］ Zhang MY， Huang NN， Clawson GA， et al. Involvement of the fungal nuclear migration gene nudC human homolog in cell proliferation and mitotic spindle formation［J］. Exp Cell Res， 2002， 273(1): 73-84.

［5］ Pan RM， Yang Y， Wei MX， et al. A microtubule associated protein (hNUDC) binds to the extracellular domain of thrombopoietin receptor (Mpl)［J］. J Cell Biochem， 2005， 96(4): 741-750.

［6］ Hartwig J， Italiano Jr J. The birth of the platelet［J］. J Thromb Haemost， 2003， 1(10): 1580-1586.

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