学文网[摘要]《中国药典》2010年版收载的海洋矿物药主要包括珍珠、珍珠母、蛤壳、牡蛎、瓦楞子、海螵蛸、石决明等，该类药材化学成分组成相似，主要是碳酸钙和少量的蛋白质。该文采用EDTA络合滴定法测定碳酸钙的含量；采用X射线粉末衍射，测定其碳酸钙晶型；采用紫外分光光度法对水解后样品中总氨基酸进行测定。通过系统的比较研究，寻找该类药材的差异性，结果显示，所收集的样品中牡蛎所含碳酸钙为三方晶系方解石，石决明及珍珠母晶型为三方晶系方解石与斜方晶系文石混合晶型，其余4种均为斜方晶系文石；所有样品的碳酸钙质量分数在86%～96%；海螵蛸中总氨基酸质量分数最高达1.70%、蛤壳中最低，平均为0.16%。通过对7种海洋矿物药中碳酸钙和总氨基酸的分析，建立了一种对海洋矿物药质量控制的有效方法。
[关键词]海洋矿物药；X射线衍射；碳酸钙；氨基酸；EDTA络合滴定；紫外分光光度法
《中国药典》收载的海洋来源的矿物药主要包括珍珠、珍珠母、蛤壳、牡蛎、瓦楞子、海螵蛸、石决明，珍珠具有安神定惊，明目消翳，解毒生肌，润肤祛斑的作用，其他贝壳类药材多具有平肝潜阳，软坚散结的功效[1]，药材药效明确，应用广泛，但是质量控制令人堪忧。该类药材化学组成基本相似，可分为无机成分和有机成分，其中以无机成分为主，主要由碳酸钙组成；有机成分以含量不等的蛋白质为主。文献报道，珍珠母中碳酸钙质量分数在91%～96%，珍珠、珍珠母中约含2.5%～7.0%氨基酸 [2]。瓦楞子、蛤壳中以碳酸钙为主，约含0.4%～4.7%的氨基酸 [3]。牡蛎主要成分为碳酸钙、微量元素及氨基酸 [4]。
《中国药典》2010年版只对牡蛎、石决明和蛤壳中碳酸钙建立了含量测定方法，对本文研究的其他矿物药无含量测定项[1]。根据目前研究现状，本文以该类药材主要成分为研究目标，从3个方面进行了系统的比较研究。选择EDTA络合滴定法作为碳酸钙含量测定方法；X射线粉末衍射测定碳酸钙晶型；采用紫外分光光度法，对海洋矿物类药中总氨基酸含量进行测定。通过碳酸钙和氨基酸成分分析，建立一种海洋矿物类药材的质量控制方法。
1 材料
UV-2450紫外分光光度计（日本岛津）；QT-1旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；84-1磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Bruker D8 advance X-射线衍射仪（德国Bruker公司）； EYELA SB-2000水浴锅（上海爱浪仪器有限公司）； BT 25 S 1/10 万电子天平（北京赛多利斯有限公司）；Elmasonic P180H 超声波清洗仪（荷兰必能信有限公司）；箱式电阻炉（上海跃进医疗器械厂）。
甘氨酸对照品（140624-200805）购自中国食品药品检定研究院；基准氧化锌（20045660）购自天津市化学试剂研究所；茚三酮、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、苯酚、氢氧化钾、氯化铵、乙二胺四乙酸二钠、钙黄绿素、甲基红、氯化钠、氯化钾、氨水（氢氧化铵）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；铬黑T（F1320033）购自上海晶纯生化科技股份有限公司。
所有药材均为市售品及产地收集，经中国科学院上海药物研究所果德安研究员鉴定，样品收集信息见表1。
2 方法与结果
2.1 碳酸钙测定
2.1.1 EDTA-2Na滴定液标定
取于800 ℃灼烧至恒重的基准物氧化锌0.12 g，精密称定5份，加稀盐酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0.025%甲基红乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 mL，氨-氯化铵缓冲液（pH 10.0）10 mL，再加铬黑T指示剂少量，用滴定液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白实验校正。每1 mL EDTA-2Na（0.05 mol・L-1）相当于4.069 mg的氧化锌。结果表明，EDTA-2Na溶液平均消耗量为28.99 mL，经计算本滴定液浓度为0.050 9 mol・L-1，每1 mL此滴定液相当于5.090 mg碳酸钙。
2.1.2 含量测定
参照《中国药典》2010年版，蛤壳项下碳酸钙含量测定方法，取样品细粉约0.12 g于锥形瓶中，加入3 mL稀盐酸，加热至微沸溶解，加水100 mL摇匀，加甲基红指示液一滴，滴加10%氢氧化钾至溶液显黄色，继续多加6 mL，加钙黄绿素指示剂少量，用EDTA-2Na滴定液滴定至溶液黄绿色荧光消失而显橙色。按上述方法对收集的样品进行碳酸钙含量测定，见***1。
从碳酸钙含量测定结果可以看出，珍珠、珍珠母、蛤壳、牡蛎、瓦楞子和石决明样品平均碳酸钙质量分数在91%～96%；海螵蛸中碳酸钙含量略低，88%左右，与文献报道其质量分数在87.3%～
91.7%相符[5]。海洋矿物药碳酸钙含量无明显差异，因此以碳酸钙含量为指标对于品种鉴别意义不大[6]。
2.2 碳酸钙晶型测定
取样品粉末，进行X射线粉末衍射，扫描范围3°～40°，扫描速度为0.1 s・step-1，X射线管管压为40 kV，管流40 mA记录其谱***，与碳酸钙3种同质多变体标准品***谱[7]进行对比，见***2。
碳酸钙有3种同质多象变体：斜方晶系文石（Aragonite），三方晶系方解石（Calcite），六方晶系球文石（Vaterite）。文石于2θ 26.22°，27.22°，31.14°，32.74°，33.16°，36.14°，37.26°，37.90°，38.40°，38.62°，41.20°，42.90°，45.86°，48.32°，48.46°，50.24°，51.90°，52.50°，52.92°，53.06°和53.96°有特征峰，方解石于2θ 23.10°，29.46°，31.52°，36.04°，39.48°，43.24°，47.22°，47.62°和48.62°有特征峰，球文石于2θ 20.90°，24.88°，27.02°，32.72°，40.62°，42.56°，43.80°，49.02°，49.92°，51.02°，52.224°，55.72°有特征峰。经过与3种标准谱***对比，7种海洋矿物药中，珍珠（A）、蛤壳（B）、瓦楞子（C）和海螵蛸（D）的***谱与文石碳酸钙***谱完全对应，均属于文石碳酸钙；牡蛎（E）与方解石***谱完全对应，属于方解石碳酸钙；珍珠母（F）和石决明（G）***谱中含有所有文石的特征峰，并在2θ29.53°出现方解石的特征峰，推测其碳酸钙晶型为文石和方解石混合晶型。
2.3 总氨基酸测定
2.3.1 对照品溶液制备
精密称取甘氨酸对照品5 mg于100 mL量瓶中，加蒸馏水适量溶解，定容至刻度，摇匀，即得（每1 mL含甘氨酸0.05 mg）。
2.3.2 供试品溶液的制备
取样品粉末适量，精密称定，加入2 mL乙醇，混匀，置磁力搅拌器上搅拌，缓慢加入稀盐酸溶液（过量），搅拌至反应完全，离心，弃去上清，挥干乙醇即得壳角蛋白。将得到的壳角蛋白转移至10 mL安瓿瓶中，加入5 mL 6 mol・L-1盐酸溶液，加入2～3滴苯酚，充N2，封口，置110 ℃烘箱中水解24 h后取出，放冷，转移至10 mL量瓶中，加入6 mol・L-1氢氧化钠溶液定5 mL容至刻度，用0.45 μm滤膜滤过后即得。取一定量水解样品，加入1 mL pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液混匀，加入1.5 mL 2%茚三酮溶液，于100 ℃沸水浴中反应20 min后，取出放冷，转移至10 mL量瓶，以蒸馏水洗涤试管3次后，定容至刻度，混匀，于568 nm处测定吸光度。
2.3.3 总氨基酸含量测定
2.3.3.1 检测波长选择 取供试品溶液和对照品溶液适量，照紫外-可见光分光光度法，在分光光度计上400～800 nm 扫描，供试品溶液与甘氨酸对照品溶液最大吸收波长均在568 nm，因此选择568 nm作为检测波长。
2.3.3.2 显色条件选择 采用正交试验设计对显色反应有影响的4个因素，显色剂用量（A）、显色时间（B）、显色温度（C）、冰浴时间（D）进行了考察，分别设定3个水平，设计L9（34）正交试验，以吸光度为指标，确定最佳显色条件。以珍珠样品为研究对象，试验安排及结果见表2。
由直观分析可知，对显色条件影响顺序为A>C>B>D，因此确定最佳显色条件为A3B3C3D1，即加入显色剂1.5 mL，100 ℃水浴下反应20 min，取出静置至室温。
2.3.3.3 缓冲盐pH考察 精密移取样品溶液1.0 mL于具塞试管中，分别加入pH 4.8，5.8，6.8，7.8，8.8磷酸缓冲盐溶液1 mL，每个条件下平行制备2份，按照优化好的显色方法显色，于568 nm下测定吸光度。结果表明，当缓冲盐溶液pH为4.8时，样品溶液不显色，当pH达6.8时，显蓝紫色，吸光度最大，当缓冲盐pH为8.8时，显紫红色，吸光度低。因此，选择pH 6.8的缓冲盐溶液。
2.3.3.4 标准曲线 精密移取甘氨酸对照品溶液（0.05 g・L-1）0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于具塞试管中，按显色方法显色，于568 nm进行测定。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程Y=256.64X-0.007 6，相关系数r为0.999 96，甘氨酸在0.5～4.0 mg・L-1线性关系良好。
2.3.3.5 准确度 精密移取珍珠样品溶液0.75 mL于具塞试管中，平行制备6份，分别加入甘氨酸对照品溶液（0.05 g・L-1） 0.29 mL（相当于原样品中甘氨酸含量100%的量），进行显色，于568 nm处测定吸光度值，按照公式计算回收率，回收率（%）=（实测量-原样品量）/加标量，结果显示，6份样品的回收率均在95%～105%，平均回收率为102.1%，RSD
2.3.3.6 精密度试验 重复性考察即按照优化好的供试品制备方法，平行制备6份供试品溶液进行测定，计算结果的RSD；日间精密度即平行制备3份样品进行测定，连续分析3 d，计算结果的RSD；结果显示RSD均小于2%，表明该方法精密度良好。
2.3.3.7 稳定性考察 稳定性考察即测定1份供试品溶液于0，15，30，45，60 min时测定吸光度。结果显示RSD小于2%，供试品溶液在1 h内稳定。
2.3.4 样品测定
按优化好的实验方法，对所有样品水解液中总氨基酸进行测定，见***3。从***中可以看出，海螵蛸中总氨基酸质量分数最高，可达1.7%以上。其次为珍珠、珍珠母，平均质量分数在1.50%左右。石决明总氨基酸质量分数平均在1.20%，但3批样品含量差别较大，可能受样品产地影响较大。牡蛎、蛤壳、瓦楞子中氨基酸质量分数均未达到0.4%，以蛤壳中含量最低，质量分数平均在0.16%，牡蛎和瓦楞子中含量相当，平均质量分数在0.30%左右。
3 讨论
3.1 碳酸钙分析
采用EDTA络合滴定法测定碳酸钙含量方法成熟可靠，本研究参考《中国药典》2010年版中蛤壳中碳酸钙含量测定方法，经重复性实验考察，连续测定6份样品，碳酸钙含量RSD
3.2 氨基酸分析
本文首次采用茚三酮显色法对海洋来源矿物药中总氨基酸的含量进行测定，采用正交设计和单因素试验方法对实验条件进行了考察，并对该方法进行了方法学验证。
3.3 差异性分析
本文从3方面对7种海洋矿物药进行了系统的比较分析研究，见表4，通过碳酸钙晶型测定，可以明确得鉴别出牡蛎，同时对石决明和珍珠母样品进行初步鉴别；碳酸钙含量测定结果显示，海螵蛸中碳酸钙质量分数偏低，平均值88%，这与文献报道海螵蛸中碳酸钙质量分数在87.3%～91.7%结果一致[5]，其余样品质量分数均大于92%；对于氨基酸，珍珠、珍珠母和海螵蛸中质量分数偏高，石决明中略低，而牡蛎，瓦楞子和蛤壳中质量分数很低，尤其是蛤壳，总氨基酸质量分数不足0.2%。通过以上分析可以初步的将7种海洋矿物药区分开来。
4 结论
碳酸钙为海洋矿物药的主要成分，在建立中药质量标准时常采用主要成分为指标，但通过本研究对7种海洋矿物药碳酸钙及氨基酸成分比较分析，明显看出仅以碳酸钙的含量作为评价指标，难以明确地反应出药材之间的区别及内在质量。本文通过对碳酸钙晶型、碳酸钙含量和总氨基酸含量的综合分析，为海洋矿物药的质量控制提供一定依据。
[致谢]本文得到了中国科学院上海药物所梅雪峰课题组李莎老师对X射线衍射部分提供的技术支持与指导。
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Comparative analysis of seven marine biological source of mineral drugs
SI Wei1，2， A Ru-na1， LI Shang-rong2， ZHANG Jing-xian2， WU Wan-ying2*， CUI Ya-jun1*
（1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine College of Traditional Chinese medicine， Shanghai 201203， China；
2. National Engineering Laboratory for TCM Standardization Technology， Shanghai Research Center for Modernization of
Traditional Chinese Medicine， Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）
[Abstract]The marine biological source of mineral drugs recorded in Chinese Pharmacopoeia （2010 version） mainly including pearl， nacre， clam shell， common oyster shell， ark shell， cuttle bone， and sea-ear shell are widely used in clinical. Calcium carbonate and a small amount of protein are the main components in this type of drugs. In this paper， a systematical and comparable study were carried out by determination of calcium carbonate by EDTA titration method， the crystal of calcium carbonate by X-Ray powder diffraction and the total amino acids （TAAs） of the hydrolyzed samples by ultraviolet spectrophotometry method. As a result， the crystal structure is calcite for common oyster shell， mixture of calcite and aragonite for nacre and sea-ear shell， aragonite for the other drugs. The content of calcium carbonate ranged from 86% to 96%. Cuttle bone has the highest amount of TAAs among the seven drugs which reached 1.7% while clam shell has the lowest content of 0.16% on average. In conclusion， an effective method was developed for the quality control of marine mineral drugs by comprehensive analysis of calcium carbonate and TAAs in the seven marine mineral drugs.
[Key words]marine biological source of mineral drugs； X-ray powder diffraction； calcium carbonate； total amino acids； EDTA titration method； ultraviolot spectrophotometry method
doi：10.4268/cjcmm20141722
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