学文网［摘要] 目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)卡托普利 (captopril, CAP)对白蛋白引起的肾小管上皮细胞表达ACE、 ACE2及其作用产物Ang Ⅱ的影响。 方法 实验分组：对照组（未干预的人近端肾小管上皮细胞株，HK-2）；牛血清白蛋白（BSA）组(10mg•ml-1)； CAP组(10μmol•L-1)；BSA加CAP组。分别采用实时定量RT-PCR和Western Blot检测ACE、ACE2 mRNA和蛋白的表达水平；采用放射免***法(RIA)检测细胞上清液中Ang Ⅱ的浓度。 结果 实时定量RT-PCR显示，与对照组比较（相对表达量为0）， CAP组ACE mRNA表达差异无统计学意义（0.27±0.09 vs 0，P>0.05）；CAP能显著抑制BSA引起的ACE mRNA表达上调[（BSA+CAP）组∶BSA组为（0.80±0.05） vs （1.58±0.20），P
［关键词]血管紧张素转换酶；血管紧张素转换酶2；卡托普利；白蛋白；肾小管上皮细胞
[中***分类号] R-33 [文献标识码] A[文章编号] 1671-7562(2008)04-0231-05
Effect of captopril on the expression of angiotensin-converting
enzyme (ACE)/ACE2 induced by albumin in human proximal tubular cells
GAO Jun, LIU Bi-cheng, WANG Yan-li, LI Qing,ZHANG Xiao-liang
(Institute of Nephrology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009， China)
Abstract:Objective To investigate the influence of angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI), captopril on the expression of ACE, ACE2 and Angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） induced by protein overload in cultured human proximal tubular cells (HK-2). MethodsHK-2 cells were grown in DMEM containing 10% heat-inactivated FCS. After rested in serum-free medium for 24 hours, cells were then incubated separately with serum-free medium (control), bovine serum albumin (BSA, 10 mg•ml-1), captopril (10 μmol•L-1), BSA (10 mg•ml-1) plus captopril (10 μmol•L-1) for 12 h. The expression of ACE, ACE2 in HK-2 cells was detected by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) and Western blot respectively. The concentration of AngⅡ in the culture medium was detected by radioimmunoassay (RIA). Results By real-time RT-PCR, we found captopril could significantly reduce the upregulation of ACE mRNA induced by BSA (0.80±0.05 vs 1.58±0.20, P
Key words:angiotensin-converting enzyme; angiotensin-converting enzyme 2； captopril； albumin; HK-2 cell
（Modern Medical Journal,2008，36：231-235）
既往研究表明，肾脏局部肾素-血管紧张素系统 (intrarenal renin angiotensin system, RAS)的激活在慢性肾脏病 (chronic kidney disease, CKD) 的发生发展中可能起重要作用［1］。Largo 等［2］研究发现，白蛋白是导致肾脏局部RAS激活的重要因素。最近研究显示，局部血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的产生既依赖于血管紧张素转换酶 (angiotensin-converting enzyme, ACE)的激活，也与ACE2活性降低导致Ang Ⅱ降解减少有关［3］。卡托普利 (captopril, CAP)作为第一个问世的血管紧张素转换酶抑制剂 (angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)，临床及实验均证实其具有降压、降低蛋白尿从而延缓CKD进展的作用，然而它对肾脏细胞ACE/ACE2表达的影响如何文献报道不多。本研究旨在观察CAP对白蛋白引起的肾小管上皮细胞（HK-2）ACE、ACE2及Ang Ⅱ表达的影响。
1 材料与方法
1. 1 细胞培养
HK-2细胞株为人近端肾小管上皮细胞 (human proximal tubular cells, HPTCs)的永生系，保持了HPTCs基本的生物学特性，由Aled Phillips教授 (Cardiff, UK)惠赠。培养基成分包括低糖型DMEM培养基 (Gibco公司)、10%新生牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）、HEPES (Sigma公司) 2.38g•L-1、碳酸氢钠3.7g•L-1、青霉素1×105U•L-1、链霉素100mg•L-1，氢化可的松0.4μg• ml-1、转铁蛋白5μg•ml-1、胰岛素5μg•ml-1。用0.25%胰酶消化后，按照2×105ml-1细胞接种于六孔板。80%～90%融合时改为无血清DMEM培养24h，使其生长同步后进行实验。各组细胞数及培养液体积均相等。
1.2 实验分组
对照组 （未干预的人近端肾小管上皮细胞株HK-2）；牛血清白蛋白组 (bovine serum albumin, BSA) (10 mg•ml-1, 12 h)；CAP组(10 μmol•L-1预处理1 h)；BSA加CAP组。
1.3 实时定量反转录PCR (Real time RT-PCR)
按照TRIzoL RNA提取液（凯基公司，KGA1203）说明书步骤，应用氯仿-异丙醇法提取细胞总RNA。所提取的RNA溶于DEPC水处理过的双蒸水中。用紫外分光光度计测260、280 nm吸光度, 计算A260 nm /A280 nm值。取2 μl总RNA，按照反转录试剂盒 (Takala公司)说明书操作合成cDNA。引物均由Takala设计合成，见表1。
采用Real-Time PCR 扩增仪 (Lightcycle，Roche)进行PCR反应。按下列条件进行扩增：95℃预变性10s， 95℃变性10s60℃退火20s68 ℃延伸1min，循环35次。应用比较阈值法，根据数学方法推导得出，目的基因量＝2-ΔΔCt，在该公式中，Ct是荧光达到荧光阈值的循环数，ΔΔCt＝(Ct目的基因－Ct管家基因)实验组－(Ct目的基因－Ct管家基因)对照组，使用这一方法能直接得到目的基因相对于管家基因的定量［3］，比较目的基因与对照组基因比值的常用对数。
1.4 Western 印迹
按照细胞总蛋白抽提试剂盒（凯基公司，KGP2100）说明书步骤提取细胞总蛋白。冰PBS清洗1或2次，弃去PBS，按照200μl•孔-1加入蛋白裂解液（含0.1%蛋白酶抑制剂、0.5%PMSF、0.5%磷酸酶抑制剂）。冰浴条件下进行匀浆；离心（4℃，10000r•min-1）10min，去除沉淀，留取上清。采用bradford蛋白质定量试剂盒（凯基公司，KGA-801）检测蛋白含量。制备10%分离胶和5%积层胶，每孔上样量为50μg，使用BIO-RAD电泳装置，进行SDS-PAGE电泳（120V电泳30min后80V电泳90min）。100 V 恒压湿转膜1.5h，TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭1h，加一抗（羊抗ACE多克隆抗体，Santa Cruz）1∶500稀释，4℃过夜。次日TBST洗膜3次，每次5min，再加二抗（HRP标记的兔抗羊IgG）1∶3 000稀释，室温孵育1h，TBST 洗膜3次，每次5min。ECL显色(Ameresco)，胶片扫描后用Quantity One软件分析灰度值，并计算与β-actin的比值。
1.5 放射免***法检测上清液中Ang Ⅱ浓度
将细胞悬液（约1×105ml-1）接种到24孔板中培养（方法和分组同上）。每组设6个复孔，终末容积400μl•孔-1。分组干预后收集细胞上清液300 μl•孔-1，用Ang Ⅱ放射免***试剂盒（北京北方制药公司）直接测定，具体操作方法严格按说明书进行，所有标本行同一批检测。
1.6 统计学方法
实验所得数据结果均以x- ±s表示，多组间资料比较用方差分析，两组间资料比较用t检验。使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。
2结果
2. 1 总RNA纯度鉴定
A260 nm /A280 nm值在1. 8～2. 0之间，说明RNA纯度高。
2. 2CAP对BSA引起ACE mRNA表达的影响
实时定量RT-PCR显示，与对照组 （相对表达量为0）比较， BSA组ACE mRNA 表达水平显著增加 (1.58±0.20 vs 0, P
2.3 CAP对BSA引起ACE2 mRNA表达的影响
与对照组比较，BSA (10mg•ml-1)作用12h后，ACE2 mRNA 表达显著减少 (-1.35±0.13 vs 0, P
2.4 CAP对BSA引起ACE/ACE2蛋白表达的影响
Western blot 显示的ACE、ACE2和actin的蛋白表达情况，见***3。BSA作用12 h后ACE蛋白表达较对照组显著增加（1.2±0.10 vs 0.52±0.05，P0.05) （***4A）。与此同时，BSA作用12h后ACE2蛋白表达较对照组显著降低（0.35±0.09 vs 1.13±0.11，P< 0.05），CAP可显著抑制由BSA引起的ACE2 蛋白表达的缺失（0.49±0.09 vs 0.35±0.09）， CAP组与对照组比较差异无统计学意义（0.94±0.10 vs 1.13±0.11，P>0.05）（***4B）。
2.5 CAP对BSA引起Ang Ⅱ浓度的影响
RIA结果显示，与对照组比较，BSA可显著增加细胞上清液中Ang Ⅱ 的浓度[(97.25±10.4) vs (28.53±3.5) pg•ml-1，P0.05]（***5）。
与对照组比较, #P
***5 卡托普利对白蛋白引起HK-2
细胞上清液AngⅡ浓度的影响
3 讨论
ACEI是最早应用于临床的RAS阻断剂，AIPRI (The angiotensin-converting-enzyme inhibition in progressive renal insufficiency study) ［4］和REIN(Ramipril efficacy in nephropathy) ［5]研究均证实，ACEI不仅可以降低血压，而且可以减少蛋白尿，从而延缓慢性肾脏病的进展。肾功能正常或轻度损害的IgA肾病患者应用福辛普利一年可使蛋白尿减少36%，而7年肾存活率达92%［6］，在非糖尿病性微量白蛋白尿患者，福辛普利也被证实可非降压依赖性地降低微量蛋白尿［7］。最近不少研究提示，蛋白尿本身就是一种肾脏毒素，会导致肾组织局部RAS激活，参与肾小管间质纤维化的形成 ［8］。ACEI的肾保护作用是否与其通过抑制蛋白尿，进而抑制肾脏局部RAS激活是一个值得探讨的问题。
近年来越来越多的研究表明，肾脏存在***于系统RAS的局部RAS，而局部RAS的激活在CKD的进展中发挥主要作用 ［9］。Ang Ⅱ是局部RAS最主要的效应因子，通过促进细胞产生生长因子、趋化因子及炎症因子等参与纤维化的进程 ［10］。而蛋白尿的肾毒性作用有部分是通过激活RAS而产生的。蛋白负荷可促进单侧肾切除术的大鼠近端肾小管表达肾素、ACE以及血管紧张素原增加 ［2］。在转染血管紧张素原基因的小鼠，出现血压升高、白蛋白尿，同时应用培哚普利(perindopril)的小鼠上述症状明显减轻 ［11］。
早在20世纪80年代,人们就认识到ACEI不仅能阻断循环RAS、扩张全身血管而降低血压，而且可通过扩张肾小动脉使肾小球毛细血管静水压降低，而血浆流量并未减少，从而减少尿蛋白，延缓CKD的进展［12］。有研究表明，ACEI可抑制肾损伤后引起的TGF-β mRNA表达增加,并降低其转录，这提示ACEI可能通过抑制TGF-β的表达而抑制肾脏纤维化 ［13］。
最近研究发现，肾脏局部RAS主要有两条效应相反的代谢途径 ［14］。血管紧张素原在肾素作用下酶解为Ang Ⅰ，后者再被ACE降解为Ang Ⅱ。Ang Ⅱ主要通过靶细胞膜上的血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)发挥多种生物学效应，包括收缩血管、促进组织增生、炎症反应、纤维化等。另外，Ang Ⅰ还可被ACE2降解为Ang-(1-9)，后者再被ACE降解为Ang-(1-7)；而ACE2也可直接降解Ang Ⅱ, 形成Ang-(1-7)作用于mas受体，发挥与ACE-Ang Ⅱ-AT1途径相反的作用，表现为舒张血管、抑制增生、抗炎和延缓纤维化［15］。因此，现在越来越多的人认为，ACE/ACE2的激活状态可能直接决定了肾脏局部Ang Ⅱ产生的水平。
本研究在培养的肾小管上皮细胞，首先观察ACEI对于BSA刺激后HK2细胞ACE、ACE2表达的变化。结果显示，BSA在增加ACE表达的同时抑制ACE2的表达，CAP在基因和蛋白水平均能抑制BSA引起的ACE的表达上调和ACE2表达的缺失，提示CAP不仅抑制循环ACE的酶活性，而且在肾脏局部可抑制白蛋白引起的ACE和ACE2表达的失衡。本研究结果还显示，在细胞上清液中，BSA可引起Ang Ⅱ浓度显著增加，此现象可被CAP明显抑制，提示CAP抑制BSA所诱导的Ang Ⅱ产生可能与其抑制ACE表达而增加ACE2表达有关。本研究结果也进一步证实了ACEI具有双途径控制肾脏局部Ang Ⅱ水平的作用，为理解ACEI的肾保护作用机制提供了进一步的实验依据。Ferrario等[16]报道，服用ACEI的大鼠血浆Ang-(1-7)水平明显增高。有人也发现在心肌梗死的大鼠，Ang-(1-7)可减少心衰的发生[17]，提示增加ACE2的表达和活性对抑制局部RAS有重要影响。
总之，本实验发现CAP能上调ACE2 mRNA和蛋白表达，此现象是否与ACE受抑制反馈性引起ACE2的增加有关，尚待进一步研究。ACEI具有对肾小管上皮细胞ACE/ACE2双向表达的调节作用，并能通过抑制RAS激活而发挥对肾脏的保护作用。
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［收稿日期］2008-06-05
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