学文网作者：许梦秋 钟增明 龚琰 谢响明
摘要主要对几丁质酶的特性、功能及其在植物真菌病害防治中的应用进行了综合论述。在此基础上,对几丁质酶在植物病害生物防治中的应用前景进行了展望。
关键词几丁质酶;生物防治;植物病害;应用
abstractin this paper,characteristic,function and prevent plant diseases of chitinase were summarized. on this basis,the prospects of chitinase applications in biocontrol of plant disease were promised.
key wordschitinase;biocontrol;plant diseases;application
几丁质酶广泛存在于各种植物、动物及微生物细胞和组织中,参与多种生理过程[1]。几丁质酶可以有效降解几丁质,在自然界的物质循环中起着不可替代的作用。几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分,在自然界中存在数量巨大,它能在几丁质酶系作用下被分解成n-乙酰氨基葡萄单糖(nag)。在环境保护、医药、食品和基础生命科学研究中具有巨大的潜在应用价值[1]。在目前的研究中,将细菌及植物几丁质酶基因转入烟草、番茄、大豆、马铃薯、莴苣和甜菜等植物中,获得的转基因植物高效表达几丁质酶的生物活性,可显著抵抗真菌病害[2],此外将几丁质酶基因转入生防真菌中,也能显著提高生防真菌拮抗植物病害的能力[3]。
1几丁质酶性质与特点
自从1905年benecke首次分离报导了几丁质芽孢杆菌(bacillus chitinovirous)能生产几丁质酶以来,已发现了许多产几丁质酶的微生物,包括细菌、放线菌、真菌等,其中以serratiu marcescens和trichoderma harzianum的几丁质酶基因研究最多[4]。
几丁质酶可划分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和壳二糖酶。依据酶反应的最终产物将几丁质酶分为3类:一是内切几丁质酶,该类酶可随意裂解几丁质和几丁质寡聚物并释放出可溶性低分子量混合物,(glcnac)2即双乙酰几丁二糖是主要成分;二是壳二糖酶,可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物((glcnac)n),释放的最终产物主要是(glcnac)2;三是β-n-乙酰氨基己糖苷酶,同壳二糖酶一样可从非还原端裂解几丁质和几丁质寡聚物,释放n-乙酰葡糖胺单体(glcnac),它也是唯一可水解(glcnac)2的酶。
几丁质酶具有以下特点:一是多样性,不同微生物所产生的几丁质酶的类别、组分、性质不尽相同,已发现的产生胞外几丁质酶的微生物约有46属70种。不同几丁质酶的最适温度、分子量、等电点、影响酶活性的金属离子等均存在明显差异。二是诱导性,多数微生物只有在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶,也有些微生物在没有诱导物的情况下产生几丁质酶。几丁质、脱乙酞几丁质、部分水解的几丁质均可以诱导几丁质酶的产生,但几丁单糖(nag)则不能。各种诱导物对不同微生物的诱导作用亦有所不同,并且几丁质酶的诱导可被过量的可溶性代谢物所阻遏。三是分泌性,微生物所产的几丁质酶多是分泌型的,即在诱导物存在的条件下,微生物可以产生并向胞外分泌几丁质酶。该酶先在微生物的体外将几丁质分解,生成几丁单糖(nag)或寡糖,然后这些糖再被微生物吸收和利用。
几丁质酶的分子结构主要包括信号肽序列、几丁质酶催化区、几丁质结合区域、c端区域。其中几丁质酶催化区(具2个高度保守区,glu(e)和asp(d)残基高度保守)、几丁质结合区域(植物几丁质酶的几丁质结合区主要含有半胱氨酸残基,微生物几丁质酶的几丁质结合区主要含有色氨酸残基)催化区域相似的几丁质酶,它们的几丁质结合区域并不相类似,但是来源于同一菌株的酶的几丁质结合区域具有相似性,即与菌株的亲缘关系有联系[5]。
2几丁质酶在植物病害生物防治中的作用
微生物几丁质酶能够水解植物病原真菌细胞壁的成分几丁质,参与菌寄生菌对寄主真菌的侵染过程,消解寄主真菌细胞壁和杀死寄主真菌,从而获得营养。一般几丁质酶只对真菌新生细胞如芽管和菌丝顶端细胞壁具有破坏作用。大多数丝状真菌在生长过程中,菌丝顶端同时合成几丁质和β-1,3-葡聚糖,交联形成几丁质、葡聚糖或其他多糖,菌丝顶端暴露的几丁质链会被几丁质酶所水解。微生物几丁质酶可通过分解几丁质来抑制真菌菌丝生长,使顶端细胞壁变薄,继而形成球状突起,最后细胞壁降解、原生质膜破裂;几丁质酶破坏菌丝端部生长,使真菌孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长受阻,芽管和附着胞解体。
几丁质酶酶解几丁质的产物几丁寡糖,具有抗菌、抑菌性能,可以直接杀死病原真菌,还可以作为植物功能调节剂,促进植物生长发育。几丁寡糖在调节植物细胞代谢活动、提高植物防御能力等方面具有很好的作用,并且具有较强的抑菌、抗菌作用,能够抑制病原物的侵入或扩展;特别是聚合度较高的几丁寡糖,能够阻碍病原物生长。几丁寡糖可以作为植物功能调节剂,促进植物蛋白质合成,活化植物细胞,调节植物基因表达,刺激植物生长。
几丁质酶作为激发子启动植物防御反应,使植物产生更多的防御蛋白,增强植物对病原物的抗性。几丁质酶在植物中也许不是直接参与防御反应,而是通过水解侵入的真菌菌丝细胞壁产生信号因子,启动植物的防御反应,导致植物产生和积累抗病性物质。几丁寡糖可以作为激发子,在植物防御反应中充当信号因子,迅速启动植物的防御反应,诱导植物细胞对病原菌入侵作出反应,调节与抗病性有关的过氧化物酶(po)、多酚氧化酶(ppo)、超氧化物歧化酶(sod)及苯丙氨酸解氨酶(pal)等酶活性变化,产生植保素、酚类化合物等抗菌物质,使植物体内发病相关蛋白(pr蛋白,pathogenesis related protein)含量升高。几丁寡糖在植物体内可以作为激活植物几丁质酶的诱导物。
3转几丁质酶基因在植物病害生物防治中的应用
几丁质酶在真菌的生防过程中具有重要作用这一点已经被广泛证实,在植物与真菌转入几丁质酶基因被认为是提高植物与真菌拮抗病原真菌的重要策略。利用几丁质酶防治植物真菌病害的策略主要有:一是构建表达几丁质酶的工程菌,释放到土壤防治土传病害;二是构件转基因植物建立植物自身的病害防御系统。目前研究较多的是从哈茨木霉菌(t.harziarum)纯化的几丁质酶chit42(42-kda),并且对其编码基因ech42进行了克隆。随着越来越多的几丁质酶基因被克隆,几丁质酶在植保上的应用越来越多。利用几丁质酶基因培育抗病基因工程植物品种是一条有效的防病途径。国内外对此做了大量的研究,迄今为止已先后从细菌如s.marcescens、bacillus circulan等分离到几丁质酶基因,导入植物细胞,获得表达该酶的转基因植物。主要包括烟草、大豆、番茄、马铃薯等植物,使其获得了对各种病原真菌的抗性[6-8],不但可抑制病原真菌的侵袭,而且对植物线虫、昆虫和其他一些病原生物也有抗性。与转基因植物相比较,由于生防微生物具有生长周期短、易于研究、便于生产等优点,因此将几丁质酶应用于生防微生物的研究成为植病生防研究的热点。baek等对t.virens做了类似研究,发现含有双拷贝正常ech42基因的菌株防治棉花立枯病(r.solani)明显高于含有单拷贝敲除ech42基因的菌株;在木霉t.virens中,cht42基因能明显提高转化菌株的生防能力[9]。在木霉t.harizanum转几丁质酶基因(chit36)转化子与病原菌r.solani的对峙培养和抗r.solani的盆栽试验中发现转化型与野生株没有分别;而在玻璃纸的转培养试验中发现几丁质酶活性高的转化子对r.solani和fusarium oxysporum的抑菌效果比野生型好。但是通过玻璃纸的转培养方法,测定的仅是拮抗真菌的分泌物(包括细胞壁降解酶、抗菌类物质等)对于病原真菌的抑菌效果,不能对其生防效果作出全面评价[10]。由于各种生防真菌的抗菌机制的侧重点不同,需要利用相应的抗病相关基因才能达到明显的促生防效果,在真菌抗病基因工程中采用的策略也要相应调整。因此,为了更好地利用抗菌基因和转基因技术,还需要对生防真菌的作用机理作进一步的探索。
4展望
植物病原真菌是引起粮食和蔬菜发生病害,造成大量减产的重要原因,它流行广、传播快、危害大,加之没有理想的特效农药,对其中大多数至今仍无有效的防治方法。而几丁质酶对植物病原真菌的拮抗作用具有广谱性、协同增效作用及降解具有几丁质-葡聚糖复合结构的老熟细胞壁和菌核的特点,有开发应用前景。我国对几丁质酶的研究起步比较晚,关于几丁质酶在生物防治中的应用在国内的报导很少,因此加强这方面的研究,对于发展我国的农业生产具有重要的意义。相信随着现代分子生物学和基因工程技术的发展,几丁质酶将会在植物抗病方面发挥更大的作用。
5参考文献
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