学文网【摘 要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。
【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因
2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。
1 绿色荧光蛋白的理论研究
1.1绿色荧光蛋白的发现
绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。
1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理
1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。
1.3绿色荧光蛋白的优点
绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。
2 绿色荧光蛋白的应用
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。
2.1作为报告基因
GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，它最大的缺点是没有放大功能，不能像酶分子一样将信号放大，所以一般需要启动子驱动GFP基因在细胞内可以足量表达。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因***介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用。
2.2作为融合标签
通过基因工程等生物学技术，GFP基因可以与外源基因融合构成嵌合基因。其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移来进行检测。
2.3其他
GFP还有其他重要应用：(1)研究基因表达的调控元件；(2)研究基因表达的时序控制与空间定位；(3)发育分子机理研究，GFP可以作为活体标记，在原位观察细胞的生长和运动。特别对于身体透明的动物观察起来更方便；(4)药物筛选，由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再分离出目的细胞，从而可用于大规模药物筛选；(5)临床检验，生产出GFP标记的抗原或抗体，就可以免***诊断；(6)转基因动物和植物的筛选标记，微生物在体内的感染途径，病毒和宿主的相互作用等，如将其插入动物、细菌或细胞的遗传信息中，随着细胞复制，可观察不断长大的癌症肿瘤、细菌的生长；(7)作为生物传感器，野生型和多种突变型GFP都有依赖pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH等等。
3 绿色荧光蛋白的优化和改造
天然的GFP的荧光强度低，表达易受温度的影响，翻译合成后的蛋白质构象折叠的效率低，而且具有多个吸收峰。为了使得GFP在应用时具有更好的特性，通过生物学方法对GFP进行了优化和改造。一般是更换生色团的氨基酸。通过基因突变将第65位的Ser点突变为Thr，这样可以增强荧光强度，而且可以优化单个吸收峰。Chalfie等科学家，还对GFP的颜色进行了改造，以扩大其用途。由GFP改造而成的变体以及GFP本身，覆盖了从蓝色到黄色的光谱范围，按其发射波长由短至长可分为蓝色（BFP）、青色（CFP)、绿色（GFP）、黄绿色（YFP）四大组，这些也都是通过对生色团的氨基酸进行点突变，例如野生型的绿色发光位点为Ser—Tyr—Gly，蓝色为Ser—His—Gly，青色为Thr—Trp—Gly，黄绿色为Gly—Tyr—Gly。
4 展望
随着分子生物学技术的发展，对GFP的理论研究进一步加深，GFP基因在启动子分析、抗病检测和细胞筛选等方面的应用也越来越广泛。目前虽然仍有一些还未解决的难题，但随着技术的进步以及科研人员的进一步探索，有理由相信GFP将在未来的生物学领域发挥越来越重要的贡献。
参考文献
[1]何琪杨，张鸿卿．薛绍白．国外医学分子生物学分册．1997，19：279—283
[2]赵华，粱婉琪，杨永华等．植物生理学通讯．2003，39：171—178
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