学文网摘 要：利用扫描电镜技术，研究了紫花苜蓿在不同浓度（0，0.3%，0.9%，1.5%）NaCl溶液处理下气孔的适应性变化。通过对苜蓿叶片的气孔长度、气孔宽度、气孔开度、气孔密度及潜在气孔导度指数等气孔特征的观察，探讨气孔特征与耐盐性的关系。结果显示：苜蓿叶片在盐胁迫24 h后，除气孔密度变化不明显外，其他指标均随盐浓度的增加而呈下降趋势；盐胁迫24 h后气孔密度才开始增加，而其他指标则随盐浓度的不同出现不同程度的恢复现象。这说明在盐胁迫下， 苜蓿叶片通过调节气孔大小及开闭来减少水分蒸腾的同时，还通过增加气孔数目来维持光合作用，增强其耐盐性。
关键词： 紫花苜蓿；气孔；盐胁迫
中***分类号：S963.22+3.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.004
Abstract： The adaptive changes of stomata of alfalfa （Medicago sativa） under the stress of different NaCl concentration（0，0.3%，0.9% and1.5%） were studied by the technique of scanning electron microscope. The relationship between stomatal feature and salt tolerance were discussed by investigating these indices such as stomatal length， stomatal width， stomatal aperture， stomatal density， potential conductance index and so on. The main conclusions were that except for the change of stomatal density of alfalfa leaves were not very noticeable after the first day under salt stress， other indicators decreased with the increase of salt concentration and treat time. The increase in stomatal density did not begin until 24 hours later，while the other indicators recovered to different degrees under different NaCl stress. The research showed that leaves of alfalfa enhanced its salt tolerance by reducing transpiration through regulating the size and activity of stomata while improving photosynthesis through increasing the number of stomata.
Key words： alfalfa （Medicago sativa）； stomata； salt stress
土壤盐渍化已成为一个全球性的问题，据粮农组织（FAO）统计，世界各地的盐渍地已超过8.0 × 109 hm2[1]。世界范围内至少20%的耕地正遭受着不同程度的盐渍化危害，我国盐碱化土地面积也近1亿hm2[2]。随着全球环境污染加剧，人口数量增多，水资源日趋匮乏，越来越多的回收水和其他二级水源被用于灌溉，这将会使更多的土地资源受到盐害的威胁[3]。土壤盐分对植物的伤害主要是过多的盐离子打破了植物自身的离子和渗透平衡，造成离子毒害，影响植物的正常生存、生长和繁殖[4]。此外，植物体内产生和积累的活性氧（ROS）引起的氧化胁迫等带来的次生胁迫，同样对植物造成伤害[5]。因盐碱地改造成本高，见效慢，培育耐盐碱环境的作物新品种是盐碱地利用的一个有效思路。
苜蓿（Medicago sativa） 在我国的栽培历史已有2 000多年之久，在豆科牧草中的抗盐性较强，而且生长快，产量高，利用期长，营养丰富，适口性好，还能够培肥地力[6-7]。开展苜蓿等植物的耐盐机理研究对于有针对性的耐盐育种具有重要意义。植物在盐渍环境下，叶片的组织结构对其反应最为敏感[8]。盐分由根系吸收，经导管运输到地上部分。耐盐植物主要通过气孔的开闭来调节水分的蒸腾率以减少Na+随蒸腾流进入叶片组织[9]。近年来，在植物生理学、进化论和全球生态学等领域对气孔的研究都极其重视。Heherington和Woodward也指出，气孔孔隙面积虽只占叶片表面积的5%左右，但它的水分散失量却相当于一个没有角质层相似结构的70%之多[10]。本研究以紫花苜蓿为试验材料，采用扫描电镜技术，讨论了短期盐胁迫对紫花苜蓿气孔的形态结构、气孔密度及气孔大小的影响，旨在探讨叶片气孔特征与耐盐性的关系，为提高植物抗盐性提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 研究材料
供试苜蓿为公农一号紫花苜蓿种子（吉林省农业科学院草地研究所提供）。
1.2 研究方法
采用盆栽法，选取公农一号紫花苜蓿种子，用0.5%次氯酸钠消毒20 min，冲洗干净后，将其均匀播种于放好基质的小花盆里（播种基质为轻质的蛭石），之后用Hoagland培养液浇透。于室内（25±1） ℃培养30 d后，用营养液配制的0%，0.3%，0.9%，1.5%NaCl盐溶液分别进行处理。在处理后的0，1，2，3，24 h取新鲜叶片，用磷酸缓冲液（pH=7.2）洗净叶表皮后，将叶片切成合适大小，在2.5%戊二醛中固定3～4 h，再用磷酸缓冲液清洗3～4次洗去多余的戊二醛，而后经30%50%70%80%90%95%100%（两次）梯度乙醇逐级脱水，每次脱水时间15 min，最后用无水乙醇与醋酸异戊酯比例为2∶1，1∶1的溶液和纯醋酸异戊酯置换乙醇，各15 min。干燥及金属导电处理后使用扫描电子显微镜（SEM）观察并照相。
1.3 测定指标
（1） 气孔长度、宽度的测定：气孔长度是哑铃形保卫细胞长度；气孔宽度是垂直于哑铃形保卫细胞的最宽值。
（2） 气孔开度测定：气孔的孔径宽度。
（3） 气孔密度：按每平方毫米的气孔数计算气孔密度。
（4） 潜在气孔导度指数（Potential conductance index， PCI）：气孔长度的平方与气孔密度乘积[11]。
1.4 数据分析方法
试验数据用Excel 2003软件处理后，采用SPSS 13.0数据处理软件进行相关性分析与显著性分析。
2 结果与分析
经0.3%，0.9%，1.5%NaCl胁迫处理后，以扫描电镜观测苜蓿叶片气孔的变化情况，对照及0.3%NaCl处理1，2，3，24 h后气孔的形态如***1（0～4）所示，0.9%NaCl处理1，2，3，24 h后气孔的形态如***1（5～8）所示，1.5%NaCl处理1，2，3，24 h后气孔的形态如***1（9～12）所示。
2.1 盐胁迫下气孔长度、宽度的变化
不同浓度盐处理对苜蓿叶片的气孔长度和宽度影响如表1和表2所示：气孔长度和宽度随着盐胁迫程度的增加呈下降趋势，且对气孔宽度的影响更为明显。与对照相比，1.5%NaCl处理24 h后，气孔长度和宽度的下降幅度分别为25.19%和48.04%。盐处理24 h后气孔长度与宽度有所恢复，0.3%，0.9%，1.5%盐浓度的气孔长度分别恢复为原来的96.18%，89.31%，74.81%，而气孔宽度也分别恢复为原来的81.37%，66.67%，51.96%。
2.2 盐胁迫下气孔开度的变化
不同浓度盐处理对苜蓿叶片的气孔开度的影响如表3所示。由表3可知，盐胁迫可诱导苜蓿气孔开度快速减小，以避免水分的蒸腾，减少由盐分带来的水分胁迫并有效防止高渗溶液的进入。盐处理1 h 后即可观察到不同NaCl浓度均可使气孔有不同程度的关闭，处理3 h后，0.3%， 0.9%，1.5%NaCl可使气孔开度分别缩小至对照的79.31%，51.72%，31.03%，与对照有显著性差异。在处理24 h后，0.3%和0.9%NaCl可使气孔开度恢复为对照的82.14%，53.57%。而1.5%NaCl处理后，气孔开度恢复很慢，到24 h时，仅为对照的32.14%。这说明苜蓿在一定程度盐胁迫下可快速产生自身调节机制，作出适应性变化，显示出较好的抗盐性。
2.3 盐胁迫下气孔密度与潜在气孔导度指数的变化
不同浓度盐处理对苜蓿叶片的气孔密度及潜在气孔导度指数的影响如表4和表5所示。盐处理后叶片的气孔密度在3 h内几乎没有变化，24 h后可以看出略有上升趋势，1.5%NaCl处理气孔密度达到最大，为217个・mm-2，与对照有显著差异，是未经处理的1.26倍。苜蓿这种气孔密度变化的规律性可能是为了保证一定的光合气孔面积，即在调节水分平衡的同时也维持光合作用的平衡。潜在气孔导度指数的变化规律与气孔开度的变化相一致，即在前期持续下降后于24 h开始随不同盐浓度出现不同程度的恢复。
气孔特征与盐浓度及处理时间的相关性分析结果如表6所示。相关分析显示，盐浓度与气孔密度未达到显著相关，但与气孔长度、气孔宽度、气孔开度及潜在气孔导度指数呈显著负相关，即随着NaCl浓度的增加，上述指标逐渐减小；而胁迫时间与气孔长度、气孔宽度、气孔开度及潜在气孔导度指数均未达到显著相关，但与气孔密度呈显著正相关：这说明气孔长度、气孔宽度、气孔开度及潜在气孔导度指数在盐处理后可快速做出适应性反应，只是随盐浓度的不同出现幅度的变化，而气孔密度对盐的响应稍慢于上述指标，随处理时间的延长变化趋势逐渐明显。
3 结论与讨论
植物生长在复杂的自然界环境中，既接受周围环境提供的生长所需条件，同时也承受着不良因素的影响。盐分对植物生长发育有一定的抑制作用，但有些植物在盐生环境中仍能生长，这说明植物为了适应不良环境，会在生理及结构上做出适应性调整。研究表明：叶片在外界环境的影响下变异性和可塑性最大，即叶对生态条件的反映最为明显[12]。在盐胁迫后的叶片中，有3个指标是公认的衡量植物耐盐性强弱的重要生理指标：清除植物体内活性氧，维持体内代谢平衡的抗氧化酶活性，膜质过氧化产物丙二醛的含量以及有机渗透调节剂脯氨酸的积累 [13-15]。近年来影响到这些生理功能变化的结构基础逐渐成为植物抗逆研究中较为活跃的领域。气孔通过保卫细胞的运动控制着CO2的吸收以及水蒸气的散失，即影响着植物生长极其重要的光合和蒸腾作用两大重要过程[16]。Downton等[17-18]在对菠菜和葡萄的研究中发现，在盐胁迫下，植物的蒸腾速率和气孔导度均下降，以减少Na+向叶片的运输，增强自身的抗盐能力。此外，植物气孔的保卫细胞还可以通过Na+、K+的选择来维持离子平衡[19]。
为了分析盐胁迫与气孔开度的关系，本研究利用扫描电镜观察了盐胁迫下植物的叶片气孔特征的适应性变化规律，探讨了叶片气孔特征与耐盐性的关系。从观察结果看，盐处理1 h后就可从扫描电镜中观察到在不同盐浓度下气孔的缩短与变窄的现象，且对宽度的抑制作用更为明显。气孔开度也开始下降，这说明苜蓿叶片已经快速地接受到外界盐分浓度变化的信号，对自身结构做出调整以进行防御性保护，且气孔开度的下降随盐浓度的增加更加明显（r =-0.582**）。但气孔开度的下降在减少水分蒸发、维持水分平衡的同时也降低了光合作用，所以笔者在处理24 h后发现不同浓度处理组都开始出现了不同程度的恢复现象，0.3%盐处理恢复到对照的82.14%，可能是对盐分有了一定的适应性。1.5%盐处理也恢复到对照的32.14%，但开始出现畸形气孔。此外，气孔密度也于处理24 h后出现明显增加，这就在保证不损失过多水分的同时也增加了光合作用的气孔面积。
本研究仅从苜蓿耐盐性和其叶片气孔结构特征之间的相关性入手做了一些初步的分析，希望能在此基础之上利用相关技术对其耐盐机理进行更深入的研究，从而为植物的抗盐选育提供新的理论依据。
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