学文网中国药用真菌资源丰富,是世界上使用药用真菌治病最早的国家之一,灵芝、茯苓、猪苓和雷丸等药用真菌在《神农本草经》中就已被分别列项论述,这些药物至今仍沿用不衰。药用真菌大多属于囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。中国已报道的食用菌近1000种,人工栽培种类近70种。有药用价值的真菌有300多种,而迄今真正作为药物使用的只有20~30种,是大型真菌种类中的极少部分。发酵工程是指采用工程技术手段,利用生物(主要是微生物)和有活性的离体酶的某些功能,为人类生产有用的生物产品,或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。阐述药用真菌发酵水平主要影响因素。
1药用真菌发酵主要方式
1.1药用真菌的固体发酵
将一种或多种药用真菌接种到适宜的固体培养基表面,在适宜的培养条件下进行生长繁殖的方法称为药用真菌的固体发酵。古代固体发酵是中药炮制的一种方法,中药通过发酵炮制达到提高药效、改变药性、降低毒副作用等目的。神曲、红曲、淡豆豉和百药煎等均是通过传统固体发酵而成的中药,其发酵方式属于固态发酵。发酵方式、培养基和培养条件等因素对发酵中药其质量产生重要影响。参与发酵的微生物类群有多种菌种,其中霉菌是微生物发酵的主要功能菌群。古代固体发酵属于自然发酵,发酵条件不好控制,所以中药质量的高低也存在一定的波动。在培养条件方面,中药炮制人员在长期发酵炮制中药的生产活动中积累了较为丰富的实践经验,但受当时科学技术发展水平的限制,温度和湿度等培养条件参数的控制无法准确控制,所以在中药的发酵炮制过程培养条件控制方面有较大的主观性。中药的发酵炮制在发酵菌种、培养基成分和培养条件等方面都难于客观地准确控制。因此,经传统固体发酵炮制的中药其质量的稳定性难于保证。从20世纪60年代起,筛选适合的药用真菌发酵工程菌,以富含碳、氮及矿物质等各种营养成分的农副产品作为发酵培养基,在无菌条件下将活化的单一药用真菌工程菌接种到灭菌的发酵培养基上,控制培养条件进行固体发酵。与传统固体发酵相比,现代固体发酵工艺更易于控制。
1.2药用真菌的液体发酵
通过对药用真菌发酵工艺的控制,使药用真菌在最适培养基和最适培养条件等最优条件下生长,呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放,新陈代谢旺盛,在短期内能获得大量的菌丝体和富含自身次生代谢产物的发酵液。针对药用真菌的单菌种液体发酵的研究已成为研究的热点。灵芝、冬虫夏草、云芝、竹黄、猪苓、密环菌和猴头菌等药用真菌的液体发酵都有报道。邵伟等用液体摇瓶培养探讨了茯苓液体发酵培养的最适培养条件,表明茯苓液体发酵的最适温度、摇瓶装量、摇瓶转速、培养基初始pH分别为26℃、150mL/500mL形瓶、100~150r/min、pH5.0~5.5。认为茯苓菌丝球直径一般在0.75~0.80mm时,菌丝体收率较高。
李羿,万德光等探讨了茯苓发酵罐补料液体发酵的发酵工艺。在发酵培养第48、60、72、84h时,分别以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖浓度补料效果最佳,使菌丝干重从10.74g/L增长到11.95g/L,菌体产量提高率达11.27%。同时,使发酵时间从168h缩短为120h。结果表明,单一酵母膏或蛋白胨均不适宜于灵芝的生长,而含有酵母膏0.5%和蛋白胨0.5%的复合氮源则适宜于灵芝的生长。初始葡萄糖浓度在2.0%~6.5%内,其浓度大小对灵芝的生长和产物的生物合成将产生较大影响。较高初始浓度葡萄糖将有利于灵芝胞外多糖产量的提高。当初始葡萄糖浓度为5%时,灵芝生物量可高达16.7g/L(干重),胞内多糖达1.19g/L,灵芝酸达212.3mg/L。
1.3药用真菌的多菌种混合液体发酵
药用真菌液体混合发酵中由于多种药用真菌间的协同效应使其能更有效地利用发酵培养基质中的纤维素等有机物质,解除发酵降解产物的阻遏效应。另外,依赖混合发酵中多种药用真菌丰富的酶系,还有望生成新的活性化合物。因为药用真菌液体混合发酵较单菌种液体发酵有更高的生物转化效率所以药用真菌液体混合发酵的研究正越来越受到科研人员的重视。
2药用真菌的研究
能否选好的药用真菌是提高发酵水平高低的关键因素。人们最初是从自然界中筛选所需要的药用真菌,但利用这种方法得到的药用真菌的产量一般都比较低。20世纪40年代后,利用紫外线、激光和化学诱变剂等物理化学诱变因素来处理药用真菌,使其产生突变,再筛选出符合要求的优良药用真菌。陈石良等以灰树花Gr9801为出发菌株,采用紫外线连续诱变,经分离纯化和驯化等方法,以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标,筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的灰树花菌株GrUv04,该菌株在综合PDA培养基上生长速度快,菌体丰满纯白。经驯化后在液体培养基中发酵生长力强,生物量达1.97%,发酵多糖总量达216mg/100mL,分别较出发菌株提高129.1%和75.6%。笔者将茯苓孢子悬液经紫外线照射后,通过茯苓优良菌种筛选模型筛选得到茯苓优良菌株P6。菌株P6摇瓶发酵后每升发酵液中菌丝体干重达11.92g/L,较出发菌株P0提高了7.58%。菌株P6传代培养后进行摇瓶液体发酵,实验结果表明其具有良好的遗传稳定性。
3药用真菌培养基的研究
药用真菌培养基的组成对其发酵水平高低有很大的影响。药用真菌发酵培养基从最先仅仅是提供药用真菌生长代谢所需的碳源、氮源等成分的营养培养基,逐步发展到采用不同的中药材为底物组成不同的药性培养基,或在营养培养基中添加具有中药材活性成分组成复合培养基。选择适当的中药加入药用真菌深层发酵基质,中药中的成分可对药用真菌的代谢产物起到增效的作用。
在发酵培养基中添加中药成分对药用真菌自身的生长代谢将产生重要的影响。杨海龙,吴天祥等[9]将适量的黄芪、薏苡仁、枸杞子、当归、玄参、山药、***参、等提取液添加到灵芝液体发酵培养基中,研究其对灵芝液体发酵的生物量和代谢产物胞外多糖的影响,发现其中的部分成分可促进灵芝的生长或代谢产物的产生。杨海龙等报道了以中药薏苡仁为培养基的灵芝液体发酵,研究结果表明最适培养基中薏苡仁的含量为3.59%,薏苡仁可促进灵芝的生长。原因可能是薏苡仁中脂肪酸与灵芝细胞膜结合,从而利于灵芝从培养基中摄入营养物质,促进灵芝生长。对药性培养基中中药材底物的选择及药性培养基对药用真菌发酵水平影响的研究还有待进一步深化。
4讨论
药用真菌发酵方式、发酵工程菌和发酵培养基对真菌发酵水平有很大的影响药。随着发酵方式的进一步研究,特别是药用真菌的多菌种混合液体发酵机理的深入研究,将大大提高真菌发酵的水平。上述研究工作的进展必将提高中国药用真菌的发酵水平,促进中国药用真菌在医疗保健领域发挥其更大的作用。
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