学文网摘要 选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词 破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠
中***分类号 R-332 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）18-0251-03
骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物。1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器。α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。
1.2 试验方法
1.2.1 成骨细胞分离培养。将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。将骨片剪成糊状，加入0.1%Ⅱ型胶原酶3 mL，置气浴恒温振荡器内80 r/min、37 ℃振荡消化1 h[2-3]。将头盖骨转入1.5 mL指形管中，用剪刀剪碎，直至剪成糊状（需时30 min），混匀转入50 mL离心管，封口，37 ℃气浴摇床消化60 min，80 r/min；转入离心管用PBS洗涤然后转入15 mL离心管，离心10 min，1 500 r/min。弃去上清，再反复用PBS吹打洗涤离心2次，1 000 r/min，5 min。弃去上清，沉淀即为成骨细胞（OB），加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀，再加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀静置20 s后取上悬液接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养。24 h后换液，以去除骨碎片和未贴壁的组织块、细胞。之后每隔48 h换液1次，5～7 d后生长良好。
1.2.2 骨髓细胞分离。参阅国内外文献[4-6]，分离3只3月龄大的小鼠的胫骨和股骨，取25号针头，用HBSS+10%胎牛血清将骨髓吹出。先用19号针，再用25号针将细胞吹碎得到细胞悬液。通过ficoll将红细胞移去（600 g，25 min，刹闸关闭），收取细胞后用HBSS清洗1遍，用1 mL培养基悬浮细胞保持细胞在冰上。
1.2.3 共培养操作。每一板中骨髓细胞的数量和成骨细胞的最适数量是不同的。这个最适数量要考虑小鼠的品种，例如采用的是MF1小鼠，则其破骨细胞最适的密度为：在96孔培养板中，每孔添加100 μL培养基+10 nmol/L VD3+8×103成骨细胞，为防止溶液的蒸发，边孔不添加细胞，但应填满水。在第1天，每个孔添加50 μL 2×105个新鲜分离的骨髓细胞，培养基中应该含有10 nmol/L VD3。在第6天，重新换50%新鲜的培养基，方法如下：①每孔添加150 μL含有20 nmol/L VD3的新鲜培养基；②让细胞沉降15 min；③然后每孔再移掉150 μL。在第10天的时候，进行固定和染色。重新换液需要非常谨慎，因为成骨细胞层很容易受到干扰，脱落，这会导致破骨细胞数量的减少。通常情况下，出现第1个破骨细胞一般在第6天，适量的破骨细胞的出现一般在第7～10天。
1.2.4 TRAP染色。取培养24 h的玻片，置于2.5%戊二醛中在4 ℃条件下固定10 min，用蒸馏水冲洗干净后，浸入孵育液中，在37 ℃条件下避光水浴1 h，然后置于光镜下进行细致观察[2-3]。
1.2.5 破骨细胞形态学观察。倒置显微镜观察细胞的形态、生长及贴壁情况。
1.2.6 破骨细胞的骨吸收。第二阶段培养时加入α-MEM培养，3～4 d后将象牙片取出，用PBS冲洗，置于0.25 mol/L氢氧化铵溶液中超声处理3次（5 min/次），去除附着细胞，暴露吸收陷窝。然后用梯度乙醇脱水，多聚甲醛固定，CO2临界点干燥，离子喷镀仪喷镀镀金，扫描电镜摄片[2-3]。
2 结果与分析
2.1 破骨细胞的一般生物学特性
在共培养6 d后能观察到破骨细胞，细胞生长快，2 h已基本贴壁，且紧密度较高。主要为体积较小的类圆形和不规则形，一般1～2个核，极少数有3个核，有伪足。破骨细胞难以用胰蛋白酶-EDTA进行消化，且随着细胞代数增加，消化难度加大。消化前用PBS清洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，轻轻吹打，将部分脱落的细胞移去，然后用PBS浸泡数分钟，用胰蛋白酶继续消化，如此反复可消化大部分细胞[2-3]。
2.2 破骨细胞的一般形态观察
共培养7 d后，观察到细胞贴壁生长，体积较大，增殖旺盛，呈油煎蛋形、长条形或不规则形等，有伪足和丝状突起。未染色前细胞边缘模糊，胞内的核很难与其中的杂质细胞进行区分[2-3]。培养细胞中混有大量骨髓基质细胞和红细胞，破骨细胞较少（***1）。
2.3 破骨细胞的TRAP染色结果
共培养8 d后，置于倒置显微镜下观察，TRAP阳性破骨细胞质中含有大量酒红色颗粒，细胞核阴性，细胞大小不一，有2～50个核，甚至更多，以10多个核的细胞居多。核积聚在细胞中央，TRAP染色后，破骨细胞形态清晰（***2），呈油煎蛋形，或哑铃状，很容易辨别。
2.4 破骨细胞象牙片吸收陷窝观测结果
扫描电镜观察结果显示，未加破骨细胞象牙片（***3）表面较光滑，无吸收陷窝生成。加破骨细胞象牙片（***4）观察到的吸收陷窝立体感强，陷窝底部纤维纹路清晰，骨组织被侵蚀、溶解，形成明显的吸收陷窝，陷窝呈蜂窝状、圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态，边界清楚。
3 讨论
破骨细胞是一种多核巨细胞，是唯一产生骨吸收的细胞类型。Chambers et al[7]建立的破骨细胞体外培养技术为破骨细胞体外培养奠定了基础。截至目前，已可以从多种动物四肢长骨分离成熟破骨细胞，如新生大鼠和小鼠、新生兔、鸡胚，甚至引产胎儿的长骨。破骨细胞的鉴定方法：一是细胞的形态特点有多核、伪足运动活跃[8]；二是抗酒石酸酸性磷酸酶强阳性；三是含有降钙素受体；四是与骨片共同培养，可以形成骨吸收陷窝。破骨细胞能分泌抗酒石酸酸性磷酸酶，TRAP染色呈阳性。破骨细胞可在象牙片上或骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝成圆形、椭圆形或不规则形，边界清晰[2-3]。
用小鼠共培养操作诱导获得具有特征性的破骨细胞。运用倒置相差显微镜、TRAP染色和骨吸收陷窝来鉴定培养的破骨细胞，从结果中发现，在倒置相差显微镜下未染色前破骨细胞边缘很不清晰，破骨细胞胞内的核很难与视野中的杂质细胞如红细胞和骨髓细胞相区分。100倍显微镜下破骨细胞数量比较少，而且混有大量骨髓基质细胞和红细胞。用TRAP染色鉴定，能够很清晰地找到破骨细胞，破骨细胞呈油煎蛋形、长条形或不规则形等。***片中破骨细胞有大有小，这是因为破骨细胞是通过多个核融合形成的，因此当融合的核数量多时，破骨细胞也就比较大。在培养过程中也发现破骨细胞数量偏少，这与利用兔、鸡等动物分离的破骨细胞得出了相同结论。在扫描电镜4 000倍下观察象牙片上的骨吸收陷窝，很容易发现破骨细胞的特征——骨吸收，而且发现骨吸收陷窝有大有小，有浅有深，这与培养的破骨细胞的活性以及大小有着密切的关系[9]，当然这需要进一步的研究证明。
4 参考文献
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