学文网【摘要】 目的 确定大黄多糖的最佳提取条件。方法 以大黄多糖的含量为指标,以提取温度、提取时间、提取次数、料液比为因素,利用正交试验法进行试验设计,对传统水提-醇沉法提取大黄多糖的工艺进行优化研究。结果 大黄粗多糖得率最高的提取条件是:提取时间3 h,提取温度95℃,料液比130;大黄粗多糖纯度最高的条件是:提取时间1 h,提取温度95℃,料液比110;乙醇沉淀大黄多糖的最佳浓度是80%。结论 本方法实验结果可作为提取大黄多糖的工艺制定的依据。
【关键词】 大黄;多糖;水提-醇沉法;工艺研究
Studies on the process of rhubarb thick polysaccharide tradition through the traditional water solution and alcohol sedimentation
SUN Ying,JI Yue-zhi,MA AI-ming,et al.
Changchun Medical College, Changchun 130031,China
【Abstract】 Objective To determine the optimum extracting conditions of rhubarb polysaccharide.Methods By orthogonal test, take the content of rhubarb polysaccharide as standards, extraction temperature, extraction time,extraction times and ratio of material to liquid as factors, to optimize and study the process of extracting rhubarb polysaccharide through the traditional water solution and alcohol sedimentation.Results The optimum extraction condition of rhubarb thick polysaccharide has been established as follows:extraction time was 3.0 hours,extraction temperature was 95 ℃, and ratio of material to liquid 1:30.The optimum purity condition of rhubarb thick polysaccharide had been established as follows:extraction time was 1.0 h,extraction temperature was 95 ℃, and ratio of material to liquid 1:10.The best density of ethanol depositing rhubarb polysaccharide was 80%. Conclusion The experimental result of this method can be the basis of extracting rhubarb polysaccharide process.
【Key words】 Rhubarb;Polysaccharidek;Water solution and alcohol sedimentation;The process study
大黄为廖科植物掌叶大黄(RheumpalmatumL.),唐古特大黄(Rheum tanguticumMaxim. ExBalf)或药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根茎,作为传统中药在临床上应用具有悠久的历史,其功效为泻下、健胃、清热解毒等。近年来,药理实验表明大黄多糖具有改善血脂[1]、降血糖[2]、抗衰延年[3]等作用,并可以通过提高肌体免***力达到抗肿瘤的作用[4]。由于大黄多糖具有多方面的生理活性,而且毒性低,性质稳定,营养价值高等特点,因此,越来越引起人们的重视。本文为了更好的利用大黄多糖,有效的开发大黄多糖资源,仅以大黄多糖的含量为指标,采用单因素考察和正交实验法进行试验设计,对传统的水提-醇沉法提取大黄多糖的工艺进行系统研究,确定最佳提取工艺,为大规模工业生产大黄多糖提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 U1901双光束紫外可见分光光度计(北京普西通用仪器责任有限公司),电子天平BS224S(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。
1.2 药品 大黄(购于长材公司)、苯酚、葡萄糖、浓硫酸、乙醇、乙醚、丙酮等,均为分析纯试剂。
2 实验方法
2.1 大黄多糖样品液的制备 精密称取干燥至恒重的大黄
基金项目:吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目(项目编号:教科合字2008434)
作者单位:130031长春医学高等专科学校(孙莹 马爱民 纪耀华);长春工业大学(纪跃芝)
约2.5 g,加水提取,提取液浓缩后定容至100 ml,室温冷却后,精密量取5.0 ml提取液,加入5倍体积95%的乙醇,静止过夜,离心(3000 r/min),所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,得粗多糖,用蒸馏水定容至100 ml,作为大黄多糖样品溶液备用。
2.2 大黄粗多糖的制备及粗多糖样品液的配制 精密称取干燥至恒重的大黄粗粉9份(每份约200 g),按表1条件进行提取。提取液浓缩后,加入5倍体积95%的乙醇,静止过夜,离心(3000 r/min),所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,得粗多糖,计算得率。详见表2与表3。精密称取干燥至恒重的上述大黄粗多糖各0.5 g,用蒸馏水溶解,稀释至刻度,制成浓度为100 μg/ml的样品液。
2.3 多糖的测定方法 大黄粗多糖的测定以葡萄糖为标准品,采用硫酸-苯酚比色法。
2.3.1 标准样品溶液的配制 精密称取14.71 mg干燥至恒重的无水葡萄糖,置100 ml容量瓶中,用水溶解至刻度,即得。
2.3.2 标准曲线的制备[5] 分别精密吸取上述标准样品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10 ml容量瓶中,依次加入1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 ml蒸馏水,再各加1.0 ml 6%苯酚试剂,混匀,精密加入5.0 ml浓硫酸,振摇后放置5 min,置沸水浴中加热15 min,立即转入冷水浴中冷却至室温,在490 nm波长处测定吸收度,以浓度C为横坐标,吸光度A为纵坐标得标准曲线,回归方程:A=0.3818C + 0.0174,r=0.9952。
2.3.3 大黄粗多糖样品液的测定 精密吸取大黄粗多糖样品液1.0 ml,按2.2.2标准曲线的制备项下的方法操作,实验结果见表4与表5。
3 结果与分析
3.1 单因素实验结果
3.1.1 提取次数对多糖得率的影响(见***1)。
***1 提取次数对多糖得率的影响
由***1可知,提取次数2次与3、4、5次相比,样品多糖的得率相差不大,所以考虑节省时间和能源,选择2次较为合适。
3.1.2 提取时间对多糖得率的影响 由***2可知,多糖得率开始时随着提取时间的延长上升较大,当达到3 h以后,再延长时间,多糖得率则变化不大。
***2 提取时间对多糖得率的影响
***3 提取温度对多糖得率的影响
3.1.3 提取温度对多糖得率的影响 由***3可知,多糖得率开始时随着提取温度上升提高显著,当达到95℃以后,温度提高对多糖得率的影响显著性不是很明显。
3.1.4 料液比对多糖得率的影响 由***4可知,多糖得率开始时随着料液比的增大而变大,料液比为120时,多糖得率达到最高点,而后,随着料液比增大,多糖得率反而下降。
***4 料液比对多糖得率的影响
3.2 大黄粗多糖提取条件的优化 根据预实验的结果,以提取时间、提取温度和料液比为因素,作如下三因素、三水平的正交实验。选择正交表L9(34),因素-水平设计如表1。
表1
因素水平表
水平因素
A时间(h)B温度(℃)C料液比(倍)
11 75110
2 2 85120
3 3 95130
3.3 粗多糖得率正交实验结果及正交试验方式分析见表2及表3。
表2
粗多糖得率正交实验结果
试验号A浸提时间B浸提温度C料液比粗多糖得率xi∑ix2i
11119.102 082.846 4
212212.356 3152.678 1
313311.537 9133.123 1
421211.657 3135.892 6
522311.419 9130.414 1
623110.828 6117.258 6
731311.535 9133.077 0
832110.871 6118.191 7
933213.177 2173.638 6
K1KA1=32.996 2KB1=32.295 2KC1=30.802 2
K2KA2=33.905 8KB2=34.647 8KC2=37.190 8K=102.486 7W=1177.120 2
K3KA3=35.584 7KB3=35.543 7KC3=34.493 7
k1kA1=10.998 7kB1=10.765 1kC1=10.267 4
k2kA2=11.301 9kB2=11.549 3kC2=12.396 9
k3kA3=11.861 6kB3=11.847 9kC3=11.497 9
R0.862 9 1.082 8 2.129 5
UUA=1 168.207 8UB=1 168.934 9UC=1 173.915 5P=1 167.058 2
表3
正交试验方差分析表
因素离差平方和自由度平均离差平方和F值 显著性
AQA=1.149 6fA=2S2A=0.574 8FA=6.443 9不显著
BQB=1.876 7fB=2S2B=0.938 4FB=10.520 2不显著
e(误差)QC=6.857 3fC=2S2C=3.428 7FC=38.438 3显著
总和QT=10.062fT=8S2e=0.089 2
3.4 分析结论
3.4.1 极差R反映了各因素对指标的影响大小,由RA
3.4.2 均值k因素i反映了该因素水平i对指标的影响,指标值越大越好,由kA1
3.4.3 在水平α=0.05下,F0.05(2,2)=19,由于FA,FB均小于F0.05(2,2)=19,故A,B三因素对大黄粗多糖得率的影响均不显著。FC=38.4383>19,故因素C即料液比对大黄粗多糖得率的影响显著。
3.5 粗多糖中总糖含量实验测定结果及正交试验方差分析见表4及表5。
表4
粗多糖中总糖含量实验测定结果
试验序号A浸提时间B浸提温度C料液比粗多糖中总糖含量xi∑ix2i
111110.518 5110.638 8
212210.597 0112.296 4
313310.518 5110.638 8
42127.522 556.738 5
52237.008 749.121 9
62319.785 195.748 2
73136.327 740.039 8
83218.789 877.260 6
93328.632 674.519 2
K1KA1=31.634KB1=24.378 7KC1=29.093 4K=79.710 4W=727.002 2
K2KA2=24.326 3KB2=26.395 5KC2=26.762 1
K3KA3=23.750 1KB3=28.936 2KC3=23.854 9
k1kA1=10.544 7kB1=8.126 2kC1=9.697 8
k2kA2=8.108 8kB2=8.798 5kC2=8.920 7
k3kA3=7.916 7kB3=9.645 4kC3=7.951 6
R2.628 01.519 2 1.746 2
UUA=718.848 7UB=709.449 0UC=710.564 1P=705.972 0
QQA=12.876 7QB=3.477 0QC=4.592 1
表5
粗多糖中总糖含量正交试验方差分析表
因素离差平方和自由度平均离差平方和F值 显著性
AQA=12.876 7fA=2S2A=6.438 4FA=152.567 5显著
BQB=3.477 0fB=2S2B=1.738 5FA=41.196 7显著
e(误差)QC=4.592 1fC=2S2C=2.296 1FC=54.408 8显著
总和Qe=0.084 4fe=2S2e=0.042 2
3.6 分析结论
3.6.1 极差R反映了各因素对指标的影响大小,由RB
3.6.2 均值k因素i反映了该因素水平i对指标的影响,指标值越大越好,由kA3
3.6.3 在水平α=0.05下,F0.05(2,2)=19,由于FA,FB,FC均大于F0.05(2,2)=19,故三因素对大黄粗多糖得率的影响均显著。
表6
不同浓度乙醇沉淀多糖得率及总糖含量测定结果
实验号乙醇浓度(%)粗多糖得率(%)总糖含量(%)
1605.610.54464
2707.29.994608
3809.69.23504
49010.46.772992
3.7 不同浓度乙醇沉淀大黄多糖的样品的制备及总糖含量测定 称取大黄约2000 g,加水煎煮提取,提取液经浓缩后,均匀分为四等分,分别加95%乙醇至含醇60%、70%、80%、90%,静止过夜,离心(3000 r/min),所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,得粗多糖,计算得率,并按2.2.2标准曲线的制备项下的方法操作,测定粗多糖中总糖含量,结果见表6。
由表6可以看出:随着醇的浓度增大,粗多糖的收率逐渐增多,而粗多糖中总糖含量随着醇的浓度增大含量降低。80%乙醇是沉淀多糖的最佳浓度。
综上所述,大黄粗多糖得率最高的提取条件是:提取时间3 h,提取温度95℃,料液比130;而大黄粗多糖纯度最高的条件是:提取时间1 h,提取温度95℃,料液比110;乙醇沉淀大黄多糖的最佳浓度是80%。
参 考 文 献
[1] 戴英,马建民,徐颖,等.大黄粗多糖对糖尿病小鼠血清脂质等几项指标的作用.上海实验动物科学,2004,24(2):945-96.
[2] 李道中.掌叶大黄粗多糖对高血糖小鼠及正常小鼠的降糖作用.中国医院药学杂志,2007,27(3):309-400.
[3] 苗明三,苗艳艳.大黄粗多糖对衰老模型小鼠胸腺、脾脏影响的病理观察.中华实用中西医杂志,2004,17(4):146-147.
[4] 常海兰,殷凤,祝寿芬等.五台大黄粗多糖(RRP)对S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用及免***功能的影响.山西预防医学,2002,11(2):113-116.
[5] 倪受东,严德江,徐先祥.大黄粗多糖的提取及含量测定.中国药业,2007,16(13):10-11.