学文网摘要：利用GC-MS，比对植物体茎叶、根系分泌物、植物根际土壤3个醇提取物中共有成分，以确定出野菊（Chrysanthemum indicum）根系分泌物所产生的主效化感物质。在此基础上，应用外源法测定2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二乙酯在4个不同浓度下对油菜（Brassica napus L.）、生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）、莴苣（L. sativa L.）3种化感敏感植物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明，野菊根系分泌的主要化感物质有2，4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二乙酯，且2，4-二叔丁基苯酚对3种植物的抑制作用随着浓度的增加而增强；邻苯二甲酸二乙酯在0.05 mmol/L浓度下对油菜有明显的促进作用，在0.05 mmol/L和0.10 mmol/L浓度时，对生菜鲜重、莴苣和油菜胚根生长具有促进作用。
关键词：野菊（Chrysanthemum indicum）；根系分泌物；化感效应；2，4-二叔丁基苯酚；邻苯二甲酸二乙酯
中***分类号：S154.3；S312 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1061-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.06.018
Abstract： The three extract of aerial parts plants，root exudates and plant rhizosphere soil was analyzed by GC/MS，to determine the main allelochemicals produced from root exudates of Chrysanthemum indicum. By using seed germination methods in culture dish，exogenous application were used to test the allelopathic effect of 2，4-Ditertbutyl phenol and diethyl phthalate on the seed germination and seedling growth of lettuce（Lactuca sativa var. ramosa Hort.），romaine lettuce （L. sativa L.） and rape（Brassica napus L.）. The results showed that the main allelochemicals produced from root exudates of C. indicum were 2，4-Ditertbutyl phenol and diethyl phthalate. And the inhibition of 2，4-Ditertbutyl phenol to three plants increased with increasing the concentration of 2，4-Ditertbutyl phenol； Diethyl phthalate had obvious effect on promoting the rape under the concentration of 0.05 mmol/L， in the 0.05 mmol/L and 0.10 mmol/L concentration on the growth of lettuce， fresh weight of rape，lettuce and radicle had promoting effect.
Key words： Chrysanthemum indicum； root exudates； allelopathy； 2，4-Ditertbutyl phenol； diethyl phthalate
野菊（Chrysanthemum indicum L.）为菊科菊属植物。广泛分布于全国，以及周边各个国家，如苏联、朝鲜、日本等。野菊的花、叶均可入药，有抗菌抑菌、消炎及抗病毒活性等作用，具有极高的药用价值[1]。但其在生态防治方面的功效较少涉及。植物化感作用在农林生态系统中是一种普遍存在的现象，化感作用明显影响着群落的结构、演替和农作物的产量[2]，目前，化感作用在对农林生态系统中植物病害和杂草的防治方面显示出较大的应用潜力。同时，由于化感作用机理独特，有害生物不易对其产生抗药性，对植物化感物质的开发利用可减少人类对化学药品的依赖，进而从中寻找出有生物活性的化合物，为农作物病虫害防治、抑制杂草提供科学依据。
根系分泌是植物化感作用的一条重要途径，也是化感物质的一个重要来源。同一地块连续种植同种植物后，上茬植物可以通过残枝降解、根系分泌等方式将化感物质释放到土壤中。一方面，许多植物的植物体提取物具有显著的杀菌抑菌作用[3-6]，前期验也曾发现野菊茎叶醇提液对白术及其病原菌有显著的化感作用[7]，另一方面，很多植物具有通过根系分泌物抑制杂草的化感作用[8-10]，这些化感物质是天然的除草剂，若被合理利用将有可能减少化学除草剂的施用量。
考虑到野菊有较强的化感作用，而根系分泌是植物化感作用的重要途径和来源。因此，本试验利用气相色谱-谱联用仪（GC-MS）技术对野菊根系分泌物中的化感物质进行化学鉴定，以期确定出其中的主要化感物质。并选取常见化感敏感植物油菜、生菜和莴苣，研究不同化感物质的作用潜力，为进一步研究野菊根系分泌物的化感作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二乙酯购自上海阿拉丁试剂有限公司（纯度≥98%）。
油菜种子（浙油18）购自浙江省农业科学院；莴苣种子（春秋青叶尖）购自四川种都种业有限公司；生菜种子（意大利耐抽薹生菜）购自河北青县纯丰蔬菜良种繁育场。野菊采集于浙江省丽水市遂昌县。
仪器主要有5975C-7890A气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）、Milli-Q超纯水装置、索氏提取器（北京宏达化学仪器有限公司）、R201旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）、冻干机（德国CHRIST公司）。
1.2 方法
1.2.1 供试提取液的制备 野菊茎叶提取液（LOE）：取野菊茎叶部分，洗净，置烘箱内60 ℃烘干至恒重，粉碎过筛（80目），精密称定0.2 g野菊茎叶粉末于10 mL容量瓶中，甲醇定容超声30 min，得到野菊茎叶提取液。
野菊根际土壤提取液（SOE）：挖出野菊植株，选取健康根系，抖落根系2 mm处泥土并收集，60 ℃烘干，称取208.58 g干土样，使用甲醇超声提取30 min，过滤后取滤液，滤液蒸干后得干燥物，使用甲醇定容至1.5 mL，得到野菊根际土壤提取液。
野菊根系分泌物提取液（ROE）：使用浸根法[11]收集野菊根系物。采用扦插法种植野菊，待野菊长出健康根系后，挖出野菊使用去离子水冲洗干净，将野菊置于去离子水中培养，每隔24 h收集培养用水，连续收集两次得根系分泌物的水溶液。将根系分泌物水溶液-20 ℃冷冻，使用冻干机冷冻干燥后得野菊根系分泌物固体，取21.3 mg加入甲醇，超声提取后浓缩至2 mL得野菊根系分泌物提取液。
1.2.2 色谱条件 GC-MS系统色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度>99.999%），程序升温，初始温度为60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至300 ℃，总时间43 min，进样量1 μL，不设分流比。
GC-MS系统质谱条件：连接处温度280 ℃，进样口温度250 ℃，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，通过Nist 08谱库检索，采用峰面积归一法计算各成分相对含量。
1.2.3 根系分泌物的鉴定 采用Xcalibur 1.2版本软件、NIST98谱***库兼顾色谱保留时间对野菊不同部位组分定性，并以标准样品进行验证，以各类物质的峰面积进行定量。
1.2.4 含药培养基的制备 外源化感物质选择了在LOE、ROE、SOE中的共有物质2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二乙酯。先使用去离子水配制琼脂含量为0.7%的琼脂培养基，取50 mL分装于150 mL锥形瓶中。分别精密称定2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二乙酯适量，使用400 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，加入到70 ℃左右琼脂培养基中，摇匀后倒入直径为12 cm的培养皿中放置凝固，使每种物质的含药培养基终浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00 mmol/L。50 mL培养基中加入400 μL DMSO作为对照组。该浓度下DMSO对受体植物的生长无影响。
1.2.5 化感效应的测定 挑选无损坏、饱满、大小一致的种子，进行发芽预试验，发现3种植物的发芽率均达到95%以上。将受体种子使用0.2%次氯酸钠溶液消毒15 min，用去离子水冲洗干净。将受试种子整齐摆放于培养基表面，每个处理20粒，重复3次。3种受体种子，2种物质，4个浓度处理，共24个处理。
将培养皿置于恒温培养箱中避光24 ℃恒温培养，待胚芽突破种皮达到种子1/2长度时视为发芽，种子全部发芽或无种子发芽时记录种子发芽数，计算发芽率GR（Germination rate）。种子完成发芽48 h后每处理选取10株长势相近的幼苗测量其胚芽长度SL（Shoot length）、胚根长度RL（Radicle length）和芽苗鲜重SFW（Sprout fresh weight）等指标。
其中，发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%。
化感效应指数T≥C时，RI=1-C/T；T
化感综合效应指数SE=（RIGI+RIRL+RISL+RISFW）/4，即各化感效应指数的平均值。
1.2.6 数据分析 采用Excel 2007软件处理原始数据和绘***，采用SPSS 13.0（SPSS Inc，USA）软件对数据进行方差分析和差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 根系分泌物的化学组分鉴定
2.1.1 GC-MS结果 通过GC-MS分析得到LOE、ROE、SOE的总离子流***见***1，并利用峰面积归一化法确定各组分的质量分怠F渲校匹配度大于70%的成分列于表1。LOE、ROE、SOE中共鉴定出47种物质，经查阅，二十烷不是共有物。因此，共有的物质有2种：2，4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二乙酯，见表2和***2。
由表1可以看出，LOE、ROE、SOE中有机物种类丰富，含有酮、醇、酯、醛、烃、有机酸等物质。其中，邻苯二甲酸酯类[14]、2，4-二叔丁基苯酚[15]、SOE中的香兰素[16]和棕榈酸[17]、LOE中的叶绿醇[18]、亚麻酸[19]、亚油酸和硬脂酸[20]等是被报道过的化感物质。
本试验GC-MS结果中发现的化感物质大部分是植物次生代谢产物，一般相对分子量较小，结构简单，包括水溶性有机酸、脂肪族醛和酮、直链醇、不饱和内酯、多炔、长链脂肪酸、内萜、生物碱、氨基酸、苯甲酸及其衍生物等。
2.2 二种化感物质对三种植物的化感作用
2.2.1 2，4-二叔丁基苯酚θ种植物的化感效应 由***3可知，与对照相比，2，4-二叔丁基苯酚在4个浓度下对油菜均表现出显著的抑制作用，由化感综合效应指数（SE）可以看出，随着处理浓度的增加，化感作用也逐渐增强；其对生菜均表现出显著的抑制作用，化感综合效应显示，随着处理浓度的增加，化感作用逐渐增强；其对莴苣均表现出抑制作用，并达到极显著差异。并且随着处理浓度的增加，化感抑制作用逐渐增强。
2.2.2 邻苯二甲酸二乙酯对三种植物的化感效应 由***4可知，在0.05 mmol/L浓度下邻苯二甲酸二乙酯对油菜胚根、胚芽和鲜重产生了促进作用，并达到极显著差异。在0.10、0.50、1.00 mmol/L浓度下，开始表现为抑制作用，化感综合效应指数（SE）显示，随着处理浓度的增加，抑制作用逐渐增强。综合表现为低浓度促进，高浓度抑制；在0.05和0.10 mmol/L浓度下，邻苯二甲酸二乙酯对生菜鲜重有显著的促进作用，而在0.50和1.00 mmol/L浓度下，对生菜鲜重则有明显的抑制作用。化感综合效应指数显示，4个浓度下邻苯二甲酸二乙酯对生菜均表现为抑制作用；在0.05和0.10 mmol/L浓度下，莴苣芽苗生长与对照相比无明显差异，在0.50和1.00 mmol/L浓度下，邻苯二甲酸二乙酯对莴苣胚芽、胚根和芽苗鲜重表现出显著的抑制作用。由化感综合效应指数可以看出，不同浓度下，莴苣芽苗生长均受到了抑制作用，且随着浓度的增加，抑制作用逐渐增强（***4）。
3 小结与讨论
在自然条件下，植物化感物质进入环境主要有4种途径：①植物体释放挥发性物质；②雨水从植物体淋溶；③植物根系分泌；④植物残枝败叶腐解。这4种途径之间往往存在着交叉关系，其中土壤是植物产生化感作用的媒介，化感物质在土壤中通过迁移、转化、滞留等途径逐渐富集，达到活性浓度，产生自毒作用、连作障碍等化感现象。化感物质种类繁多，Rice[21]将其分为14类，以往的报道大多针对植物根际土壤化学成分、植物体浸提物、根系分泌物中的一项，鉴定出较多的疑似化感物质。而根系分泌物和残枝败叶腐解这两个途径涉及到土壤和微生物的作用，因此很难断定化感物质是植物所产生还是微生物作用的结果[22]，无法准确得出哪种物质才是该植物体本身所产生并能产生主要化感作用。本试验使用GC-MS，比对植物茎叶、根系分泌物、植物根际土壤醇提取物主要成分，确定出野菊所产生的主效的稳定的化感物质，为植物化感主效成分的鉴定提供了新的方法。
酚类物质和邻苯二甲酸酯类物质是典型化感物质。周宝利等[13]对番茄施用2，4-二叔丁基苯酚进行试验，发现低浓度处理下，2，4-二叔丁基苯酚可以促进番茄种子的萌发，增加幼苗株高和鲜重，提高番茄体内叶绿素含量和幼苗体内保护酶活性。张新慧等[15]报道对啤酒花用适量的2，4-二叔丁基苯酚处理，可以促进它的生长和光合能力。王玉洁等[23]研究了2，6-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二甲酯对茄子生长和幼苗生理特性的影响，发现两种物质在0.05～0.50 mmol/L浓度范围内对茄子株高、鲜重和根系活力均有明显的抑制作用。本试验应用外源法选择野菊根系分泌物中的2，4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二乙酯两种化感物质进行化感效应测定，明确了其对生菜鲜重、莴苣和油菜胚根生长具有化感作用。此外，两种化感物质对同一种植物的化感作用存在差异，同一化感物质对不同植物的化感作用也不尽相同，其正负效应及其强度与其浓度和受试植物种类有关。在田间，野菊根系分泌物对不同植物呈现的化感效应是其各种化感物质的综合结果。
化感作用是影响植物生长的重要因素，一些植物的生长发育好坏与化感作用的关系密切。本试验结果表明，野菊能通过化感物质的释放作用于环境中的其他植物，可为野菊的合理利用及通过化感作用开发新型除草剂等提供参考。
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